Nanoclusores de oro de neuroproteína fluorescente:síntesis y aplicaciones en la detección de lectina vegetal y la obtención de imágenes celulares

Resumen

Las interacciones carbohidrato-proteína median procesos biológicos fundamentales, como la fertilización, la señalización celular o la comunicación entre el patógeno y el hospedador. Sin embargo, debido a la enorme complejidad de los eventos de reconocimiento de glucanos, en los últimos años han surgido nuevas herramientas que permiten su análisis o aplicaciones. Aquí, describimos la primera preparación de nanoclusters de oro fluorescentes funcionalizados con neoglicoproteína, que contienen un N-glucano G0 biantenario como molécula de dirección, ovoalbúmina como antígeno modelo / portador y un núcleo de oro fluorescente como sonda de imagen (G0-OVA-AuNC). Posteriormente, demostramos la utilidad de las G0-OVA-AuNC generadas para la detección específica de lectinas vegetales y la obtención de imágenes in vitro de células dendríticas.

Introducción

Los nanoclusters de oro (AuNC) formados por diez a cien átomos de oro han llamado la atención de la comunidad científica debido a sus atractivas propiedades químicas y físicas [1]. Más pequeños de 3 nm, los nanoaglomerados de oro se acercan a la longitud de onda de Fermi de los electrones dando lugar a una emisión de fluorescencia dependiente del tamaño y ofreciendo oportunidades como sondas de detección e imagen para aplicaciones in vitro e in vivo [2, 3, 4]. Los ensayos fluorescentes actuales involucran principalmente tintes orgánicos, como rodamina o fluoresceína, o con menos frecuencia puntos cuánticos [5, 6, 7]. Sin embargo, debido a la baja estabilidad fotoquímica, la fluorescencia sensible al pH o la escasa solubilidad en agua de algunos tintes orgánicos y la toxicidad de los puntos cuánticos, su uso puede verse comprometido [8]. En este contexto, los nanoclusters de oro pueden considerarse fluoróforos ultrapequeños alternativos, que carecen de las limitaciones mencionadas anteriormente. Además, las AuNC se caracterizan por un gran desplazamiento de Stokes y una longitud de onda de emisión de fluorescencia desde el rojo visible a la región del infrarrojo cercano (IR), lo que es muy favorable en la obtención de imágenes biológicas porque se superpone a la ventana de transparencia del tejido [8,9,10].

La síntesis asistida por proteínas de nanoclusters de oro se informó por primera vez en 2009 utilizando albúmina de suero bovino (BSA) [11] y, desde entonces, los nanoclusters protegidos con proteínas solubles en agua se han convertido en una tendencia emergente en nanociencia [9, 12, 13]. Se ha prestado mucha menos atención a las glicoproteínas [14] para la preparación de AuNC y no tenemos conocimiento de ningún informe que describa la formación de AuNC a partir de neoglicoproteínas sintéticas como andamios. En general, la glicosilación modula las propiedades fisicoquímicas de las glicoproteínas, por ejemplo, plegamiento, vida útil circulatoria o estabilidad. También afecta a importantes funciones biológicas de la proteína, como el reconocimiento de receptor-ligando. Por lo tanto, la generación de neoglicoproteínas sintéticas a partir de proteínas, mediante la unión química de carbohidratos cuidadosamente diseñados y caracterizados [15], puede dotarlas de nuevas propiedades funcionales para aplicaciones biológicas. Como los carbohidratos participan en un gran número de procesos biológicos diferentes a través de la interacción con proteínas de unión a carbohidratos [16, 17], imaginamos nanoagrupamientos de oro de neoglicoproteína como sondas novedosas para estudiar y explotar eventos de reconocimiento de carbohidratos tanto in vitro como in vivo [18]. En este sentido, la presencia de múltiples copias de glucanos en la superficie de la proteína proporciona una presentación multivalente de carbohidratos con la consiguiente mejora de la afinidad de unión.

Aquí, exploramos el uso de AuNC funcionalizadas con neoglicoproteína autofluorescente como sondas de detección de lectinas vegetales y como reactivos de dirección de receptores de lectina para la obtención de imágenes in vitro de células dendríticas (DC). Las lectinas son proteínas de unión a carbohidratos que ayudan en diferentes fenómenos de reconocimiento biológico. En las plantas superiores, por ejemplo, las lectinas impiden la aparición de organismos herbívoros mediante el reconocimiento y la aglutinación de glicoproteínas extrañas, inhibiendo su crecimiento y multiplicación [19]. En los países en desarrollo de mamíferos, por otro lado, los receptores de lectina de tipo C (CLR) que se expresan en la superficie celular, juegan un papel importante en el reconocimiento de patógenos [20]. Los antígenos decorados con glicanos son reconocidos por CLR específicos, para ser endocitosados, procesados y finalmente presentados a las células T induciendo respuestas inmunes específicas. En nuestro estudio anterior, mostramos [21] que la funcionalización de un antígeno modelo, la ovoalbúmina (OVA), con un N-glicano G0 de terminación de GlcNAc biantenario sintético mejora la orientación a las CD y la absorción y presentación del antígeno subsiguiente. Postulamos que el fenómeno mencionado anteriormente se inicia por la interacción del glucano G0 y los receptores de lectina de tipo C endocíticos expresados en la superficie de las CD. En consecuencia, creemos que los nanoclusters de oro G0-OVA fluorescentes y multivalentes podrían convertirse en una alternativa a los G0-OVA marcados con fluorescencia aplicados en nuestro estudio anterior y podrían utilizarse como una herramienta novedosa para la visualización de CC. Además, el direccionamiento de las CD mediado por glucanos que permite el inicio de fuertes respuestas inmunitarias de células T podría utilizarse para mejorar la eficacia de las vacunas candidatas [22, 23, 24]. En este estudio inicial, presentaremos la síntesis de nanoclusters de oro a partir de neoglicoproteínas y la evaluación de la funcionalidad y accesibilidad de los glicanos G0 mediante experimentos de aglutinación de lectinas. Finalmente, demostraremos el potencial de los nanoclusters de oro fluorescentes para la obtención de imágenes de células dendríticas.

Resultados y discusión

Optimizamos la síntesis de nanoclusters de oro de ovoalbúmina decorados con el glicano G0 (G0-OVA-AuNCs) sobre la base de informes anteriores que emplean proteína OVA no conjugada [25, 26]. Las AuNC protegidas con proteínas se prepararon mediante la adición de ácido tetracloroaurico (III) de oro (HAuCl ₄ ^. 3H ₂ O) a una solución de proteína, seguida de una solución acuosa 1 M de hidróxido de sodio. Un aumento del pH de la reacción aumenta el potencial de reducción de los residuos de triptófano y tirosina presentes en OVA (Fig. 1a) [14]. El andamio de proteínas actúa como reactivo reductor y estabilizador, atrapando el pequeño grupo de oro dentro de la estructura de la proteína y aislándolo del medio ambiente. Un protocolo anterior para la síntesis de OVA-AuNC fluorescentes requería una solución de OVA muy concentrada (hasta 65 mg mL ⁻¹ ) [25]. Para limitar el uso de valiosos neoglicoconjugados de OVA para la preparación de AuNC, determinamos la cantidad mínima de OVA no conjugada que podría producir OVA-AuNC de manera eficiente. Encontramos que una concentración de OVA de 15 mg mL ⁻¹ fue suficiente para producir grupos con una fuerte emisión de fluorescencia (archivo adicional 1:Figura S1). La formación de OVA-AuNCs se aceleró significativamente por la irradiación de microondas reduciendo el tiempo de reacción de 18 ha 6 min [25]. Además, la irradiación de microondas proporcionó un calentamiento homogéneo a la solución favoreciendo la formación de racimos uniformes y monodispersos [1]. Las OVA-AuNC preparadas de esta manera exhiben un color marrón pálido y emiten una fuerte fluorescencia roja bajo iluminación con luz ultravioleta (Fig. 1b). El espectro UV-Vis de OVA-AuNC carece de la absorbancia correspondiente a una banda de resonancia de plasmón de superficie localizada, lo que sugiere la ausencia de nanopartículas de oro mayores de 5 nm [27], lo que fue confirmado por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Medimos un diámetro promedio del núcleo de oro OVA-AuNCs en un rango de 1.9 ± 0.7 nm (archivo adicional 1:Figura S2). Finalmente, el tamaño hidrodinámico promedio de OVA-AuNCs de 8.7 nm ± 2.5 nm fue asignado por dispersión de luz dinámica (archivo adicional 1:Figura S2). Su rango de tamaño similar al de OVA (6,5 a 7 nm de diámetro [28]) sugiere la presencia de una única molécula de proteína por núcleo de oro. Un análisis adicional de OVA-AuNC por electroforesis en gel de agarosa mostró una movilidad similar para OVA y OVA-AuNC hacia un electrodo positivo que confirma aún más el tamaño similar para ambas especies y su carga negativa a pH neutro (Fig. 1c). El espectro de emisión de fluorescencia de OVA-AuNC muestra un pico de emisión máximo a λ 670 nm tras la excitación a 350 nm (Fig. 1d). El espectro de excitación de las AuNC es amplio y el desplazamiento de Stokes grande (por encima de 200 nm), lo que es ideal para aplicaciones de detección espectral multicolor en presencia de otra sonda fluorescente (multiplexación) caracterizada por una longitud de onda de excitación similar, como el tinte Alexa Fluor® 405 de emisión azul. [26]. Se calculó que el rendimiento cuántico (QY) de OVA-AuNCs era ≈ 4% cuando se utilizó fluoresceína en NaOH 0,1 M (QY =≈ 92%) como patrón de referencia [29]. El estado de oxidación del núcleo de oro se asignó a una mezcla de especies de Au (I) y Au (0) según las mediciones de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) (archivo adicional 1:Figura S3) [11, 30]. El estudio de la estructura secundaria de la proteína dicroísmo circular (CD) reveló una organización de espiral aleatoria que sugiere una pérdida del pliegue nativo de OVA en AuNCs probablemente debido a las duras condiciones alcalinas durante la síntesis (archivo adicional 1:Figura S4) [31]. Por último, también hemos observado una estabilidad extraordinaria de las OVA-AuNC dentro de un amplio rango de pH (3-11), así como en una solución que contiene suero fetal bovino (FBS), el suplemento de suero más utilizado para el cultivo celular in vitro. (Archivo adicional 1:Figura S5). Esta característica de los nanoclusters de oro OVA destaca su utilidad para bioensayos in vitro e in vivo y abre nuevas y emocionantes aplicaciones. Por ejemplo, la emisión de fluorescencia insensible al pH de OVA-AuNCs podría permitir un seguimiento de partículas eficiente dentro de la célula sin pérdida de señal incluso dentro de los compartimentos endosomales, caracterizados por un pH ligeramente ácido [32, 33]. Por el contrario, en estas condiciones, el uso de ciertos conjugados de fluoresceína puede verse comprometido, ya que la máxima emisión de fluorescencia de estos colorantes se consigue en el pH básico. Las OVA-AuNC también mostraron una excelente solubilidad tanto en agua como en medio de crecimiento celular. Se observó una solubilización completa de OVA-AuNC hasta una concentración de 40 mg / ml tanto en agua como en medio de crecimiento celular. (Archivo adicional 1:Figura S6). Se midieron los espectros de emisión de fluorescencia en diferentes diluciones de OVA-AuNC y se comprobó que eran estables bajo incubación a 37 ° C hasta 24 h.

un Representación esquemática de la síntesis de OVA-AuNCs. b Espectros UV-visible de OVA (línea azul) y OVA-AuNC (línea naranja). Insertar:imágenes de OVA-AuNCs ( a ) y OVA ( b ) bajo iluminación de luz visible (izquierda) y bajo iluminación de luz ultravioleta (365 nm) (derecha). c Electroforesis en gel de agarosa de OVA (teñido con Coomassie Blue G-250) y OVA-AuNCs (bajo iluminación con luz ultravioleta). d Espectros de excitación de fluorescencia (línea verde) y emisión (línea rosa) de OVA-AuNCs

Para la síntesis de AuNC protegidas con neoglucoproteína G0-OVA, inicialmente preparamos neoglucoproteínas OVA funcionalizadas con G0. Se sintetizó N-glicano G0 biantenario equipado con un enlazador amino C5 como se describió previamente [34] y se logró la conjugación con OVA empleando éster suberato de disuccinimidilo (DSS) como reactivo de reticulación (Fig. 2a) [21, 35]. En resumen, la conjugación se realiza en una reacción de dos pasos:N-glicano G0 se funcionaliza con un exceso de 13 veces de enlazador DSS y luego se acopla a grupos amino libres en OVA. Al controlar la relación glucano / proteína, podríamos ajustar eficazmente el grado de sustitución de OVA (ver SI). La formación exitosa de neoglicoproteínas se verificó mediante la aparición de una banda de migración difusa electroforéticamente más lenta en el gel SDS-PAGE (Fig. 2b), mientras que el número promedio de glucanos introducidos se determinó adicionalmente mediante espectrometría de masas MALDI-TOF [21] (Fig. . 2c). Siguiendo esta estrategia, producimos neoglicoconjugados OVA que mostraban 2-3, 3-4 y 5-6 copias de N-glicano G0 por proteína.

un Síntesis de neoglicoconjugados G0-OVA ( n =valencia). b Electroforesis en gel SDS-PAGE de neoglicoproteínas OVA y G0-OVA que contienen diferentes valencias de N-glicano G0. c Espectros de masas MALDI-TOF de neoglicoproteínas OVA y G0-OVA que contienen diferentes valencias de N-glicano G0

A continuación, empleamos las neoglicoproteínas sintéticas en la preparación de AuNC (Fig. 3a) en condiciones previamente optimizadas e investigamos el efecto de la funcionalización de glicanos y su valencia sobre las propiedades físicas y ópticas de los grupos. Como se muestra en la Fig. 3, la absorción UV-Vis y la emisión de fluorescencia de G0-OVA-AuNCs fueron idénticas a las de OVA-AuNCs con absorbancia característica a 278 nm y emisión de fluorescencia roja con un máximo alrededor de 670 nm (Fig. 3b, c).

un Representación esquemática de la síntesis de OVA-AuNC derivada de glicanos G0. b Espectros de emisión de fluorescencia de G0-OVA-AuNC (líneas azul, naranja y verde) en comparación con OVA-AuNC (línea rosa). c Espectros UV-visible de G0-OVA-AuNC (líneas azul, naranja y verde) y OVA-AuNC (línea rosa)

Además, mediante mediciones de TEM, establecimos un diámetro medio de 1,6 ± 0,5 nm (Fig. 4) para el núcleo de G0-OVA-AuNC, que es comparable al tamaño de las OVA-AuNC (1,9 ± 0,7 nm). Por tanto, basándonos en nuestros resultados, creemos que los glucanos conjugados con OVA a través de residuos de lisina o el extremo N no afectan el potencial reductor global de las glucoproteínas y la formación adicional de agrupaciones en las valencias probadas [36]. Además, los azúcares no parecen obstaculizar la formación de polímeros de tiolato de Au (I) estabilizadores de agrupaciones [37, 38] entre los grupos de cisteína de la proteína y el núcleo de oro, incluso cuando están presentes en un número mayor (5-6 copias).

Imagen TEM de G0-OVA-AuNCs (3/4). Inserto:distribución de tamaño del diámetro del núcleo de oro de G0-OVA-AuNCs (3/4)

Finalmente, de manera similar a OVA-AuNCs, la estructura secundaria de la proteína G0-OVA-AuNCs (3/4) fue asignada por CD y reveló una organización de espiral aleatoria (archivo adicional 1:Figura S4). Sin embargo, mediante la unión de glucanos al andamio proteico de las AuNC, introducimos moléculas de dirección que permiten la interacción con proteínas de unión a carbohidratos y, al mismo tiempo, una proteína OVA permanece solo como un portador cuyos cambios conformacionales no alterarán el reconocimiento de lectina de la todo el sistema. Se ha descrito la capacidad antigénica de la OVA desnaturalizada en la producción de anticuerpos en ratones [39] y en la activación de células T. La activación de las células T es independiente de la estructura secundaria del antígeno, ya que está mediada por el reconocimiento de ciertas secuencias de aminoácidos que se presentan tanto en la OVA nativa como en la desnaturalizada [40]. De hecho, el péptido antígeno OVA 323-339 explica la principal respuesta específica de las células T a la OVA y este péptido se ha empleado en nanopartículas para inducir respuestas inmunitarias [41].

Para investigar la funcionalidad de las cadenas de glucanos recién introducidas en nanoclusters de oro protegidos con neoglicoproteínas, examinamos su interacción con diferentes lectinas vegetales en experimentos de aglutinación. Realizamos incubaciones de G0-OVA-AuNC y OVA-AuNC con dos lectinas vegetales diferentes, Bandeiraea simplicifolia lectina-II (BSL-II) específica para restos terminales GlcNAc y Solanum tuberosum lectina (STL), reconociendo el núcleo de la quitobiosa presente en los N-glicanos [34, 42]. Además, y para descartar cualquier interacción no específica entre G0-OVA-AuNC y lectinas, Aleuria aurantia como control se incluyó lectina (AAL) específica para L-fucosa. Agregamos concentraciones crecientes de lectinas BSL-II, STL y AAL a una solución de G0-OVA-AuNCs (5/6). Después de la incubación en la oscuridad, las soluciones se centrifugaron y se midió la fluorescencia del sobrenadante. Como se demuestra en la Fig.5, pudimos observar una disminución en la intensidad de la fluorescencia de una manera dependiente de la concentración después de la incubación con BSL-II y STL (Fig.5a-d), mientras que la intensidad de la fluorescencia se mantuvo sin cambios en presencia de AAL (Fig. .5e). Después de la incubación de G0-OVA-AuNCs (5/6) con STL, se observó un precipitado visible bajo irradiación con lámpara UV, mientras que no apareció precipitación tras la incubación con AAL (Fig. 5f). La relación de los valores de fluorescencia iniciales (F0) con los valores finales (F) después de la incubación de lectinas se representó frente a concentraciones crecientes de lectinas (Fig. 5b, d). La interacción STL con G0-OVA-AuNCs (5/6) mostró linealidad de 0 a 7.5 μM y el límite de detección se calculó con base en la ecuación SD * 3 / S (donde SD es la desviación estándar de la curva de calibración y S es el valor de la pendiente) [12, 13] a 2,35 μM ( y =1,95 x + 0,4266, R ² =0,97). De la misma manera, la interacción BSL-II con G0-OVA-AuNCs (5/6) mostró linealidad de 0 a 10 μM y el límite de detección (LOD) se calculó en 2,83 μM ( y =0.5687 x + 0,5838, R ² =0,965). Curiosamente, los grupos que contienen un número menor de azúcares conjugados como G0-OVA-AuNCs (2/3) (archivo adicional 1:Figura S7, AB) no mostraron ningún cambio significativo en la intensidad de fluorescencia tras la adición de BSL-II y STL, lo que indica falta de aglutinación. Este comportamiento destaca un efecto importante de la presentación multivalente de glicanos sobre la actividad de reticulación de las lectinas, incluso cuando solo se aplican pequeñas diferencias en la densidad de glicanos. Es importante destacar que no se observó ningún cambio en la intensidad de emisión de fluorescencia de las OVA-AuNC no conjugadas incubadas con lectinas (archivo adicional 1:Figura S7, C-D). A pesar de que la OVA de pollo nativa contiene un único sitio de glicosilación ligado a N (Asn-292) predominantemente sustituido con alto contenido de manosa o N-glicanos de tipo complejo e híbrido menos abundante [43], esta modificación del azúcar no es reconocida ni por STL ni por BSL-II , probablemente debido a la presentación monovalente. Esto confirmó la presencia de una interacción carbohidrato-lectina específica entre G0 introducido químicamente en G0-OVA-AuNC y STL / BSL-II y descartó la unión no específica de OVA-AuNC a las lectinas. Prevemos una posible aplicación de este sistema para la detección de biomarcadores de proteínas de unión a carbohidratos. Sin embargo, la preparación de neoglicoproteínas que muestran un alto número de copias de glucanos aumentaría la avidez de la construcción hacia la lectina deseada mejorando el límite de detección [44].

Ensayos de aglutinación de lectina de G0-OVA-AuNCs (5/6). un Espectros de fluorescencia representativos de los sobrenadantes de soluciones de OVA-G0 (5/6) -AuNCs después de la incubación con BSL-II. b Representación de F0 / F frente a concentraciones crecientes de BSL-II. c Espectros de fluorescencia representativos de los sobrenadantes de soluciones de OVA-G0 (5/6) -AuNCs después de la incubación con STL. d Representación de F0 / F frente a concentraciones crecientes de STL. e Espectros de fluorescencia representativos de los sobrenadantes de OVA-G0 (5/6) -AuNCs después de la incubación con AAL. f Imagen correspondiente a la incubación de G0-OVA-AuNCs (5/6) con AAL y STL, bajo iluminación con luz UV (365 nm). Después de la incubación con STL, se formó un precipitado visible. En el lado derecho:ilustración esquemática de la unión entre G0-OVA-AuNC y lectina vegetal

También estudiamos la interacción de G0-OVA-AuNCs (5/6) con STL en presencia de medios de crecimiento celular para discriminar el posible efecto de los componentes de los medios en las interacciones de carbohidratos y proteínas. Se disolvieron G0-OVA-AuNC (5/6) en medio de Dulbecco modificado de Iscove completo (IMDM) suplementado con suero de ternero fetal y se incubaron con cantidades crecientes de STL; las soluciones resultantes se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. (Archivo adicional 1:Figura S8). La movilidad electroforética de G0-OVA-AuNCs (5/6) se mantiene tanto en agua como en medio complejo. Sin embargo, en presencia de cantidades crecientes de STL, hubo un desplazamiento dependiente de la dosis de G0-OVA-AuNCs (5/6) al polo negativo destacando la interacción proteína-carbohidrato incluso en presencia de medios celulares complejos. Esto indica que las interacciones de carbohidratos de proteínas con G0-OVA-AuNC (5/6) no se ven impedidas por la presencia de componentes de los medios.

El potencial de los clusters para la obtención de imágenes de fluorescencia y el éxito anterior con las CD dirigidas a las neoglicoproteínas G0-OVA [21] nos animó a estudiar G0-OVA-AuNCs en la captación por las CD murinas in vitro. Empleamos microscopía de fluorescencia confocal para visualizar la internalización de G0-OVA-AuNC autofluorescentes (3/4). Se aislaron CD esplénicas de ratones C57BL / 6J y CD11c ⁺ La población se purificó mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) (archivo adicional 1:Figura S9) y se sembró en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-d-lisina durante la noche. Como prueba de concepto, las CD purificadas se incubaron con G0-OVA-AuNC (3/4), se lavaron para eliminar los materiales no unidos y se fijaron. Después de 40 min de incubación, se adquirieron imágenes de microscopía de fluorescencia confocal (Fig.6) y se observó una fuerte fluorescencia para las células dendríticas incubadas con G0-OVA-AuNCs (3/4) demostrando su internalización efectiva (Fig. 6a) y falta de fluorescencia. en el control negativo (CD11 ⁺ no estimulado células; Archivo adicional 1:Figura S9). La internalización de los nanoclusters se confirmó aún más mediante el apilamiento de imágenes de CC únicas tomadas a lo largo de su Z -eje (z-stack) y mediante la reconstrucción de una imagen 3D de un solo DC para visualizar la emisión de fluorescencia procedente del interior de la celda (Fig. 6b y archivo adicional 1:Figura S10).

Captación de G0-OVA-AuNCs (3/4) por DC murinas medidas por microscopía confocal. un Imágenes representativas de CD11c ⁺ células después de la incubación con G0-OVA-AuNCs (3/4). b Imagen de pila en Z de una sola célula dendrítica que representa la captación de G0-OVA-AuNC dentro de la célula

En resumen, hemos preparado y caracterizado nanoclusters de oro protegidos con neoglucoproteína que se han empleado en experimentos de aglutinación y en ensayos de captación de CD. En el ejemplo de detección de lectina vegetal específica, hemos demostrado la utilidad de G0-OVA-AuNC para el análisis de interacciones carbohidrato-proteína. También mostramos imágenes in vitro de células dendríticas mediante microscopía de fluorescencia. Sin embargo, se deben realizar más experimentos para comprender mejor, en primer lugar, el papel del glicano en la captación de nanoclusters por los países en desarrollo (p. Ej., Siguiendo la localización de los nanoclusters en los compartimentos celulares) y, en segundo lugar, para estudiar su bio y citocompatibilidad. Basándonos en nuestros resultados anteriores que describen las propiedades de focalización del glicano G0 y el aumento en la captación de G0-OVA por las CD en comparación con las OVA no conjugadas, creemos que las G0-OVA-AuNC podrían convertirse en una alternativa atractiva a las neoglicoproteínas marcadas con fluorescencia.

Conclusiones

En conclusión, en este estudio inicial, presentamos la primera síntesis de nanoclusters de oro protegidos con neoglicoproteína y la evaluación de sus propiedades físicas y ópticas en comparación con los racimos de proteínas no conjugadas. Confirmamos la accesibilidad del azúcar G0 en AuNC en ensayos de aglutinación mediante interacciones específicas con lectinas vegetales, lo que además resaltó la importancia de una densidad de glucano mínima para la actividad de reticulación efectiva de las lectinas. Como prueba de concepto, también demostramos la idoneidad de G0-OVA-AuNC en la obtención de imágenes de modelos de países en desarrollo murinos.

Creemos que las AuNC funcionalizadas con neoglicoproteínas autofluorescentes podrían convertirse en herramientas atractivas que permitan el análisis y las aplicaciones de las interacciones carbohidrato-proteína. Con base en sus propiedades físicas y químicas únicas, como grandes cambios de Stokes, solubilidad en agua o estabilidad del pH, los G0-OVA-AuNCs podrían convertirse en una alternativa a las etiquetas de colorantes orgánicos y usarse para la visualización de CD, estudios de absorción mediada por carbohidratos y plantas. detección de lectina. Finalmente, al emplear un portador inmunogénico como OVA para la unión de glucanos, los nanoclusters de oro funcionalizados con neoglicoproteínas no solo podrían permitir estudios en profundidad de la absorción, procesamiento y presentación de antígenos, sino que también en el futuro, pueden encontrar una aplicación como terapias fluorescentes o moléculas adyuvantes.

Métodos / Experimental

Materiales

Todas las soluciones se prepararon en agua nanopura (18 MΩ cm) a partir de un sistema de purificación de agua Diamond UV (Branstead International, IA, Madrid, España). Todo el material de vidrio empleado en la preparación de AuNC se lavó previamente con una solución de agua regia (HNO ₃ :HCl, 1:3, v / v ) y se enjuaga extensamente con agua nanopura. Se adquirieron trihidrato de cloruro de oro (III), hidróxido de sodio y trietilamina de Sigma Aldrich. La ovoalbúmina sin LPS se adquirió de Hyglos (Bernried, Alemania). El suberato de disuccinimidilo (DSS) y el DMSO se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. El N-glicano G0 se sintetizó químicamente como se describió anteriormente [21].

Síntesis de AuNC. Procedimiento general

A una solución agitada de OVA o neoglicoproteína (15 mg mL ⁻¹ ) en agua nanopura, una solución acuosa 0,1 M de HAuCl ₄ · 3H ₂ Se añadió gota a gota O (4,2 mM, concentración final). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 min y se añadió gota a gota una solución acuosa de NaOH 1 M (concentración final 150 mM) para aumentar el pH de la mezcla. Las soluciones resultantes se incubaron a 100 ° C durante 6 min en un reactor de microondas Biotage® Initiator. La diálisis de AuNC se realizó en casetes de diálisis Slide-Z-lyser TM (10 K MWCO) de Thermo Fisher Scientific sobre agua nanopura.

Los espectros de emisión de fluorescencia de OVA sintetizados y AuNC protegidas con neoglicoproteínas se midieron utilizando placas negras de poliestireno de 96 pocillos Nunc ™, en un lector de microplacas Flash Varioskan (Thermo Scientific) con una longitud de onda de excitación a λ 350 nm que funciona con un software ScanIt.

La electroforesis en gel de agarosa de OVA-AuNCs y proteína OVA se realizó en gel de agarosa al 0,75% a 80 V durante 30 min. La visualización de AuNC protegidas por OVA se realizó bajo irradiación de luz ultravioleta (365 nm) y la proteína OVA se tiñó con Coomassie Blue G-250.

Las imágenes de TEM se realizaron en un TEM de emisión de campo JOEL JEM-2100F con un voltaje de aceleración de 200 kV. Las soluciones de AuNC se vertieron sobre rejillas TEM de cobre recubiertas con un soporte de carbono ultrafino (Ted Pella, Redding, EE. UU.). El diámetro medio del nanocluster de oro se cuantificó utilizando ImageJ (Java).

Incubación de G0-OVA-AuNC (5/6) con lectinas vegetales

Diez microlitros de G0-OVA-AuNCs (5/6) [0.2 mg mL ⁻¹ ] en tampón TSM (Tris · HCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl ₂ 2 mM , MgCl ₂ 2 mM , pH =7,4) se colocaron en una placa negra de poliestireno de 384 pocillos Nunc ™. Posteriormente, 10 μL de Aleuria aurantia lectina (AAL), Solanum tuberosum lectina (STL), y Bandeiraea simplicifolia lectina-II (BSL-II) en tampón TSM se agregaron dando como resultado concentraciones de proteína finales de 0, 2.5, 5, 7.5, 10 μM. Las soluciones correspondientes se incubaron durante la noche en la oscuridad con agitación suave. Las soluciones de proteínas se centrifugaron a 11.000 g durante 1 hora y los espectros de emisión de fluorescencia de los sobrenadantes se registraron con un lector de microplacas Flash Varioskan (Thermo Scientific) con una longitud de onda de excitación a λ 350 nm. Para observar la precipitación tras la formación de complejos AuNCs-lectina, se realizó un experimento de control. Luego, 10 μL de G0-OVA-AuNCs (5/6) [0.2 mg mL ⁻¹ ] se incubó durante 1 h con 10 μL de AAL y STL [40 μM], seguido de centrifugación a 11.000 g (1 h). Las imágenes se tomaron bajo irradiación de luz ultravioleta (365 nm).

Aislamiento de células dendríticas del bazo de ratón

Las células dendríticas murinas utilizadas en todos los experimentos se aislaron de ratones C57BL / 6J criados por Charles River (CIC biomaGUNE, San Sebastián, España). Los protocolos de experimentación animal fueron aprobados por el comité de ética animal de CIC biomaGUNE y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE y Directivas de la Unión Europea sobre ética y bienestar animal. Los ratones se mantuvieron en condiciones de alojamiento convencionales (22 ± 2 ° C, 55 ± 10% de humedad y ciclo de 12 horas día / noche) y se alimentaron con una dieta estándar ad libitum . Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 2,5% en O ₂ al 100%. y sacrificado por dislocación cervical.

Los bazos se obtuvieron de ratones C57BL / 6J ( n =3, mujer, 27-28 semanas de edad). Para aislar los esplenocitos, se lavaron los bazos con medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) suplementado con l-glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina y suero de ternera fetal al 10% (FCS; PAN Biotech). La suspensión celular se mantuvo fría y se filtró a través de un colador celular de 40 µm para eliminar los agregados celulares. Después de la centrifugación (300 g, 5 min, 4 ° C), los sedimentos celulares se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis de eritrocitos recién preparado (Tris 100 mM al 10%, pH 7,5 + NH ₄ 4 al 90% 160 mM Cl), se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 2 min. Las células se lavaron dos veces en medio IMDM completo y se centrifugaron antes de la resuspensión en tampón MACS (PBS, BSA al 0,5%, EDTA 2 mM). Células dendríticas (CD11c ⁺ células) se aislaron de una suspensión de células de bazo murino C57BL / 6 mediante clasificación de células activadas magnéticamente usando CD11c ⁺ Microperlas (Miltenyi). Las células incubadas con microperlas magnéticas se cargaron en una columna MACS colocada en un campo magnético. Las células no unidas pasaron a través de la columna, mientras que permanecieron CD11c ⁺ las células se lavaron con tampón MACS y se eluyeron de la columna. Para aumentar la pureza de CC, el CD11c ⁺ Se repitió la purificación celular. La suspensión celular se centrifugó, se resuspendió en medio completo IMDM y se contó.

Captación de G0-OVA-AuNC (3/4) por parte de los países en desarrollo

CD11c ⁺ células de ratones C57BL / 6J (2 × 10 ⁶ células) se sembraron en cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-d-lisina durante la noche. G0-OVA-AuNCs (3/4) were added to cells (150 μg mL⁻¹ ) and incubated for 40 min at 37 °C. After incubation, cells were carefully washed with cooled PBS and fixed with 3% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing with PBS and water, the cover-slips were mounted on slides using Vectashield® mounting medium. Fluorescent images were taken using the Zeiss LSM 510 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss) equipped with a UV laser (365 nm) and × 63 oil immersion objective.

Abreviaturas

AAL:: Aleuria aurantia lectin
AuNCs:: Gold nanoclusters
BSA:: Albúmina de suero bovino
BSL-II:: Bandeiraea simplicifolia lectin-II
CD:: Circular dichroism
CLRs:: C-type lectin receptors
DCs:: Dendritic cells
DMSO:: Dimethyl sulfoxide
DSS:: Disuccinimidyl suberate ester
FBS:: Suero fetal bovino
G0:: Biantennary N-glycan
G0-OVA-AuNCs:: Neoglycoprotein functionalized gold nanoclusters
HAuCl₄ ^. ₃ H ₂ O:: Gold tetrachloroauric (III) acid
IMDM:: Iscove’s modified Dulbecco’s medium
IR:: Infrarrojos
LOD:: Límite de detección
MACS:: Magnetic-activated cell separation
OVA:: Ovalbumin
QY:: Quantum yield
STL:: Solanum tuberosum lectin
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión
XPS:: Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X

Estructuras de micro / nano arrugas altamente estirables para aplicaciones de sigilo infrarrojo Óxido de grafeno modificado covalentemente y polímero de microporosidad intrínseca (PIM-1) en membranas compuestas de película fina de matriz mixta

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

Teñir

Especias