Nanoalginatos mediante síntesis de micelas inversas:encapsulación de doxorrubicina y citotoxicidad del cáncer de mama

Métodos

Materiales

Se adquirieron alginato de sodio, cloruro de calcio dihidrato, ciclohexano (99,9%) y dodecilamina (98%) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El clorhidrato de doxorrubicina se adquirió de MedChem Express (Monmouth Junction, NJ). Estos reactivos se usaron tal cual, con disolución de alginato de sodio y la terapéutica en agua como se indica. Toda el agua era agua filtrada de 18 MΩ procedente de una fuente Milli-Q.

Preparación de nanoalginatos

Se disolvió alginato de sodio en un vial de vidrio a 15 mg / ml en agua y se dejó que se mezclara mediante una barra de agitación durante al menos 30 minutos antes de su uso. La DOX se disolvió en esta fase acuosa si se iba a incorporar al nanovehículo. Se comprobó la disolución de alginato para determinar la disolución completa del polvo de alginato antes de su uso en síntesis. Sin la introducción de un catión multivalente, la fase acuosa de alginato permanece homogénea durante semanas. Se pipetearon ocho mililitros de ciclohexano en un vial. La dodecilamina, un sólido a temperatura ambiente, se calentó en agua tibia durante unos minutos, hasta que parte del sólido se convirtió en forma líquida. Luego, se pipetearon 80 µl de dodecilamina en el ciclohexano. Se añadió una barra de agitación al vial de vidrio y luego la mezcla se agitó a 125 rpm. Después de 5 min de mezcla, la fase orgánica se consideró bien mezclada y lista para la adición de la fase acuosa. Se añadieron veinte microlitros de la fase acuosa de alginato a la fase orgánica de ciclohexano / dodecilamina. La velocidad de agitación se incrementó a 1200 rpm. La mezcla se produjo con agitación constante durante 20 min. A continuación, se añadieron a la mezcla treinta microlitros de una solución de cloruro cálcico 50 mM. Después de 25 min de mezcla / gelificación de las partículas, se agregaron 2 mL de agua a la mezcla, creando una capa acuosa debajo de la capa orgánica. Las nanopartículas se separaron en la fase acuosa y se utilizó una pipeta de 1 ml para eliminar la capa acuosa.

Purificación de NALG

La capa acuosa se centrifugó en una unidad de filtro centrífugo de 100 kDa (Pall) durante 10 min a 3200 × g en una centrífuga para eliminar los agregados grandes y el permeado se transfirió a una unidad de 10 kDa (Millipore). Después, la solución se centrifugó durante 5 min a la misma velocidad para filtrar las pequeñas impurezas. Se añadió agua y se centrifugó durante 5 min para lavar el retenido. Se recogió el volumen final de 1 mL y se realizó la caracterización de este producto.

Caracterización de las NALG

La solución filtrada de nanopartículas se transfirió a una cubeta (Malvern Instruments, celda zeta DTS 1070) para la medición dinámica de la dispersión de luz. La distribución de tamaño se determinó usando un Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, Reino Unido). Las medidas de tamaño se realizaron utilizando un láser de longitud de onda de 633 nm a 25 ° C con un método de detección de ángulo de retrodispersión de 173 °. Las mediciones del potencial zeta para las nanopartículas de alginato se realizaron en la misma cubeta inmediatamente después de la medición del tamaño. Las mediciones de tamaño y potencial zeta se realizaron por triplicado, y los resultados presentados indican la media ± desviación estándar de los tres ensayos. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para confirmar el tamaño de las nanopartículas e investigar su morfología. Las imágenes TEM se adquirieron utilizando un microscopio electrónico de transmisión Technai F-20 que funcionaba a 4200 eV. La preparación de las rejillas TEM implicó la deposición gota a gota de 10 μL de solución de nanopartículas posfiltrada sobre la superficie de cobre de la rejilla TEM con respaldo de formavar / carbono (Ted Pella). Las rejillas TEM húmedas se colocaron cubiertas en un desecador durante la noche antes de la toma de imágenes para garantizar un secado adecuado.

La doxorrubicina tiene fluorescencia intrínseca, que se puede utilizar para comparar la fluorescencia de las nanopartículas de alginato de doxorrubicina (NALG-DOX) con una curva estándar de DOX para estimar su concentración. Usamos longitudes de onda de excitación / emisión de 470/550 nm. La liberación de doxorrubicina de las soluciones de NALG-DOX se determinó dializando la solución de nanopartículas filtrada final en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 o tampón de citrato a pH 5,5. Se prepararon dos conjuntos de cinco lotes de NALG-DOX como se describió anteriormente, con una concentración inicial de DOX de 1,25 mg / ml en la fase acuosa de alginato. Se prepararon dieciocho dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI (ThermoFisher) con un volumen interno de 100 μL y un límite de peso molecular de 2 kDa agregando 100 μL de NALG-DOX a cada dispositivo. Cada dispositivo se colocó en un vial de centelleo que contenía 20 ml de tampón. Se añadió una barra de agitación a cada vial que contenía tampón y todos los viales se colocaron en una placa de agitación para agitar suavemente durante la duración del experimento. Los viales se cubrieron para reducir la pérdida de tampón por evaporación y para protegerlos de la luz. En cada punto de tiempo (1, 2, 4, 24, 48, 72 h), se retiraron tres dispositivos, se extrajeron 100 μL de la muestra de cada dispositivo y se colocaron en un pocillo separado, y se realizó una medición de fluorescencia en un Tecan Lector de microplacas Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG) a 470/550 nm. Las mediciones de fluorescencia se compararon con las mediciones de una curva estándar y se tomaron alícuotas iniciales antes del experimento para determinar la concentración y la cantidad de pérdida de DOX en el tampón.

Cultivo celular y dosificación

Se obtuvieron células de cáncer de mama murino, luciferasa 4T1 de línea celular ultra verde de Bioware / proteína fluorescente verde (4T1-luc2-GFP, adenocarcinoma de ratón) y no se obtuvieron células informadoras 4T1 de PerkinElmer (Waltham, MA). Estas células se mantuvieron con medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina / estreptomicina al 1% en CO ₂ al 5%. incubadora funcionando a 37 ° C. Las células 4T1 se sembraron a 4000 células / pocillo en una placa de fondo transparente de pared negra de 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra en los pozos, se aspiró el medio inicial y se introdujo la formulación de fármaco / medio.

Imágenes de fluorescencia

A las 48 h, se aspiró el medio, se lavaron las células tres veces con PBS y se añadió formalina a los pocillos. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron de nuevo tres veces con PBS y se añadieron a los pocillos dos gotas de reactivo ReadyProbes de células fijas NucBlue (ThermoFisher) por mililitro de medio. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron nuevamente tres veces con PBS. Luego, se agregaron 100 μl de PBS a las células fijadas y las placas se transfirieron a un sistema de imágenes de células automáticas EVOS FL (ThermoFisher). Se utilizó un objetivo × 20 para obtener imágenes de partes de ciertos pocillos en cada placa. Se registró una imagen de cada canal de fluorescencia por separado; una imagen azul para 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), una imagen roja para DOX (usando el canal RFP para capturar la fluorescencia intrínseca) y una imagen verde para GFP. Las células 4T1-luc2-GFP expresan proteína verde fluorescente, por lo que no se requirió tinción adicional para que las células fueran visibles en el canal verde. El tratamiento DOX “tiñe” las células y no se necesita más reactivo para visualizarlo en el canal rojo. Las imágenes se ajustaron en brillo / contraste en ImageJ.

Ensayo de viabilidad de células vivas / muertas

La evaluación cualitativa de la viabilidad de las células 4T1 después de la coincubación con NALG, DOX y NALG-DOX se evaluó utilizando un ensayo de viabilidad de células LIVE / DEAD (ThermoFisher). A las 72 h después de la introducción del medio cargado de fármaco, el medio se aspiró y las células se lavaron tres veces con PBS. El ensayo LIVE / DEAD se realizó agregando dos gotas de cada gotero de NucBlue Live Reagent y NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) por mililitro de medio. Se realizaron tres lavados más con PBS después de 30 min de incubación y se añadió formalina a los pocillos para fijar las células. Tres lavados más con PBS siguieron a la formalina y se añadió una cantidad final de 100 µl de PBS a cada pocillo. Se obtuvieron imágenes similares como se indicó, pero el canal verde ahora indicaba la presencia de células muertas, ya que las membranas celulares comprometidas permitieron que el reactivo verde ingresara a la célula.

Ensayo de viabilidad de células vivas / muertas

La evaluación cuantitativa de la viabilidad de las células 4T1 después de la coincubación con NALG, DOX y NALG-DOX se evaluó utilizando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue (ThermoFisher). A las 72 h después de la introducción del medio cargado de fármaco, se aspiró el medio. El ensayo Alamar Blue se realizó agregando 10 μL de reactivo Alamar Blue a cada pocillo con 100 μL de medio nuevo y se incubó durante 1 ha 37 ° C. Después de 1 h, se determinó la viabilidad celular para cada pocillo usando un lector de microplacas Tecan Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG). Las longitudes de onda de excitación / emisión se establecieron en 560/590, el software determinó los ajustes de ganancia óptimos para la placa y se utilizó un protocolo de lectura inferior para leer la intensidad de fluorescencia de cada pocillo de la placa. El% de viabilidad celular podría determinarse a partir de la lectura de la intensidad de la fluorescencia mediante la ecuación:

Resultados y discusiones

Proceso de emulsión de micelas inversa

En este trabajo, se preparó un vehículo de fármaco nanoalginato, NALG, mediante un proceso de emulsión de micelas inversas, como se ilustra en la Fig. 1. Se añadió alginato acuoso a una fase de aceite de ciclohexano / dodecilamina, que forma las micelas inversas. Luego, el alginato se reticuló con la adición de cloruro de calcio (CaCl ₂ ) solución. Después de transcurrido el tiempo para permitir la reticulación del alginato dentro de las micelas inversas, las NALG se extrajeron mediante la adición de agua. Finalmente, los filtros centrífugos eliminaron los contaminantes latentes y ayudaron a reducir la distribución de tamaño de las nanopartículas. El producto final fue una solución coloidal acuosa transparente.

Proceso de formulación para la formación de NALG y NALG-DOX. un Representación esquemática del proceso de síntesis de micelas inversas. Las cadenas de alginato acuosas se reticulan en un baño orgánico (arriba), se extraen a una fase acuosa (abajo a la izquierda) y luego se filtran para su purificación (abajo a la derecha). b Interacción molecular de Ca ²⁺ reticulación, lo que conduce a la formación de NALG. c Fotografía de síntesis en varios puntos, de izquierda a derecha, emulsión antes de CaCl ₂ Además, emulsión después de CaCl ₂ adición y separación al agregar agua

Los componentes del sistema de emulsión de micelas inversas se determinaron en base a datos experimentales y literatura pasada. Para reducir los grados de libertad en el sistema, elegimos ciclohexano para la fase orgánica. En la optimización de este proceso, probamos una serie de tensioactivos para determinar su capacidad de formar partículas de alginato a nanoescala indicadas por un aumento en la turbidez de la mezcla orgánica al introducir una pequeña cantidad de fase acuosa mientras se agita. La dodecilamina fue un candidato adecuado y se eligió como el tensioactivo para usar en el futuro. Se eligió agua como fase acuosa en los experimentos presentados aquí.

Caracterización de NALG

En la Fig. 2a, b, se muestra la distribución de tamaños hidrodinámicos de nanopartículas para NALG y NALG-DOX. Las nanopartículas, vacías o cargadas terapéuticamente, mostraron picos similares centrados alrededor de 90 nm. Los diámetros de partículas para NALG y NALG-DOX, respectivamente, fueron 92,2 ± 4,2 nm y 82,8 ± 3,6 nm. El índice de polidispersidad (PDI) de las partículas fue 0,320 ± 0,063 y 0,204 ± 0,044, y los potenciales ζ fueron - 15,0 ± 0,8 mV y 7,2 ± 4,6 mV.

Distribuciones dinámicas de dispersión de luz de a NALG y b NALG-DOX muestran distribuciones monodispersas de nanopartículas de alginato. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de c NALG y d NALG-DOX muestran morfología esférica de partículas. Las barras de escala indican 50 nm en la imagen más grande y 20 nm en el recuadro

Los tamaños de las partículas fueron consistentes tras la incorporación de DOX en la matriz de alginato. El potencial ζ fue negativo para el NALG vacío, lo que coincidió con otras nanopartículas de alginato unidas por calcio [39]. Las partículas cargadas de doxorrubicina poseían un potencial ζ positivo. Esto podría deberse en parte a un exceso de iones de calcio cargados positivamente en la superficie de la partícula, lo que puede ayudar a impartir la carga positiva a la nanopartícula. Además, la amina primaria presente en las moléculas de DOX puede interactuar electrostáticamente con los grupos de ácido carboxílico libres en el alginato, reduciendo las cargas negativas disponibles en la superficie de la partícula.

La Figura 2c, d muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión de NALG y NALG-DOX reticulados con calcio. Ambos tipos de nanopartículas mostraron una morfología esférica. La distribución general de nanopartículas parecía ser de tamaño similar a la distribución DLS. La concentración de la solución final de NALG-DOX se evaluó utilizando la fluorescencia intrínseca de la molécula de doxorrubicina. El volumen del producto NALG-DOX filtrado se dividió en conjuntos por triplicado de dispositivos de diálisis colocados en viales de centelleo llenos de PBS y se dejó que DOX se liberara varias veces del NALG-DOX. Inicialmente, la concentración de DOX en la solución NALG-DOX era ~ 4 μg / mL, lo que indica que la eficiencia de encapsulación, o la relación de DOX en NALG-DOX con respecto a la DOX inicial agregada a la formulación, para NALG-DOX es ~ 7%. Si bien esta eficiencia de encapsulación se considera baja en comparación con partículas similares [57], es probable que se deba a la DOX inicial presente en la fase acuosa. No iteramos sobre la formulación reduciendo la cantidad de DOX presente en la fase acuosa inicial y planteamos la hipótesis de que la eficiencia podría mejorarse reduciendo la cantidad de DOX en la formulación inicial. Es probable que el DOX no encapsulado pase a través de los lavados del filtro de 3 kDa al final de la síntesis. Con la disponibilidad y el costo relativamente bajo de la doxorrubicina, optamos por "saturar" la formulación con DOX, sabiendo que es probable que grandes cantidades de DOX sobrante pasen sin encapsular. El aumento de la eficiencia de encapsulación podría mejorar esta plataforma de partículas en trabajos futuros.

La curva de liberación de NALG-DOX a pH 5,5 y 7,4 se puede encontrar en la Fig. 3. NALG-DOX retiene aproximadamente el 70% de la carga útil de DOX en el transcurso de las primeras 4 h, y el 90% deja las partículas a las 24 h , a pH 7,4. Este patrón de liberación es común para los materiales poliméricos [57, 58] y demuestra una liberación controlada durante las primeras 24 h cuando se expone al depósito de PBS. A un pH más bajo de 5,5, más similar al pH que verían las nanopartículas durante la absorción celular en un endosoma tardío [59], la DOX se libera a un ritmo más rápido. Este es el comportamiento deseado, ya que se necesita una liberación más lenta cuando hay circulación general en la sangre, pero cuando se encuentra en el microambiente ácido del tumor, se prefiere una liberación más rápida.

La liberación de doxorrubicina de la solución de nanopartículas muestra una liberación controlada durante las primeras 24 h en PBS, pH 7,4. Se produce una liberación más rápida de doxorrubicina a pH 5,5. Cada punto representa la media ± desviación estándar de n =3 medidas

Captación celular de DOX

La captación de NALG-DOX por las células de cáncer de mama de ratón 4T1 a las 48 h se muestra en la Fig. 4a, b. Cada fila indica un canal de color independiente y la fila inferior muestra la imagen compuesta de todos los canales de color. En la columna de la izquierda se utiliza una alta concentración de DOX o NALG-DOX, que es suficiente para eliminar la mayoría de las células. La columna del medio muestra una concentración de 0.31 μg / mL para DOX y 0.28 μg / mL para DOX en NALG-DOX, que muestra cierto potencial de muerte celular, y la columna de la derecha muestra células no tratadas. Las células de la imagen central muestran doxorrubicina (roja) alrededor y superpuesta con el núcleo (azul) de las células. Hay un número reducido de células en las dos primeras columnas en ambos paneles ayb debido a la presencia de DOX, que inhibió la proliferación celular en comparación con los pocillos no tratados. La doxorrubicina funciona a través de la intercalación en el ADN nuclear [12], y la colocalización de la doxorrubicina y el núcleo podría indicar que está funcionando a través de este mecanismo tras la captación. En la Fig. 4b, la doxorrubicina encapsulada es distinta en la periferia del área nuclear. La columna de la derecha muestra células no tratadas sin señal significativa detectada en el canal rojo. El DOX libre, aunque potente, infligiría una toxicidad fuera del objetivo y reduciría los tiempos de circulación in vivo. La encapsulación permite una liberación más constante durante un mayor tiempo de circulación, lo que hace que NALG-DOX sea potencialmente mejor in vivo y podría explorarse en trabajos futuros.

Microscopía de fluorescencia de imágenes de células de cáncer de mama 4T1-luc2-GFP fijadas tratadas con doxorrubicina (DOX) ( a ) y NALG-DOX ( b ) después de 48 h de exposición. Las barras de escala indican 100 μm. Tinción nuclear azul:DAPI; verde (línea celular transfectada):GFP; rojo (fluorescencia molecular intrínseca):DOX

Citotoxicidad de NALG-DOX

Como prueba básica para el potencial de muerte celular, las células 4T1 no tratadas y las células tratadas con NALG-DOX se tiñeron con el ensayo de células LIVE / DEAD (ThermoFisher) y se fijaron después de 72 h de exposición. En la Fig. 5a – d se muestra una imagen de ejemplo de un pozo sin tratar, uno tratado con NALG, un pozo tratado con 0.078 μg / mL DOX y un pozo tratado con 0.20 μg / mL NALG-DOX, respectivamente. La superposición verde mostrada en la Fig. 5c, d indica que el tratamiento con DOX y NALG-DOX en esos pocillos conduce a la muerte de muchas de las células en ese pocillo. Las células no pudieron proliferar de la misma manera que en los pocillos tratados con nanopartículas vacías y sin tratar que se muestran en la Fig. 5a, b debido a la presencia del agente terapéutico. La dilución de nanopartículas utilizadas para la dosificación en NALG y NALG-DOX fue idéntica.

El ensayo de fluorescencia LIVE / DEAD demuestra poca o ninguna muerte celular en células 4T1 no tratadas ( a ) y en células tratadas con NALG ( b ). La intensidad de la señal del canal verde (tinción de células muertas) es fuerte en una gran cantidad de células tratadas con 0,078 μg / ml de DOX ( c ) y 0,20 μg / ml de NALG-DOX ( d ), lo que indica muerte celular. Las barras de escala indican 100 μm. Las concentraciones indican la cantidad de DOX, ya sea libre o en partículas. Dosificación de NALG en ( b ) a la misma densidad de partículas que en NALG-DOX

La evaluación cuantitativa de la viabilidad celular de las células 4T1-luc2-GFP después de 72 h de exposición a NALG, DOX libre y NALG-DOX mediante el ensayo Alamar Blue (ThermoFisher) se muestra en la Fig. 6. En la Fig. 6a, la doxorrubicina libre Las células tratadas mostraron menos células viables en todo el rango de concentración que las células tratadas con NALG-DOX (para una concentración equivalente de DOX). Esto se muestra aún más en el IC ₅₀ valores, o concentración necesaria para mostrar un efecto inhibidor del 50%, que fueron 0.093 μg / mL y 0.45 μg / mL, para DOX libre y NALG-DOX respectivamente. El valor de DOX libre es similar al encontrado a las 72 h contra células 4T1 por Du et al. [60]. El IC ₅₀ los valores son similares a los encontrados por Eliaz et al. con DOX y DOX encapsulada en liposomas a las 72 h contra células de melanoma B16F10 [61].

Viabilidad celular de las células 4T1-luc2-GFP después de 72 h de exposición a NALG-DOX y DOX ( a ) y NALG ( b ) a diversas concentraciones. Los puntos de datos y las barras de error indican la media ± desviación estándar de n =3 pozos. Las concentraciones indican la cantidad de DOX, libre o en partículas, en ( a ). En b , Los pocillos de NALG se dosificaron comenzando con las mismas concentraciones de partículas que NALG-DOX, lo que indica poca o ninguna muerte celular por el portador del fármaco solo

Se necesita una mayor concentración de doxorrubicina para que NALG-DOX muestre un efecto similar al del fármaco libre. Esto debería esperarse, ya que el agente terapéutico encapsulado tiene más obstáculos para su transporte a su sitio de efecto. La doxorrubicina encapsulada todavía mostró efectos inhibidores celulares, lo que significa que el fármaco sigue siendo terapéuticamente activo o la nanopartícula en sí es tóxica para las células. Para probar esto, se evaluó la viabilidad de NALG de manera similar a NALG-DOX. NALG mostró una toxicidad mínima en todas las concentraciones, como se muestra en la Fig. 6b, lo que indica que el fármaco es eficaz.

Conclusiones

Hemos desarrollado una plataforma de micelas inversas capaz de producir nanopartículas de alginato esféricas que tienen un tamaño de ~ 90 nm. La captación de NALG-DOX se examinó en células de cáncer de mama 4T1-luc2-GFP y mostró una captación distinta en ubicaciones cercanas al núcleo cuando se encapsuló en el portador de alginato. La toxicidad celular del fármaco libre frente al fármaco encapsulado se comparó mediante el examen de la CI terapéutica ₅₀ valores. La doxorrubicina encapsulada mostró una menor toxicidad en comparación con su contraparte de fármaco libre. Estos NALG-DOX pueden ser de gran interés para fines de administración de fármacos, ya que los efectos fuera del objetivo de la doxorrubicina se reducirían en la dosificación sistémica de la forma encapsulada. Las formulaciones futuras se optimizarán para perfiles de liberación controlada más lentos y una mayor encapsulación. Este proceso fácil proporciona una ruta sintética eficiente que se puede completar en solo unas pocas horas, lo que permite que la caracterización adicional y la experimentación in vitro e in vivo se desarrollen rápidamente.

Abreviaturas

4T1-luc2-GFP:

Luciferasa 4T1 / proteína verde fluorescente

CaCl ₂ :

Cloruro de calcio

DAPI:

4 ', 6-diamidino-2-fenilindol

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DOX:

Doxorrubicina

NALG:

Nanopartículas de alginato

NALG-DOX:

Nanopartículas de alginato de doxorrubicina

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

PDI:

Índice de polidispersidad

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

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