El efecto de apoptosis en las células de cáncer de hígado de nanopartículas de oro modificadas con ácido litocólico

Métodos

Materiales

A menos que se especifique, los productos químicos se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se usaron sin purificación adicional. El medio RPMI-1640 y el suero fetal bovino (FBS) eran de Invitrogen Corporation. HepG2 (células de carcinoma de hígado hepatocelular humano), SMMC-7721 (células de carcinoma de hígado hepatocelular humano), QSG-7701 (células de hepatocito humano normal) y MCF-7 (células de cáncer de mama humano) se adquirieron del Instituto de Ciencias Biológicas de Shanghai ( Shanghái, China).

Síntesis de AuNP @ MPA

Se prepararon nanopartículas de oro cubiertas con citrato (AuNP @ MPA) con un tamaño medio de 4,0 nm de acuerdo con el método iniciado por J. Turkevich et al. [38]. Brevemente, 773 μl de solución de citrato de sodio 38,8 mM y 2 mL de HAuCl ₄ 15 mM solución se disolvieron en 30 ml de Milli-Q H ₂ O, y la solución se agitó a 25ºC. Luego, 3 mL de 0.1 M de NaBH ₄ (recién preparado) se añadió. Después de reaccionar durante 2 h a 25 ° C, la solución cambió de incolora a naranja claro. Luego, se agregaron 3 mL de 0.01 M de ácido 3-mercaptopropiónico (MPA) en etanol anhidro a pH 11 y se mantuvo reaccionando durante 2 ha 25 ° C. La mezcla de reacción se centrifugó para obtener el compuesto AuNP @ MPA.

Síntesis de AuNP @ MPA-PEG

Se añadieron 10,5 mg (0,0875 mmol) de 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (NHS) y 7 mg (0,035 mmol) de hidrocloruro de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC) a una solución 50 mM de AuNP @ MPA en Se agitó el ácido 4-morfolinetanosulfónico (MES) y la solución durante 30 min a 25ºC. Luego, 0.045 mmol NH ₂ -PEG1000-NH ₂ Se añadió y la mezcla se agitó durante 24 ha 25ºC. Cuando se completó la reacción, la mezcla se centrifugó para obtener el compuesto AuNP @ MPA-PEG.

Síntesis de AuNP @ MPA-PEG-LCA

Se añadió el compuesto AuNP @ MPA-PEG en agua ultrapura a 200 μl de solución de dimetilformamida anhidra (DMF) que incluía 17 mg (0,045 mmol) de LCA, y la solución de reacción se agitó durante 24 ha 25 ° C. Cuando se completó la reacción, la mezcla de reacción se centrifugó para obtener el compuesto AuNP @ MPA-PEG-LCA.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

La morfología y el tamaño de las AuNP se detectaron en un JEOL JEM-200CX TEM, que funciona hasta 200 kV. La solución de AuNP se dejó caer sobre una rejilla de cobre (malla 300).

Ensayos de capacidad antitumoral de AuNP

Usamos cuatro tipos de células (HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 y MCF-7) para investigar la capacidad antitumoral de las AuNP mediante un 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5 modificado -Método del bromuro de difeniltetrazolio (MTT). En el ensayo se utilizaron 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 mg / ml de AuNP y nanopartículas de oro originales (AuNP @ MPA). La DO570 de cada pocillo se midió en un lector de placas multimodo Tecan Infinite M200.

Determinación de la morfología mediante tinción Hoechst

Después de 24 y 48 h con AuNP @ MPA-PEG-LCA (0.5 mg / mL), las células HepG2 se tiñeron con 10 μg / mL de Hoechst 33342 durante 30 min en una incubadora de células. La morfología de los núcleos celulares se detectó mediante microscopía confocal Leica-SP8.

Apoptosis de profase celular:tinción con anexina V-FITC

Después de 6 h con AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / ml), las células HepG2 se tiñeron con anexina V-FITC durante 10 min en una incubadora de células y luego se observaron con un microscopio confocal Leica-SP8.

Para la detección por citómetro de flujo de AuNP, después de 6 h de tratamiento con AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / ml), las células HepG2 se tiñeron con anexina V-FITC durante 10 min en una incubadora de células y se detectaron con un citómetro de flujo FACSCalibur. (Becton Dickinson &Co., Franklin Lakes, Nueva Jersey).

Análisis del potencial de membrana mitocondrial (MMP)

Las células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA (0.5 mg / mL) durante 6 ha 37 ° C se incubaron con 10 μg / mL de JC-1 (5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 ′, Yoduro de 3,3′-tetraetilbencimidazolilcarbo-cianina; sondas moleculares) durante 10 min a 37 ° C. Posteriormente, las células se detectaron con un citómetro de flujo FACSCalibur.

Para la observación de microscopía de fluorescencia, las células HepG2 se trataron con AuNP @ MPA-PEG-LCA durante 10 min con 10 μg / mL de JC-1 y se observaron mediante microscopía confocal Leica-SP8.

Medición de especies reactivas de oxígeno (ROS)

La acumulación de ROS intracelulares se analizó utilizando diacetato de 2 ′, 7′-diclorofluoresceína (H ₂ DCF-DA). El tratamiento de células HepG2 con muestras de AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / mL) durante 6 h se incubaron con 10 μM de H ₂ DCF-DA durante 30 min a 37 ° C. Y la intensidad de fluorescencia de las células se observó utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur y un microscopio confocal.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de AuNPs

En primer lugar, se preparó AuNP @ MPA soluble en agua (esquema 1). La Figura 1a representa los resultados de TEM de AuNP @ MPA. Se indica que la forma y el tamaño de AuNP @ MPA parecía una forma esférica muy similar con un tamaño compacto de 4.0 ± 0.5 nm. Luego se preparó el AuNP @ MPA-PEG-LCA (Esquema 1). Y la morfología de las partículas también fue analizada por TEM (Fig. 1c). Las imágenes TEM muestran que la morfología de AuNP @ MPA-PEG-LCA es similar a la de AuNP @ MPA. Y los diámetros de AuNP @ MPA-PEG-LCA fueron ~ 16 nm mediante análisis estadístico.

Representación esquemática de la síntesis de AuNP @ MPA-PEG-LCA

Imágenes TEM de a AuNP @ MPA, b AuNP @ MPA-PEG y c AuNP @ MPA-PEG-LCA

Los resultados de la citotoxicidad

Para investigar la citotoxicidad de las AuNP, se seleccionaron células HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 y MCF-7 y se trataron con AuNP y AuNP @ MPA durante 48 h. Y el ensayo MTT se utilizó para detectar la toxicidad celular de las muestras. Las viabilidades celulares de AuNP y AuNP @ MPA en diferentes células se muestran en la Fig. 2. Los resultados sugirieron que la citotoxicidad de AuNP @ MPA es muy baja en todas las células. Sin embargo, el AuNP @ MPA-PEG-LCA podría inhibir el crecimiento de múltiples células de cáncer de hígado de manera más efectiva al aumentar la concentración de nanopartículas, pero causaría menos daño a las células normales y otras células cancerosas. Es decir, la actividad antiproliferativa de AuNP @ MPA-PEG-LCA para las células HepG2 y SMMC-7721 fue muy alta en relación con las células QSG-7701 y MCF-7.

Viabilidad celular de AuNP @ MPA y AuNP @ MPA-PEG-LCA (AuNP) incubadas con células HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 y MCF-7 durante 48 h

Inducción de apoptosis

Los núcleos apoptóticos son un índice común de apoptosis. Después del tratamiento con AuNP @ MPA-PEG-LCA durante los tiempos indicados, las células se incubaron con Hoechst 33342. Y luego se observaron las características morfológicas del núcleo celular mediante microscopía confocal. Como se muestra en la Fig. 3, las células de control y las células incubadas con AuNP @ MPA exhiben una tinción del núcleo celular intacto y homogéneo; sin embargo, el número de células apoptóticas en células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA aumenta gradualmente con el aumento del tiempo de incubación y el núcleo celular muestra características típicas de apoptosis, como núcleos fragmentados, cromatina condensada y reducción del volumen celular.

Características morfológicas del núcleo celular de las células HepG2 teñidas con Hoechst 33342. Las células HepG2 se incubaron con AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / ml) durante a 0 h, b 24 hy c 48 hy d AuNP @ MPA (0,5 mg / ml) incubado durante 48 h. Las células apoptóticas mostraron núcleos condensados ​​y fragmentados, y contracción del volumen celular; barra de escala de 20 μm

Como todos sabemos, la tinción con anexina V puede distinguir las primeras etapas de la apoptosis de las células necróticas. En la etapa inicial de la apoptosis, la anexina V podría unirse al fosfolípido fosfatidilserina (PS) de la membrana, que se exterioriza desde la superficie interna a la externa de la membrana plasmática [39]. Por lo tanto, investigamos el potencial de inducir la apoptosis de AuNP @ MPA-PEG-LCA a través de ensayos de tinción de anexina V-FITC. Como se muestra en la Fig. 4a, no hay una fluorescencia verde obvia en la membrana celular en el control, pero hay una fluorescencia verde obvia en la membrana celular de las células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA. Este fenómeno es un fuerte indicador de apoptosis en etapa temprana. Como todos sabemos, las imágenes de microscopía confocal solo demostraron la aparición de apoptosis; sin embargo, la citometría de flujo podría medir rápida y sensiblemente la aparición de apoptosis y determinar exactamente la tasa de apoptosis. Por lo tanto, investigamos más a fondo las etapas de la apoptosis mediante el uso de citometría de flujo. La Figura 4b muestra los resultados de la tasa de apoptosis por citometría de flujo. El porcentaje de apoptosis fue de aproximadamente el 38,45% de las células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA, pero el porcentaje de apoptosis solo fue de aproximadamente el 8,16% en las células de control. El porcentaje significativo de apoptosis sugiere que la célula incubada con AuNP @ MPA-PEG-LCA mantuvo la apoptosis.

Los resultados de la apoptosis de a imágenes confocales y b datos de citometría de flujo de células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 mg / ml). Las células se tiñeron con anexina V-FITC (excitación a 488 nm y emisión a 500–560 nm); barra de escala de 20 μm

La disminución de MMP

Las mitocondrias desempeñan un papel importante en la apoptosis porque pueden liberar factores proapoptóticos, como el citocromo C y el factor inductor de apoptosis [40,41,42]. Entonces, exploramos el cambio de MMP usando microscopía confocal y citometría de flujo. La Figura 5a muestra las imágenes de fluorescencia de células HepG2 marcadas con JC-1 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA mediante microscopía confocal. Podemos observar que hay una evidente fluorescencia roja de JC-1 y mitocondrias sanas en las células de control HepG2, lo que indica la presencia de agregación de JC-1. Sin embargo, hay más fluorescencia verde en las células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA, lo que indica que se produjeron colapsos de la membrana. La alteración mitocondrial en las células apoptóticas indica que el JC-1 no se acumula dentro de las mitocondrias sino que se distribuye por toda la célula. Y como forma monomérica, el JC-1 disperso que existe se vuelve verde fluorescente. Para cuantificar aún más el cambio de MMP, evaluamos las células HepG2 teñidas con JC-1 mediante citometría de flujo. En la figura 5b se muestran señales representativas de la relación rojo / verde de JC-1 registradas en células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA y células de control mediante citometría de flujo. Podemos observar que la proporción de rojo / verde mostró una disminución significativa en las células tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA a partir del análisis cuantitativo de las células teñidas con JC-1 mientras que tuvo un aumento significativo en las células de control, lo que sugiere que AuNP @ MPA-PEG-LCA puede inducir apoptosis en células HepG2.

un Imágenes de fluorescencia de células marcadas con JC-1 vistas por microscopía confocal y b efectos de AuNP @ MPA-PEG-LCA en MMP analizados por citometría de flujo

Efectos de AuNP @ MPA-PEG-LCA en ROS

Como todos sabemos, la apoptosis puede desencadenarse con un aumento de los niveles de ROS intracelulares, que también son una fuerte evidencia implicada en la inducción de la apoptosis [43]. Para explorar más a fondo si la disfunción mitocondrial estaba relacionada con la generación de ROS, determinamos el nivel de ROS en células HepG2 teñidas con H ₂ DCF-DA mediante microscopía confocal y citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 6a, la intensidad de la fluorescencia verde de H ₂ DCF-DA muestra un aumento significativo en las células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA en comparación con las células de control. Es decir, se incrementó significativamente el contenido de ROS en las células HepG2 tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA. Luego, el análisis cuantitativo del contenido de ROS en las células se investigó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig.6b, la mayor intensidad de fluorescencia se detectó en las células incubadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA en comparación con las células de control, lo que indica que el contenido de ROS es mayor en las células tratadas con AuNP @ MPA-PEG-LCA. . Los datos sugirieron que la disfunción mitocondrial quizás estaba relacionada con la generación de ROS. Estos resultados indican de manera preliminar que la generación de ROS tiene un papel importante en la inducción de apoptosis de AuNP @ MPA-PEG-LCA.

Análisis de la producción de ROS después de que las células HepG2 se trataron con AuNP @ MPA-PEG-LCA durante 6 h. a investigó el contenido de ROS en las células HepG2 microscopía confocal (excitación a 488 nm y emisión a 530 nm) y b citometría de flujo (excitación a 488 nm y emisión a 525 nm)

Conclusiones

En resumen, sintetizamos el AuNP @ MPA-PEG-LCA con un diámetro promedio de 16.0 nm que puede inhibir el crecimiento de múltiples células de cáncer de hígado. El AuNP @ MPA-PEG-LCA inhibió eficazmente la proliferación de células debido a la apoptosis, lo que se demostró mediante experimentos de tinción nuclear, tinción JC-1, análisis MMP y tinción con anexina V-FITC. En el estudio de citometría de flujo, la detención de AuNP @ MPA-PEG-LCA en células de cáncer de hígado demuestra aún más su comportamiento de apoptosis. Por lo tanto, los AuNP pueden inducir eficazmente la apoptosis a través de una disfunción mitocondrial mediada por ROS y son más efectivos para promover la muerte celular programada en las células de cáncer de hígado en un estudio mecanicista preliminar.

Abreviaturas

AuNPs:

Nanopartículas de oro

DMF:

Dimetilformamida

EDC:

Clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida

FBS:

Suero fetal bovino

H ₂ DCF-DA:

Diacetato de 2 ′, 7′-diclorofluoresceína

HepG2:

Células de carcinoma de hígado hepatocelular humano

JC-1:

Yoduro de 5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 ′, 3,3′-tetraetilbencimidazolilcarbocianina

LCA:

Ácido litocólico

MCF-7:

Células de cáncer de mama humano

MES:

Ácido 4-morfolinetanosulfónico

MMP:

Potencial de membrana mitocondrial

MPA:

Ácido 3-mercaptopropiónico

MTT:

Bromuro de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difeniltetrazolio

NHS:

1-hidroxipirrolidina-2,5-diona

PEG:

Polietilenglicol

PD:

Fosfatidilserina

QSG-7701:

Células de hepatocitos normales humanos

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

SMMC-7721:

Células de carcinoma de hígado hepatocelular humano

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

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