Optimización y evaluación del método de pretratamiento para sp-ICP-MS para revelar la distribución de nanopartículas de plata en el cuerpo

Materiales y métodos

ENP

Los nAg “Biopure” de 30, 70 y 100 nm (nAg30, nAg70 y nAg100) se obtuvieron de nanoComposix (San Diego, CA, EE. UU.). El RM8013 se utilizó como estándar para calcular la eficiencia del transporte y se obtuvo del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (Gaithersburg, MD, EE. UU.). Cada tipo de ENP se sometió a ultrasonidos durante 10 minutos antes de su uso.

Reactivos

Se obtuvieron soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 mol / L, TMAH al 25%, ácido clorhídrico (HCl) al 30% y proteinasa K de Wako (Osaka, Japón). Una solución de ácido nítrico al 70% (HNO ₃ ) se obtuvo de Kanto Kagaku (Tokio, Japón).

Animales

Se adquirieron ratones BALB / c (hembras, 6 semanas) de Japan SLC (Shizuoka, Japón). Los ratones se alojaron en una habitación con un ciclo de luz / oscuridad de 12 h (las luces se encienden a las 8:00 y las luces se apagan a las 20:00). Se proporcionaron alimentos y agua ad libitum. Los protocolos experimentales se adhirieron a las pautas éticas de la Universidad de Osaka, Japón.

Medición de la distribución del tamaño de las partículas mediante la dispersión dinámica de la luz

Se diluyó nAg en agua milliQ hasta una concentración final de plata (Ag) de 10 μg / ml. A continuación, se llenó el tamaño y la celda capilar zeta (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) con 1 ml de la solución para medir la distribución de partículas y el diámetro medio con un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments).

Medición de la masa bruta de Ag

Para medir la concentración total de Ag en las muestras, se utilizó un Agilent 7700x (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Las condiciones de análisis fueron potencia de RF 1550 W, gas portador 1,05 L / min Ar y tiempo de permanencia 100 ms. Las mediciones se repitieron tres veces en modo MS. Se utilizó un método de patrón interno y se usó rodio como patrón interno para Ag. Los elementos objetivo de los análisis de ICP-MS fueron ¹⁰³ Rh y ¹⁰⁷ Ag. Las soluciones estándar de rodio y agricultura se obtuvieron de Wako (Osaka, Japón).

Análisis de sp-ICP-MS y su cálculo

Para el análisis sp-ICP-MS, utilizamos un Agilent 7700x (Agilent Technologies; Santa Clara, CA, EE. UU.) Similar al análisis de Ag total. Las condiciones de análisis fueron las siguientes:potencia de RF 1550 W, gas portador 1,05 L / min Ar, tiempo de permanencia 10 ms y tiempo de análisis 30 s. Para calcular el tamaño de las partículas, se utilizaron las herramientas de cálculo de partículas individuales publicadas por RIKILT [12].

Concentración de partículas críticas para sp-ICP-MS

La concentración de la solución madre de nAg fue de 1.0 mg / mL, que se utilizó para preparar soluciones de 2000, 800, 700 y 600 pg / mL. A continuación, cada una de estas soluciones se diluyó en serie 10 veces para obtener 40 soluciones diferentes de nAg. Determinamos las concentraciones de partículas de estas 40 muestras mediante sp-ICP-MS.

Optimización de métodos de pretratamiento para hígado de ratón

Los hígados recogidos de los ratones se mezclaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) ( w / v proporción de 1:10) y luego homogeneizar. El homogeneizado se mezcló con una solución de nAg de 100 ng / ml. Luego, la mezcla se trató con uno de los siguientes reactivos a v / v relación de solución de NaOH 1:1:0,1 mol / L, TMAH al 25%, HCl al 30% o solución de proteinasa K (10 U / ml de proteinasa K, Tris-HCl 0,01 M, EDTA 0,01 M y SDS al 0,5%). Las muestras se incubaron durante 3 ha 37 ° C y los residuos se recogieron y pesaron. Los sobrenadantes se diluyeron 500 veces y se analizaron mediante sp-ICP-MS.

Evaluación de la versatilidad del pretratamiento con NaOH en varios órganos

Los corazones, pulmones, bazos y riñones recogidos de los ratones se mezclaron con PBS ( w / v proporción de 1:10), homogeneizado y mezclado con 100 nm / mL nAg. A continuación, solución de 1 mol / L de NaOH a v / v se añadió una proporción de 1:1 y se incubó durante 3 ha 37ºC. Después de la incubación, los residuos se recogieron y se pesaron. Los sobrenadantes se diluyeron 500 veces y se analizaron mediante sp-ICP-MS.

Evaluación de la cantidad y las propiedades físicas de nAg100 y Ag ⁺ en ratones después de la administración intravenosa única

Para administración intravenosa, nAg100 y AgNO ₃ se diluyeron a 0,25 mg / ml (como Ag ⁺ ) con una solución de glucosa al 5%. A los ratones BALB / c se les administró por vía intravenosa nAg100 (1,5 o 0,75 mg / kg), AgNO ₃ (1,5 o 0,75 mg / kg como Ag ⁺ ) o solución de glucosa al 5% (control). Después de 24 h, se recogieron la sangre y el hígado de los ratones sacrificados. Los hígados se mezclaron con PBS ( w / v relación 1:10) y homogeneizado. Los homogeneizados de sangre e hígado se mezclaron con una solución de TMAH ( v / v proporción de 1:1) y con solución de NaOH ( v / v relación de 1:1), respectivamente. Estas muestras fueron analizadas por ICP-MS para medir las concentraciones de Ag y por sp-ICP-MS para evaluar las propiedades físicas, como el tamaño de partícula y la distinción entre partículas e iones.

Resultados y discusiones

Optimización de la detección de partículas por sp-ICP-MS

En el análisis sp-ICP-MS, es importante introducir una o ninguna partícula en el detector por tiempo de permanencia. Si se introducen múltiples partículas en el detector durante el tiempo de permanencia, la masa bruta de múltiples partículas se considera la masa de una sola partícula [13]. Por lo tanto, las muestras deben estar suficientemente diluidas para el análisis de sp-ICP-MS. Por el contrario, el análisis sp-ICP-MS de una muestra con una concentración muy baja de ENP conduce a datos de tamaño y distribución de partículas inexactos.

Para determinar las relaciones entre la concentración de nAg100 y el número de partículas detectadas, diluimos en serie las soluciones madre de nAg100 para su evaluación mediante sp-ICP-MS. El resultado mostró que el número de partículas detectadas aumentó teórica y linealmente en la región de concentración de Ag relativamente más baja. En contraste, a concentraciones de Ag relativamente más altas, el número de partículas detectadas fue menor que el valor teórico (Fig. 1a). Estos datos indicaron que a concentraciones más altas de Ag, tienden a introducirse múltiples partículas en el detector durante cada tiempo de permanencia, lo que resulta en una sobreestimación del tamaño de las partículas. Por lo tanto, es necesario determinar el mayor número de partículas detectadas que no difieran del valor teórico para evaluar con precisión el tamaño de las partículas. A continuación, restamos el número de partículas detectadas del valor teórico y representamos la diferencia como eje vertical. Los resultados indicaron que las discrepancias en la estimación del tamaño ocurrieron cuando el número de partículas detectadas fue> 500. Esto sugiere que es necesario detectar ≤ 500 partículas durante el tiempo de análisis (Fig. 1b). Aunque estos datos se obtuvieron en una sola prueba, la repetición del experimento mostró los mismos resultados (datos no mostrados).

Determinación del número óptimo de partículas por tiempo de permanencia para un análisis preciso de sp-ICP-MS. Una serie de soluciones de nAg (600 fg / mL a 2500 pg / mL) fueron analizadas por sp-ICP-MS. un Para determinar la relación entre la concentración de nAg100 y el número de partículas detectadas, se trazó una curva para las partículas detectadas (línea continua) y los valores teóricos (línea de puntos). b El número de partículas detectadas restado del valor teórico se representó en el eje vertical para determinar el número óptimo de partículas. Cada punto es el resultado de una única prueba ( n =1)

Para validar las condiciones de análisis, diluimos nAg con varios diámetros (nAg30, nAg70, nAg100) para detectar <500 partículas por tiempo de análisis y evaluamos sus diámetros. El análisis de sp-ICP-MS indicó que los diámetros primarios de nAg30, nAg70 y nAg100 fueron 30,0 ± 1,2, 65,1 ± 0,6 y 97,4 ± 0,6, respectivamente. Además, los diámetros hidrodinámicos determinados por dispersión dinámica de luz (DLS) fueron 36,4 ± 1,6, 70,6 ± 1,7 y 101 ± 1,0, respectivamente, estos valores son similares a los estimados por sp-ICP-MS. Estos hallazgos sugieren que las condiciones de sp-ICP-MS eran apropiadas para medir los diámetros de nanopartículas de varios tamaños.

Optimización de métodos de pretratamiento para detectar nAg en tejido hepático de ratón

Para cuantificar y determinar las propiedades físicas de los ENP en el cuerpo, es necesario lisar completamente los tejidos. Además, es fundamental recuperar de forma eficaz las partículas e iones distribuidos en el organismo sin inducir cambios físicos o químicos en las partículas. Probamos cinco reactivos solubilizantes, NaOH, TMAH, HNO ₃ , HCl o proteinasa K, y analizaron la cantidad y las propiedades físicas mediante sp-ICP-MS para optimizar las estrategias de pretratamiento utilizando el hígado como modelo [14,15,16,17,18].

El homogeneizado de hígado se mezcló con nAg100 para obtener una concentración final de Ag de 100 ng / ml seguido de tratamiento con cada reactivo solubilizante a 37ºC. Primero, evaluamos la cantidad de residuos de tejido como indicador de la solubilidad del tejido. Más del 90% del tejido se disolvió mediante tratamiento con NaOH, TMAH y proteinasa K, mientras que solo el 75% del tejido se disolvió con HNO ₃ y tratamientos con HCl (Fig. 2a). Teniendo en cuenta que casi el 80% del tejido está compuesto de agua [19], HNO ₃ Los tratamientos con HCl y PBS fueron ineficaces para disolver la matriz de tejido insoluble. Por el contrario, el tratamiento con NaOH, TMAH y proteinasa K disolvió eficazmente la matriz insoluble de los tejidos, lo que indica su idoneidad para cuantificar con precisión nAg en el tejido. A continuación, analizamos la tasa de recuperación de cada partícula e ión para evaluar el cambio en las propiedades físicas con cada tratamiento. El análisis de Sp-ICP-MS mostró que nAg100 se ionizó casi por completo mediante el tratamiento con reactivos ácidos (HNO ₃ y HCl) y parcialmente ionizados cuando se tratan con proteinasa K. Esto sugirió que los reactivos ácidos y la proteinasa K disolvieron las partículas y las convirtieron en iones. Por el contrario, 100 ng / ml de Ag, correspondiente a la cantidad inicialmente añadida, se detectaron como partículas cuando el tejido se trató con reactivos alcalinos (NaOH y TMAH). Casi no se detectaron iones después de los tratamientos alcalinos (Fig. 2b), lo que indica que NaOH y TMAH mantuvieron las propiedades físicas de nAg. Finalmente, evaluamos la distribución de diámetros de partículas en tejidos tratados con los diferentes reactivos, con el fin de analizar en detalle las propiedades físicas. El diámetro medio de partícula cambió a 120 desde 100 nm después del tratamiento con TMAH (Fig. 2c). Además, las partículas eran más anchas después del tratamiento con TMAH (Fig. 2d), lo que indica la agregación de partículas. Por el contrario, cuando los tejidos se trataron con NaOH, el diámetro de partícula promedio fue cercano a 100 nm, correspondiente al tamaño de partícula inicial. Esto sugiere que el pretratamiento con NaOH es la condición óptima para detectar nAg100 en los tejidos del hígado de ratón.

El pretratamiento con NaOH es el método óptimo para detectar nAg100 en hígado de ratón. Se seleccionaron cinco reactivos solubilizantes como disolventes de pretratamiento para lisar los tejidos (NaOH, TMAH, HNO ₃ , HCl y proteinasa K). El homogeneizado de hígado se mezcló con una solución de nAg100 para obtener una concentración final de Ag de 100 ng / ml y se trató con cada reactivo solubilizante a 37ºC. Después de 3 h, a tasas de residuos en cada grupo como indicador de la solubilidad del tejido, b tasas de recuperación (las barras blancas y negras representan la tasa de plata detectada como partículas y como iones, respectivamente), c diámetros promedio de partículas que se muestran en un gráfico de barras, y d La distribución del tamaño de partícula que se muestra en un gráfico de caldo de abejas se analizó mediante análisis sp-ICP-MS. Los resultados se expresan como media ± DE ( n =3)

El pretratamiento con TMAH se ha utilizado ampliamente para el análisis de sp-ICP-MS en varios estudios. El TMAH puede inducir la agregación de nAg100 basándose en varias propiedades físicas como la viscosidad y el pH. Además, la constante dieléctrica puede estar relacionada con la agregación. El tratamiento con TMAH durante 3 h puede aumentar la constante dieléctrica causada por la descomposición de TMAH en trimetilamina (TMA) y metanol [20]. Un aumento en la constante dieléctrica lleva el potencial zeta de nAg100, que es inversamente proporcional a la constante dieléctrica, a casi cero, lo que resulta en la pérdida de repulsión electrostática entre nAg y la inducción de agregación. El tratamiento de nAg100 con TMAH durante un período corto (1 min) dio como resultado un tamaño de partícula promedio de aproximadamente 100 nm (datos no mostrados).

Evaluación de la versatilidad del pretratamiento con NaOH en varios órganos

Para evaluar la versatilidad del pretratamiento con NaOH para detectar nAg, tratamos varios órganos de ratón (corazón, pulmón, riñón y bazo) con NaOH y realizamos sp-ICP-MS para la detección de partículas. Primero, evaluamos la cantidad de residuos de tejido como indicador de la solubilidad del tejido. Se logró más del 95% de solubilización del tejido mediante el tratamiento con NaOH (Fig. 3a). Además, el Ag correspondiente a las cantidades de aditivo se detectó como partículas (Fig. 3b). Aunque algunas tasas de recuperación excedieron el 100%, los criterios de la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. Establecen que una tasa de recuperación del 80-120% es suficientemente confiable [21]. Por tanto, nuestro análisis es fiable. Además, el diámetro medio de partícula de nAg detectado en cualquier órgano fue cercano a 100 nm, correspondiente al tamaño de partícula del nAg añadido (Fig. 3c, d). Estos estudios sugieren que el pretratamiento con NaOH es ideal para detectar nAg no solo en el hígado del ratón, sino también en el corazón, pulmón, riñón y bazo del ratón.

El pretratamiento con NaOH es el método óptimo para detectar nAg100 en varios órganos. Como en la Fig. 2, los homogeneizados de corazón, riñón, pulmón y bazo se mezclaron con nAg100 y se incubaron con una solución de NaOH. Después de 3 h, a tasas de residuos (las barras blancas y negras representan las tasas de residuos en el tratamiento con NaOH o PBS, respectivamente), b tasas de recuperación (las barras blancas y negras representan la tasa de Ag detectada como partículas y como iones, respectivamente), c diámetros promedio de partículas que se muestran en una tabla de calentamiento de abejas, y d La distribución del tamaño de partícula que se muestra en un gráfico de caldo de abejas se analizó mediante análisis de sp-ICP-MS en cada muestra de tejido. Los resultados se expresan como media ± DE ( n =3)

Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que el pretratamiento con NaOH es la estrategia de pretratamiento óptima para la cuantificación y los análisis de propiedades físicas de nAg en tejidos animales mediante sp-ICP-MS.

Evaluación de sp-ICP-MS para análisis cuantitativos y de propiedades físicas de nAg y Ag ⁺ en tejidos biológicos

nAg se ioniza en el cuerpo o ese Ag ⁺ partículas en tejido de ratón, aunque los detalles de este proceso no están claros. Por lo tanto, evaluamos la aplicación práctica de sp-ICP-MS analizando tanto la cantidad como las propiedades físicas de Ag en la sangre y el hígado del ratón después de una única administración intravenosa de nAg100 o Ag ⁺ . El análisis ICP-MS mostró que se detectó Ag en la sangre de ambos Ag ⁺ - y ratones tratados con nAg100 (Fig. 4a). Además, se detectó Ag en el hígado de ambos grupos (Fig. 4b). A continuación, analizamos las propiedades físicas de Ag en cada muestra. Debido a que se detectaron pequeñas cantidades de nAg en la sangre de ambos Ag ⁺ - y ratones tratados con nAg100, la mayoría de los Ag detectados estaban en forma de iones (Fig. 4c). En las muestras de hígado, aproximadamente el 80% de Ag se detectó como partículas en ratones tratados con nAg100, mientras que una pequeña cantidad de nAg se detectó en Ag ⁺ ratones tratados (Fig. 4d). Finalmente, evaluamos el tamaño de partícula en el hígado de ratones tratados con nAg100 mediante sp-ICP-MS, que mostró que los tamaños de partícula eran de aproximadamente 80 nm (Fig. 4e). Estos datos sugieren que Ag ⁺ administrado en la sangre apenas se transformó en partículas, y las propiedades físicas de Ag ⁺ en la sangre y el hígado no se modificaron. Por el contrario, el nAg100 administrado en la sangre estaba parcialmente ionizado; El 20% de Ag en el hígado y la mayor parte de Ag en la sangre estaban en forma de iones. Como resultado de la ionización parcial, el diámetro medio del nAg en los tejidos del hígado era menor que el de las partículas administradas inicialmente (80 frente a 100 nm). En consecuencia, nuestra estrategia sp-ICP-MS aplicable a muestras biológicas reveló que nAg100 administrado en la sangre se distribuyó como partículas (aproximadamente 80%) en el hígado y como iones (aproximadamente 95%) en la sangre, mientras que el método ICP-MS podría solo evalúe las cantidades de Ag y no los cambios físicos o químicos en las partículas.

Cuantificación simultánea y análisis de propiedades físicas de nAg100 y Ag ⁺ administrados por vía intravenosa . nAg100 y Ag ⁺ se administraron por vía intravenosa en ratones (0,75 o 1,5 mg / kg). Después de 24 h, se les extrajo el hígado y la sangre. Todas las muestras se pretrataron con solución de NaOH. Concentración de ag en a sangre y b El hígado se midió mediante ICP-MS. nAg en c sangre y d El hígado se midió mediante sp-ICP-MS. El diámetro medio de las partículas detectadas en el hígado se muestra en e . Los resultados se expresan como media ± SE ( n =3)

Conclusiones

Identificamos las condiciones óptimas de pretratamiento para el análisis de sp-ICP-MS de nAg en tejidos biológicos, lo que permite la cuantificación simultánea y los análisis de propiedades físicas de los ENP en tejidos animales. También desarrollamos el método sp-ICP-MS adecuado para evaluar muestras biológicas y demostramos su aplicabilidad al evaluar el cambio en las propiedades físicas de nAg100 en el hígado y la sangre. También demostramos que el cambio parcial de la forma de partícula a la forma iónica de nAg100 administrada a los ratones influyó en su cinética y distribución. Esta técnica se puede aplicar en el análisis de riesgos de las ENP evaluando las condiciones de exposición de las ENP, dilucidando las respuestas biológicas a las ENP e identificando los mecanismos subyacentes a las respuestas.

Disponibilidad de datos y materiales

El intercambio de datos no se aplica a este artículo, ya que no se generaron ni analizaron conjuntos de datos durante el estudio actual.

Abreviaturas

Ag:

Plata

Ag ⁺ :

Iones de plata

DLS:

Dispersión de luz dinámica

ENP:

Nanopartículas diseñadas

HCl:

Ácido clorhídrico

HNO ₃ :

Ácido nítrico

ICP-MS:

Espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente

nAg:

Nanopartículas de plata

nAg100:

100 nm nAg

nAg30:

30 nm nAg

nAg70:

70 nm nAg

NaOH:

Hidróxido de sodio

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

sp-ICP-MS:

ICP-MS de una sola partícula

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

TMAH:

Hidróxido de tetrametilamonio

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