La regulación al alza del microARN-410 o la regulación a la baja de Wnt-11 aumenta los osteoblastos y reduce los osteoclastos para aliviar la osteonecrosis de la cabeza femoral

Materiales y métodos

Declaración de ética

El estudio se llevó a cabo con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Hospital Shijitan de Beijing, Universidad de Medicina de Capital, y siguió los principios de la Declaración de Helsinki. Los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio. Todos los experimentos con animales fueron consistentes con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue autorizado por el Comité de Ética de Experimentos con Animales del Hospital Shijitan de Beijing, Universidad Médica de Capital.

Temas de estudio

Se seleccionaron un total de 30 pacientes que son tratados en el departamento de ortopedia del Hospital Shijitan de Beijing, Capital Medical University, desde enero de 2017 hasta septiembre de 2018. Entre estos pacientes, 15 pacientes con ONFH fueron tratados en cirugía THR, la edad media de los pacientes fue 50,6 ± 4,3 años y la masa corporal fue 57,0 ± 5,6 kg con 7 hombres y 8 mujeres (grupo ONFH). Otros 15 pacientes con fractura de cuello de fémur fueron tratados con cirugía THR, la mediana de edad fue de 59,6 ± 3,3 años y la masa corporal fue de 50,0 ± 5,6 kg con 9 hombres y 6 mujeres (grupo control). No hubo una diferencia marcada en el sexo, la edad y el peso entre los dos grupos ( P > 0,05) que era comparable. Los tejidos del área necrótica subcondral se tomaron cincelando a lo largo de la línea longitudinal de la cabeza femoral y se almacenaron a -80 ° C. Cada grupo fue examinado por patología y biología molecular, respectivamente.

Tinción con hematoxilina-eosina (HE)

Las muestras se fijaron con paraformaldehído al 4% y se descalcificaron con ácido etilendiaminotetraacético al 10% y la solución de descalcificación se reemplazó una vez por semana. Se observó el color de la muestra de hueso y se midió el grado de descalcificación. Después de la descalcificación completa, la muestra se incrustó en parafina y se cortó en rodajas con un grosor de 4 μm. Las secciones horneadas se sumergieron en xileno I y xileno II durante 10 min a su vez, y las secciones desparafinadas se sumergieron en alcohol absoluto I, alcohol absoluto II, 95% de alcohol, 80% de alcohol y 70% de alcohol durante 2 min, respectivamente. Luego, las secciones se tiñeron con hematoxilina durante 3 min y se diferenciaron con alcohol ácido clorhídrico al 1% durante 2 min. A continuación, las secciones se remojaron en alcohol al 50%, 70% y 80% durante 2 min por turno y se sumergieron en eosina durante 5 s. A continuación, las secciones se sumergieron en alcohol al 95%, alcohol absoluto I y alcohol absoluto II durante 3 min y luego se sumergieron en xileno I y xileno II durante 5 min sucesivamente. Finalmente, las secciones se sellaron con goma neutra y se examinaron con un microscopio.

Tinción con fosfatasa alcalina (ALP)

Se seleccionó una sección en cada muestra y se horneó a 60 ° C durante 60 min. Las secciones de parafina se desparafinaron con xileno I y xileno II durante 15 min, respectivamente, y se sumergieron en alcohol absoluto I, alcohol absoluto II, etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 80% y etanol al 75% durante 5 min. y se limpió con agua tres veces destilada 2 min por tres veces. Las secciones se dejaron caer con algo de sustrato líquido preparado en el kit de teñido ALP (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), haciendo que el sustrato líquido cubriera completamente la muestra, luego eclosionaron a 37 ° C evitando la luz durante 15 min. La solución de tinte sobrante se descartó, y las secciones se vertieron inmediatamente con agente cromogénico A durante 5 min y se limpiaron con agua tres-destilada durante 30 s. Luego, las secciones se tiñeron con el agente cromogénico B durante 30 sy se contratiñeron con reactivo durante 30 s. La fotografía se obtuvo con un microscopio óptico de 200 × y el número de osteoblastos se calculó mediante un sistema de análisis de imágenes para microscopio (Image-Proplus 6.0).

Tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)

Se seleccionó una sección para cada muestra y se tostó a 60 ° C durante 60 min. Las secciones de parafina se desparafinaron con xileno I y xileno II durante 15 min y se sumergieron en alcohol absoluto I, alcohol absoluto II, etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 80% y etanol al 75% durante 5 min. Las secciones se fijaron con alguna solución fijadora preparada durante 30 s. Las secciones se insertaron en la rejilla de teñido y se colocaron en una caja oscura que contenía una solución de tinción TRAP recién preparada (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), La solución de tinción debe cubrirse completamente con las secciones y luego las secciones se incubaron en Recipiente de baño María a 37 ° C durante 1 h. A continuación, las secciones se tiñeron por contraste con hematoxilina durante 2 min y se secaron. Debido a que la tinción de TRAP se deterioraría con el tiempo, las secciones se examinarían directamente con el microscopio sin sellar. La imagen se obtuvo con un microscopio óptico de 200 × y el número de osteoclastos se contó mediante un sistema de análisis de imágenes para microscopio (Image-Proplus 6.0).

Tinción inmunohistoquímica

Después de la descalcificación, las secciones se incrustaron en cera de parafina y se cortaron en rodajas con un grosor de 4 µm. Las secciones se desparafinaron con xileno convencional, se deshidrataron con alcohol en gradiente, se incubaron con H ₂ al 3%. O ₂ (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, EE. UU.) A 7 ° C durante 30 min, y luego se hirvió con tampón de ácido cítrico 0,01 M a 95 ° C durante 20 min. Las secciones se bloquearon con líquido de trabajo de suero de oveja normal durante 10 min, mezclado con anticuerpo primario Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) A 4 ° C durante la noche, anticuerpo secundario (anticuerpo secundario listo para usar (PV-6000), ZSGB-Bio, Beijing, China) durante 20 min, y fluido de trabajo de streptomyces ovoalbúmina marcado con peroxidasa de rábano picante (SA / HRP, Beijing ComWin Biotech Co.Ltd, Beijing, China) durante 2 min. Las secciones se desarrollaron con diaminobencidina (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, EE. UU.), Se contratiñeron con hematoxilina (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China) y luego se sellaron. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) reemplazó al anticuerpo primario como control negativo (NC). Bajo el microscopio óptico, las células positivas se localizaron con reactivos marrones en el citoplasma, la expresión positiva fuerte fue de color amarillo pardusco oscuro, la expresión positiva débil fue de color amarillo pardusco claro y la expresión negativa no tiene coloración. La tinción de las células se observó bajo el microscopio óptico, se observaron cinco campos de alta potencia (400x) para cada sección y se contaron 100 células por campo. El valor promedio fue el resultado de la observación de cada sección. De acuerdo con la proporción y distribución de células positivas, se determinó como sigue:negativo (-), tinción unicelular, las células positivas menos del 5%; tinción débilmente positiva (+), dispersa o de masa de células pequeñas, el número de células positivas fue del 5 al 24%; tinción de células positivas (++), en escamas o en racimo, el número de células positivas fue del 25 al 50%; y tinción celular difusa fuertemente positiva (+++), el número de células positivas fue superior al 50%. Los resultados de la inmunohistoquímica fueron evaluados con puntuación doble ciego por dos personas de forma independiente.

Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR)

El ARN total se extrajo de muestras de tejido mediante el kit de extracción Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.). Se determinaron la concentración y pureza del ARN. Los cebadores fueron ideados y compuestos por Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japón) (Archivo adicional 1:Tabla S1). Luego, el ARN se transcribió de forma inversa en ADNc usando el kit PrimeScript RT (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). La solución de reacción se utilizó para PCR cuantitativa de fluorescencia, con referencia a las instrucciones de SYBR® Premix Ex Taq ^TM II kit (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). La PCR cuantitativa de fluorescencia se implementó en el sistema ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems, Massachusetts, EE. UU.). U6 fue el control de carga de miR-410, y gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fueron los parámetros internos de Wnt-11, ALP, proteína gamma-carboxiglutamato ósea (BGLAP), Collα1, fosfatasa ácida 5 resistente a tartrato (ACP5), catepsina K (CTSK), metalopeptidasa de matriz (MMP) 9, Bcl-2 y Bax. Los niveles de transcripción relativos de los genes diana fueron calculados por 2 ^{- △△ Ct} método [18].

Análisis de Western Blot

La proteína total se extrajo de los tejidos de la cabeza femoral. Se midió la concentración de proteína de cada muestra y se ajustó la carga de la muestra con agua desionizada para asegurar que el tamaño fuera consistente. Se prepararon gel de separación de dodecilsulfato de sodio y gel espaciador (10%). Después de un baño de hielo y centrifugación, la muestra se separó por electroforesis con la misma cantidad de micromuestreador y luego la proteína del gel se transfirió a la membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se selló con leche desnatada en polvo al 5% a 4 ° C durante la noche y se mezcló con el anticuerpo primario Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.), ALP (1:100, Sigma, St . Louis, MO, EE. UU.), BGLAP, Collα1 y MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.) Y Bcl-2 y Bax (1:500, Proteintech, Chicago, EE. UU.) Y eclosionaron durante la noche. Y la muestra se dejó caer con anticuerpo secundario IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, China) marcado por HRP y se incubó durante 1 h. La membrana se sumergió en una solución de reacción de quimioluminiscencia mejorada (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) Durante 1 min. Después de retirar el líquido, la muestra se cubrió con la película de conservación de alimentos. Después de desarrollado y fijado, se observó el resultado. GAPDH fue el parámetro interno, y la imagen de la huella de proteína fue analizada por el software ImageJ2x.

Establecimiento de modelos de ratas de ONFH

Se seleccionaron noventa ratas macho Sprague-Dawley (SD) (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, China), que pesaban entre 300 gy 350 g. El ambiente se fijó entre 18 y 25 ° C y la humedad entre el 45 y el 70%. Las ratas se criaron en jaulas separadas evitando el ruido. Después de 1 semana de alimentación adaptativa, se llevaron a cabo experimentos de seguimiento.

El modelo fue establecido por ONFH traumático. Los métodos de modelado fueron los siguientes:se anestesiaron ratas SD con la cavidad abdominal, seguido de la depilación y la preparación de la piel. Se cortó la piel de rata, se separaron los tejidos y se cortó el ligamento redondo después de la exposición de la cabeza femoral. Se raspó el periostio del cuello femoral de las ratas y se destruyó el suministro de sangre alrededor de la cabeza femoral. La cápsula articular, el músculo y la piel se suturaron capa por capa y se esterilizaron nuevamente.

Agrupación de animales

Se distribuyeron setenta ratas SD modeladas con éxito en siete grupos, con 10 ratas en cada grupo:grupo ONFH; grupo agomir-NC (0,5 ml de miR-410 agonista NC (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) se inyectó alrededor de la articulación de la cadera 1 semana después del establecimiento exitoso de ONFH), grupo agomir-miR-410 (Se inyectaron 0,5 ml de agonista de miR-410 (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) alrededor de la articulación de la cadera 1 semana después del establecimiento exitoso de ONFH), grupo siRNA-NC (NC de 0,4 ml de Wnt silenciado -11 vector (que contiene 1 × 10 ⁹ unidad formadora de placa (PFU) (Shanghai GenePharma Co.Ltd., Shanghai, China) se inyectó alrededor de la articulación de la cadera 1 semana después del establecimiento exitoso de ONFH), grupo Wnt-11-siRNA (0,4 ml de vector Wnt-11 silenciado (que contiene 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co.Ltd., Shanghai, China) se inyectó alrededor de la articulación de la cadera 1 semana después del establecimiento exitoso de ONFH), grupo agomir-miR-410 + sobreexpresado (OE) -NC (0.5 mL de agonista de miR-410 y NC de 0,4 ml de vector Wnt-11 regulado al alza (que contiene 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co.Ltd., Shanghai, China) se inyectó alrededor de la articulación de la cadera 1 semana después del establecimiento exitoso de ONFH), y el grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0.5 mL de agonista de miR-410 y 0,4 ml de vector Wnt-11 regulado al alza (que contiene 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) se inyectó alrededor de la articulación de la cadera 1 semana después del establecimiento exitoso de ONFH). Mientras tanto, el grupo normal (solo se inyectó solución salina en la cavidad abdominal, 10 ratas) se estableció como control. Después de 4 semanas de ONFH, se llevaron a cabo micro-CT, análisis osteonométrico, observación de rayos X, densitometría ósea y determinación del nivel de calcio y fósforo en suero.

Prueba de micro-TC y análisis osteonométrico

La cabeza femoral derecha de las ratas se colocó en la máquina micro-CT (General Electric (GE) Company, Massachusetts, EE. UU.), Y también se escaneó el maniquí estándar equipado al azar. Los parámetros de escaneo son los siguientes:resolución 27 μm × 27 μm × 27 μm, corriente de escaneo 450 mA, voltaje de escaneo 80 kV y tiempo de escaneo único 88 min. Se observó en detalle la microestructura de la cabeza femoral de la rata. Después de la calibración a la luz de la especificación, se seleccionaron al azar tres regiones cuboides de interés (ROI) de diferentes grupos de ratas para la reconstrucción (0,5 × 0,5 × 0,5 cm ³ ). El procesamiento de la imagen se realizó con el software de la máquina GE Microview, y el ROI se reconstruyó y analizó mediante metrología ósea. Se seleccionaron los parámetros de densidad mineral ósea (DMO) y fracción de volumen óseo (BV / TV).

Observación de rayos X, determinación de la DMO y determinación del nivel de calcio y fósforo en suero

Cuatro semanas después de la operación, las ratas de cada grupo se inyectaron a través del abdomen con hidrato de cloral al 10%. Después de la anestesia, las ratas se colocaron en posición supina y las extremidades se fijaron y luego se examinaron mediante fotografía de rayos X. Se observó el cambio de la forma y densidad de la cabeza femoral. La densidad ósea de la columna vertebral femoral izquierda, la cabeza femoral y la columna vertebral se evaluó mediante un instrumento de medición de la densidad ósea de rayos X de energía dual. A las 4 semanas después de la operación, las ratas de cada grupo se mantuvieron en ayunas durante 12 h antes de la extracción de sangre. Las muestras de sangre (5 ml) se recogieron a través del corazón por la mañana y se colocaron en un tubo de coagulación limpio al vacío. El suero se separó mediante centrifugación a 3000 r / min durante 15 min. Los niveles séricos de calcio y fósforo se midieron con un analizador bioquímico automático.

Observación microscópica electrónica

La masa de tejido óseo de rata se fijó con glutaraldehído al 3,5%, se descalcificó con una solución de ácido clorhídrico al 5% y ácido ósmico al 1%, luego se deshidrató con acetona en gradiente, se tiñó dos veces con acetato de uranio y ácido cítrico y, por último, se incrustó con Epon-61. Una vez preparada la sección semifina, la sección ultrafina se observó mediante un microscopio electrónico de transmisión.

Ensayo de etiquetado final de dUTP-biotina Nick (TUNEL) mediado por TdT

Las secciones incluidas en parafina se trataron previamente con desparafinado y deshidratación convencionales. Las secciones se incubaron con pepsina (solución de ácido clorhídrico al 0,25 ~ 0,5%) durante 25 min, luego se gotearon con 50 μL de solución mezclada de reacción TUNEL y se incubaron en una caja húmeda durante 60 min, y se vertieron con 50 μL de agente peroxidasa y se incubaron en un caja húmeda durante 30 min. Las secciones se desarrollaron con reactivo DAB, si las secciones estaban coloreadas y se observaron al microscopio. Las secciones se agregaron con agua para detener el desarrollo y se tiñeron con hematoxilina durante 2 min. Luego, las secciones se sumergieron en etanol I-II al 95%, etanol absoluto I-II durante 3-5 min, respectivamente, xileno I-II durante 3-5 min y se sellaron con goma neutra. Los resultados se analizaron al microscopio óptico.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Después de anestesiar a las ratas, se extrajo sangre de la arteria del muslo y se recogieron las muestras de suero por centrifugación después de 1 h de reposo. Sobre la base de la especificación del kit ELISA (Shanghai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), se agregaron siete pocillos estándar con varios estándares de concentración (100 μL), a su vez, los pocillos en blanco se agregaron con 100 μL solución de dilución estándar, y los pocillos restantes se adjuntaron con 100 μL de muestra para analizar. La placa de enzima se revistió con una película y se colocó durante 1 h, y luego se desechó el líquido. Se añadió una solución (100 μL) a todos los pocillos y se cubrió la placa de enzima con la película durante 1 h. Después del lavado, se agregaron 100 μL de solución B en todos los pocillos y la placa de enzima se cubrió con la película durante 30 min. Luego se agregó la solución de sustrato de tetrametilbencidina (90 μL), la placa de enzima se cubrió con la película durante 10-20 min y se agregaron 50 μL de solución de terminación a todos los pocillos. El valor de densidad óptica (DO) de cada pocillo se midió con un lector de microplacas y se enumeró la concentración real de la muestra.

Ensayo génico indicador de luciferasa dual

Los sitios de unión y la relación objetivo de miR-410 y la región no traducida (UTR) 3 'de Wnt-11 se pronosticaron utilizando software de bioinformática http://www.targetscan.org. La secuencia de la región promotora 3'UTR de Wnt-11 que contiene el sitio de unión de miR-410 se compuso e insertó en pMIR-REPORT ^TM Plásmido de vector de luciferasa (Ambion, Company, Austin, TX, EE. UU.) Para formular el plásmido de tipo salvaje Wnt-11 3'UTR (Wnt-11-WT). Y el plásmido mutante Wnt-11 3'UTR (Wnt-11-MUT) se construyó sobre la base del plásmido y el sitio de unión de la mutación. Siga los pasos del kit de extracción de plásmido comprado (Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.) Y las células logarítmicas se sembraron en las placas de 96 pocillos. Cuando la confluencia celular fue de aproximadamente el 70%, se adoptó Lipofectamine 2000 para la transfección. Wnt-11-WT y Wnt-11-MUT se mezclaron con imitadores NC y miR-410 (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China), respectivamente, y luego se cotransfectaron a células T 293. Las células se acumularon y lisaron después de transfectarlas 48 h, y la actividad de luciferasa se evaluó mediante el kit de detección de luciferasa (BioVision, San Francisco, CA, EE. UU.) Y el luminómetro Glomax 20/20 (Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.).

Análisis estadístico

Todos los datos fueron procesados ​​por el software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EE. UU.). Los datos de medición se transmitieron por media ± desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparaciones de grupos múltiples y el t prueba para comparaciones de dos grupos y diferencia mínima significativa de Fisher t La prueba (LSD-t) se utilizó después de ANOVA. P valor <0.05 fue indicativo de una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Cambios patológicos en los tejidos ONFH de muestras clínicas

Se adoptó la tinción HE para observar los cambios patológicos de la cabeza femoral en el grupo de fractura de cuello de fémur (grupo control) y el grupo ONFH; los resultados informaron que en el grupo de control, la densidad trabecular ósea estaba bien distribuida y la estructura era integridad. Mientras que en el grupo ONFH, había muchas lagunas óseas vacías en el cerebelo óseo, con células óseas disminuidas y trabéculas óseas que cambiaban continuamente. Además, había muchas otras hiperplasia tisular alrededor del cerebelo óseo (Fig. 1a).

Cambios patológicos en tejidos ONFH de muestras clínicas. un Resultados de la tinción HE en cada grupo (200 ×). b Resultados de la tinción de TRAP y recuento de células positivas para TRAP en cada grupo (200 ×). c Los resultados de la tinción de ALP y el recuento de células positivas para ALP en cada grupo (400 ×). * P <0.05 frente al grupo de control

La tinción de TRAP reveló que TRAP se encontraba principalmente en osteoclastos y a menudo se usaba para identificar osteoclastos maduros en amaranto. En comparación con el grupo de control, el número de osteoclastos positivos para TRAP en el grupo ONFH ascendió, la morfología de los osteoclastos fue diversa y las células eran grandes con apariencia multinuclear. Se observaron defectos óseos evidentes en el cerebelo óseo adyacente a los osteoclastos, que mostraron reabsorción ósea (Fig. 1b).

El resultado de la tinción de ALP presentó que ALP era una enzima marcadora para la diferenciación y maduración de los osteoblastos, que participaba en la regulación de la calcificación de la maduración de la matriz ósea. Por lo tanto, la expresión de ALP se usó comúnmente para identificar osteoblastos. Se pueden ver partículas marrones o de café en el citoplasma de los osteoblastos maduros. En relación con el grupo de control, el número de osteoblastos positivos para ALP se redujo en el grupo ONFH (Fig. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP y Collα1 degradados y Wnt-11, ACP5, CTSK y MMP9 mejorados en los tejidos ONFH de las muestras clínicas

El análisis de transferencia Western y RT-qPCR demostraron que la expresión de miR-410 en el grupo ONFH disminuyó en relación con la del grupo de control, mientras que la expresión de Wnt-11 aumentó; degradación de la expresión de factores relacionados con osteoblastos ALP, BGLAP y Collα1; y la expresión de factores ACP5, CTSK y MMP9 relacionados con los osteoclastos ascendió (todos P <0.05) (Fig. 2a – c).

MiR-410, ALP, BGLAP y Collα1 disminuyeron y Wnt-11, ACP5, CTSK y MMP9 aumentaron en tejidos ONFH de muestras clínicas. un Detección de genes relacionados con miR-410, Wnt-11 y osteoblastos y osteoclastos mediante RT-qPCR. b Wnt-11 y proteínas relacionadas con osteoblastos y osteoclastos detectadas mediante análisis de transferencia de Western. c Bandas proteicas de Wnt-11 y proteínas relacionadas con osteoblastos y osteoclastos. d Expresión de Wnt11 (400 ×) y comparación de la tasa de proteína Wnt11 positiva detectada por tinción inmunohistoquímica. * P <0.05 frente al grupo de control

La expresión de Wnt-11 se probó mediante inmunohistoquímica y los resultados mostraron que la proteína Wnt-11 se expresaba principalmente en el citoplasma, y ​​la expresión positiva era básicamente de color amarillo parduzco o marrón. En contraste con el grupo de control, la tasa positiva de expresión de la proteína Wnt-11 en el grupo ONFH aumentó ( P <0.05) (Figura 2d).

El miR-410 regulado al alza y el Wnt-11 regulado a la baja elevan la BMD y BV / TV de las ratas

Micro-CT sugirió que en el grupo normal, la apariencia de la cabeza femoral era redonda, el grosor del cuello era uniforme y la estructura de las trabéculas óseas era continua y uniformemente distribuida. La cabeza femoral de las ratas en el grupo ONFH, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC y grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 colapsó gradualmente, el área de reabsorción ósea apareció gradualmente, el cuello de los fémures se volvió más delgado , y las trabéculas óseas se rompieron y la continuidad destruida. En el grupo agomir-miR-410, el grupo Wnt-11-siRNA y el grupo agomir-miR-410 + OE-NC, la apariencia de las ratas permaneció intacta, no se produjo colapso, no apareció un área de reabsorción ósea obvia, las trabéculas óseas se dispusieron normalmente y la estructura estaba completa (Fig. 3a).

El miR-410 altamente expresado y el Wnt-11 pobremente expresado aumentan la DMO y BV / TV de ratas. un Resultados de micro-CT de ratas en cada grupo. b Resultados del análisis de DMO. c Resultados del análisis de BV / TV. * P <0,05 frente al grupo normal. ⁺ P <0,05 frente al grupo agomir-NC. ^# P <0,05 frente al grupo siRNA-NC. ^y P <0.05 frente al grupo agomir-miR-410 + OE-NC

Los resultados de la metrología ósea informaron que, en contraste con el grupo normal, la DMO y BV / TV en el grupo ONFH estaban deprimidos (ambos P <0,05). En relación con el grupo agomir-NC y el grupo siRNA-NC, la DMO y BV / TV se elevaron en el grupo agomir-miR-410 y el grupo Wnt-11-siRNA (todos P <0,05). En comparación con el grupo agomir-miR-410 + OE-NC, se eliminó la BMD y BV / TV en el grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (ambos P <0.05) (Fig. 3b, c).

La sobreexpresión de miR-410 y la mala expresión de Wnt-11 aumentan los niveles de DMO de la diáfisis femoral, la cabeza femoral y la columna vertebral, y también aumentan el calcio sérico y niveles de fósforo de ratas

La radiografía observó que la apariencia de la cabeza femoral en el grupo normal era redonda, la densidad de la cabeza femoral era uniforme y la estructura estaba completa. En el grupo ONFH, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC y grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt11, la apariencia de la cabeza femoral de ratas se volvió más delgada y apareció el área de reabsorción ósea. La apariencia era uniforme y el grosor de la cabeza femoral de las ratas era completo en el grupo agomir-miR-410, el grupo Wnt11-siRNA y el grupo agomir-miR-410 + grupo OE-NC (Fig. 4a).

El miR-410 regulado al alza y el Wnt-11 regulado a la baja aumentan el nivel de densidad mineral ósea de la diáfisis femoral, la cabeza femoral y la columna vertebral, y también elevan los niveles séricos de calcio y fósforo de ratas. un Resultados de la observación de rayos X de animales. b Comparison of the bone mineral density of the femoral shaft, femoral head, and spine in each group. c Comparison of the serum calcium and phosphorus levels in each group. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

BMD and serum calcium and phosphorus level determination reported that compared to the normal group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels, fell in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and siRNA-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as serum calcium and phosphorus levels, ascended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, was abated (all P <0.05) (Fig. 4b, c).

Silencing Wnt-11 and Upregulating miR-410 Alleviate the Pathological Changes of Rat Tissues and Restrain Apoptosis of Osteocytes

The results of HE staining showed that the bone trabeculae were neat and clear and arranged regularly and tightly. Bone cells filled the bone lacunae, and the calcified zone was well connected to the subcartilage bone trabeculae in the normal group. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the bone trabecula was sparse; thinned, and even broken; the structure was disordered; and some fragments appeared. Some osteocytes in the bone lacuna were necrotic and a large number of bone lacuna was in emptiness that no bone cells filled in, and obvious proliferation of granulation tissue was observed in the necrosis bone trabecular space, which was wrapped around the necrotic bone trabeculae. In the agomir-miR-410 group, the Wnt-11-siRNA group, and the agomir-miR-410 + OE-NC group, the appearance of the rats remained intact, no obvious bone resorption area appeared and the bone trabeculae were arranged normally and the structure was complete (Fig. 5a).

Poor expression of Wnt-11 and overexpression of miR-410 alleviate pathological changes of rats tissues and restrain apoptosis of osteocytes. un Morphological observation of the femoral head of rats in each group (200 ×). b Ultrastructural observation of bone cells in rats of each group (8000 ×). c The results of TUNEL staining (200 ×). d Detection of apoptosis rate by TUNEL assay. e Detection of the Bax and Bcl-2 mRNA expression by RT-qPCR. f , g Detection of the Bax and Bcl-2 protein expression by western blot analysis. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

Electron microscopic observation observed that the shape of the bone cells in the normal group was consistent with the lacunae, and there was a small gap between the cell and the lacunae wall. The organelles were abundant, the cells in the lacunae were normal, the nucleus was egg-shaped, the nuclear membrane was intact, the chromatin did not agglutinate, and the cytoplasmic pseudo-foot stretched to the peripheral bone small tube and was connected with the adjacent bone cells. Osteoblasts were located on the surface of the bone trabecula, the sample was long, and there were many organelles. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, a large number of lipid deposits were found in the cytoplasm of osteoblasts, the gap between capsule and lacunae well was further widened, edema bright bands appeared between the nuclear membrane and cytoplasm, nuclear margination showed with compression, nuclear membrane was intact, mitochondria in cytoplasm was swollen, and the endoplasmic reticulum and Gore apparatus disappeared. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the morphology of rat osteoblasts was normal, chromatin aggregation was found in the nucleus of a small number of cells, no obvious lipid droplets were found in the cytoplasm, and the nuclear membrane was intact (Fig. 5b).

The results of TUNEL staining demonstrated that compared to the normal group, the apoptosis rate of osteocytes in the ONFH group was raised (P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the apoptosis rate of osteocytes abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the apoptosis rate of osteocytes enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 5c, d).

Western blot analysis and RT-qPCR reported that the Bcl-2 expression reduced and Bax expression raised in the ONFH group compared to the normal group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, Bcl-2 expression ascended and Bax expression descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the Bcl-2 expression declined and Bax expression appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 5e–g).

Overexpression of miR-410 and Low Expression of Wnt-11 Increase the Number of Osteoblasts and Decrease the Number of Osteoclasts

TRAP staining revealed that in the normal group, the morphology of osteoclasts with positive TRAP staining was different, most of them were shuttle or fusiform, few large osteoclasts were polygons, and most of them were distributed around the bone cerebellum. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, TRAP-positive cells were ascended, the morphology of cells was diverse in large polygons and polykaryotes, bone resorption was found in the bone trabeculae adjacent to osteoclasts, and typical resorption lacunae were formed. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of cells positive for TRAP staining was reduced, the cells were in a long strip shape and the morphology was more regular, the polygonous polynuclear osteoclasts were rare, and the bone structure of adjacent bone trabeculae was relatively complete (Fig. 6a).

Overexpression of miR-410 and low expression of Wnt-11 increase the number of osteoblasts and decrease the number of osteoclasts. un Results of TRAP staining in osteoclasts of rats (200 ×). b Count of positive cells in TRAP staining. c Results of ALP staining in osteoblasts of rats in each group (200 ×). d Count of positive cells determined by ALP staining. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

ALP staining presented that in the normal group, in osteoblasts, which were positive for ALP staining, the morphology was small and round. The cells were distributed in aggregation, most of which were located in the bone trabecular space of bone marrow cavity and on the surface of some bone trabeculae. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the number of osteoblasts positive for ALP staining was dispersedly distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblast-positive cells enhanced, and they were distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity and the surface of the part of the bone trabecular (Fig. 6c).

By comparison with the normal group, the number of osteoblasts per unit area was suppressed and the number of osteoclasts was heightened in the ONFH group (both P <0,05). In relation to the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the number of osteoblasts per unit area was heightened and the number of osteoclasts was declined in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblasts per unit area was declined and the number of osteoclasts was raised in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 6b, d).

Highly Expressed miR-410 and Lowly Expressed Wnt-11 Elevate the Expression of Osteocalcin (OCN), ALP, BGLAP, and Collα1, as well as Abate C- and N-terminal Telopeptides of Type I collagen (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH Rats

The results of ELISA revealed that in relation to the normal group, the level of osteogenic function index ALP and OCN degraded while the levels of osteoclast function index NTX-1 and CTX-1 heightened in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, ALP and OCN ascended and NTX-1 and CTX-1 descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, ALP and OCN dropped and NTX-1 and CTX-1 appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7a).

Highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 elevate the expression of OCN, ALP, BGLAP, and Collα1 as well as abate NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH rats. un Detection of osteogenesis and osteoclast function indices in the serum of rats in each group by ELISA. b Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes by RT-qPCR. c , d Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes protein expression by western blot analysis. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, the expression of osteoblast-related factors ALP, BGLAP, and Collα1 degraded, and osteoclast-related factors ACP5, CTSK, and MMP9 expression ascended (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 elevated, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 depressed, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression heightened in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7b–d).

Elevated Wnt-11 and Decreased miR-410 are Found in ONFH Tissues of Rats as well as Wnt-11 is the Target Gene of miR-410

The targeting relationship between miR-410 and Wnt-11 gene was analyzed by an online analysis software. It was displayed that a specific binding region existed between Wnt-11 gene sequence and miR-410 sequence, implying that Wnt-11 was the target gene of miR-410 (Fig. 8a). Luciferase activity assay was utilized to verify this relationship (Fig. 8b). The results presented that compared to the NC group, the luciferase activity depressed in the miR-410 mimics group (P <0.05), but there was no significant difference in the luciferase activity of MUT 3′UTR (P> 0.05), indicating that miR-410 could specifically bind to Wnt-11.

Increased Wnt-11 and decreased miR-410 are found in ONFH tissues as well as Wnt-11 is the target gene of miR-410. un Prediction of binding sites of miR-410 on Wnt-11 3′UTR. b Luciferase activity detection for verifying the relationship between miR-410 and Wnt-11. c Detection of miR-410 and Wnt-11 expression by RT-qPCR. d , e Wnt-11 protein expression determined by western blot analysis. f Expression of Wnt-11 in femoral head of rats in each group detected by immunohistochemistry (200 ×). g Comparison of the positive rate of Wnt-11 protein expression in each group. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, miR-410 expression declined and Wnt-11 expression raised in the ONFH group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group, miR-410 raised and Wnt-11 reduced in the agomir-miR-410 group (both P <0,05). In contrast with the siRNA-NC group, Wnt-11 declined in the Wnt-11-siRNA group (P <0,05). Wnt-11 enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group relative to that in the agomir-miR-410 + OE-NC group (P <0.05) (Fig. 8c–e).

>Wnt-11 expression was verified by immunohistochemistry. Wnt-11 protein was mainly expressed in the cytoplasm, and the positive expression was mainly brownish yellow or brown. Compared to the normal group, the positive rate of Wnt-11 protein expression in the ONFH group was raised (P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the positive rate of the Wnt-11 protein expression descended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the positive rate of Wnt-11 protein expression enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 8f, g).

Discussion

ONFH, a kind of bone destruction disease, is caused by blood supply failure and coagulation and fibrinolysis system disorder and finally causes the femoral head to collapse [19]. A previous study has discussed miRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by hormone in mice with ONFH [20]. Also, a recent study has provided a proof that the expression profile of miRNA of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in osteogenesis related to steroid-induced ONFH [21]. Furthermore, it was revealed the Li-nHA/GM/rhEPO stents can elevate both Wnt and HIF-1/VEGF pathways and promote osteogenesis and angiogenesis, which is beneficial to the repair of ONFH induced by glucocorticoids [22]. Based on these facts, the study aimed to explore the effects of miR-410 in the prevention of ONFH by targeting Wnt-11.

Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-410, ALP, BGLAP, and Collα1 degraded and Wnt-11, ACP5, CTSK, and MMP9 enhanced in ONFH tissues. A recent study has promoted that the expression of miR-410 in osteosarcoma is declined, and the anti-tumor effect is shown [23]. Another study has presented miR-410 expression was reduced in human estrogen receptor-positive tissues of breast cancer [24]. It is reported that secreted factor Wnt-11 expression is ascended in several types of cancer, containing colorectal cancer, where it advances the migration and invasion of cancer cells [25]. Similarly, a previous study has proved that Wnt-11 expression is heightened in hormone-independent prostate cancer [26]. ALP is a useful index for the state diagnosis and clinical prognosis of the disease [27]. OCN (bone gamma-carboxyglutamate protein; BGLAP) is a widely conserved molecule related to mineralization of bone matrix [28]. ACP5 is necessary for osteoclast differentiation and bone resorption, and it promotes cell movement by regulating adhesion kinase phosphorylation [29]. CTSK is a critical protease in charge of osteopontin, degrading type I collagen and other bone matrix proteins [30]. MMPs can degrade and modify most of the components of extracellular matrix and basement membrane and push forward an immense influence on cancer invasion and metastasis [31]. Also, our study revealed that Wnt-11 is the target gene of miR-410. Similarly, Zhang et al. found that miR-410 targeted the inferred binding site in the Wnt3a 3′-UTR to modulate the Wnt signaling pathway [32].

In addition, it was revealed that upregulated miR-410 and downregulated Wnt-11 increased BMD and BV/TV of ONFH rats. It has been suggested previously that a decrease of spinal BMD and an increase of urinary DPD/Cr ratio in non-traumatic ONFH patients [33]. Another study has verified that BMD of the femoral head and lumbar vertebrae in the ONFH group were degraded relative to that in the control group [34]. Additionally, imaging analysis revealed muscone can restore BMD and BV/TV ratio of the necrotic femoral head, while histologic examination further confirmed the protective effect of muscone on alcohol-induced ONFH [35]. A result emerged from our data that highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 restrained apoptosis of osteocytes. A study has demonstrated that silencing miR-410 can induce cell proliferation and reduce the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein [36]. It is reported that the descended miR-410 expression and ascended SOCS3 expression could reduce the expression of anti-apoptosis factor Bcl-2 and promoted the apoptosis of cells [37]. In addition, in androgen deficient LNCaP cells, the downregulation of Wnt-11 can prevent neuroendocrine-like differentiation and lead to apoptosis of prostate cancer cells [26]. The study also showed that the downregulation of Wnt-11 and upregulation of miR-410 enhanced ALP, BGLAP, and Collα1 expression and reduced ACP5, CTSK, and MMP9 expression. A study has indicated that Wnt-11 expression heightened in cervical cancer cells may result in activation and phosphorylation of JNK-1 by activating Wnt/Jnk pathway and boosts the proliferation and migration/invasion of tumor cells [15]. It has been suggested that Wnt-11 gene silencing in colorectal cancer cell lines reduced the invasive ability of cells [25]. Furthermore, the overexpression of miR-410 can restrain the invasion, migration, proliferation, and epithelial mesenchymal transformation of osteosarcoma cells via directly targeting TRIM44 [23]. Furthermore, a previous study stated that upregulated miR-410 inhibited the growth of cholangiocarcinoma in a xenograft mouse model by inducing apoptosis [38].

Conclusion

In summary, our investigation revealed that miR-410 was lowly expressed and Wnt-11 was highly expressed in ONFH, and upregulating miR-410 or downregulating Wnt-11 increased osteoblasts and reduced osteoclasts to alleviate ONFH. However, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy of miR-410 and Wnt-11 for the treatment of ONFH.

Disponibilidad de datos y materiales

Not applicable

Change history

Abreviaturas

ALP:

Fosfatasa alcalina

ANOVA:

Analysis of variance

BMD:

Bone mineral density

EDTA:

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

GAPDH:

Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

GE:

General Electric

HE:

Hematoxylin-eosin

LSD-t:

Least significant difference t test

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC:

Control negativo

OD:

Densidad óptica

ONFH:

Osteonecrosis of femoral head

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

ROI:

Regiones de interés

RT-qPCR:

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Sodium dodecyl sulfate

THR:

Total hip replacement

TRAP:

Tartrate resistant acid phosphatase

TUNEL:

TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling

Placa de cuarto de onda de transmisión ultrafina de banda ancha con matriz de orificios rectangulares basada en resonancias plasmónicas Fácil fabricación de nanocompuestos mesoestructurados de caucho natural / sílice con estabilidad térmica e hidrofobicidad mejoradas