MicroARN-499-5p Restaura la Función Pulmonar en Lesión Inducida por Sepsis al Dirigirse a Sox6

Resumen

Antecedentes

Métodos

Resultados

Conclusión

Introducción

La sepsis es una inflamación sistémica que surge como resultado de una infección y causa disfunciones multiorgánicas, conteniendo síndrome de dificultad respiratoria aguda. Se caracteriza por hipotensión profunda, hipoxemia progresiva, daño tisular y cambios inflamatorios. El pulmón es el órgano más crítico y vulnerable en la sepsis, y la lesión pulmonar aguda (LPA) es una enfermedad inflamatoria frecuente inducida por sepsis. La gravedad de la LPA inducida por sepsis puede atribuirse a la permeabilidad alterada de la red alveocapilar, resultando en suministro reducido de oxígeno. La apoptosis de células pulmonares es un factor crítico en la lesión pulmonar inducida por sepsis. La fisiopatología de la LPA inducida por sepsis es desconocida, las medidas de soporte y antibióticos son los únicos tratamientos disponibles en pacientes con sepsis y LPA, y su impacto en las altas tasas de mortalidad por sepsis es limitado.

Los microARN (miARN) son pequeños segmentos de ARN no codificantes expresados endógenamente, que consisten en aproximadamente 18-24 nucleótidos, que pueden controlar una amplia gama de funciones celulares y unirse a regiones objetivo de un gen particular para controlar su expresión mediante la inhibición o activación de la traducción/transcripción de ARNm. El miR-499-5p es un miembro recientemente descubierto de miARN codificados por miosina. Un estudio ha reportado que los niveles séricos de miR-499-5p podrían utilizarse para indicar fallo orgánico en pacientes con sepsis. Otro estudio ha revelado que la expresión de miR-499-5p participa en la apoptosis cardíaca inducida por sepsis. La familia de la caja de movilidad alta (HMG) relacionada con la región determinante del sexo Y (SRY) (SOX) se define por un conjunto de genes que incluyen un dominio de unión a DNA de clase HMG, cuya identidad de secuencia con SRY es mayor al 50%. El factor de transcripción Sox6 es parte de la familia de la caja HMG relacionada con SRY y se expresa en múltiples tejidos durante la progresión, donde desempeña un papel crítico en la transición de células progenitoras proliferantes a células funcionalmente maduras. Hay un estudio que reporta que el aumento de Sox6 está implicado en la apoptosis cardíaca inducida por sepsis. Estudios han mostrado que la expresión de Sox2 y Sox4 están aumentadas en cáncer de pulmón de células pequeñas humano. Pero la relación entre Sox6 y la lesión pulmonar inducida por sepsis necesita más estudio. Por tanto, nuestro estudio fue explorar el efecto protector de miR-499-5p en la lesión pulmonar inducida por sepsis en ratones dirigiéndose a Sox6.

Materiales y Métodos

Cumplimiento de Estándares Éticos

Todos los experimentos con animales estuvieron en línea con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentos con Animales del Hospital Municipal de Weihai, Facultad de Medicina Cheeloo, Universidad de Shandong.

Animales de Experimentación

Ratones machos sanos de grado específico libre de patógenos BABL/c (edad 6-8 semanas, peso 18-22 g) se compraron del centro de animales experimentales de la Universidad de Shandong (Shandong, China). El ambiente se estableció a 24 ± 2 °C con ciclo de luz-oscuridad de 12 h alternados. Los ratones fueron tratados con acceso libre a alimentos estériles y agua estéril. Los experimentos comenzaron después de alimentación adaptativa durante 7 días.

Establecimiento del Modelo de Lesión Pulmonar Inducida por Sepsis mediante Ligadura y Punción Cecal (CLP) en Ratones

Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en 2 grupos: grupo sham (n = 8) y grupo modelo. Los ratones ayunaron durante 12 h antes de la operación y luego se anestesiaron con 1% pentobarbital sódico (70 mg/kg) por inyección intraperitoneal. Se observó el efecto de la anestesia; se notaron la respiración y latidos del corazón de los ratones. La cabeza y extremidades de los ratones se fijaron en posición supina, y la piel abdominal se preparó y desinfectó con bolas de algodón yodado. Los ratones en el grupo modelo fueron tratados con una incisión longitudinal (1,0 cm) en el segmento medio de la línea media abdominal, se abrió la cavidad abdominal, y el ciego se sacó de la cavidad abdominal evitando lesionar vasos mesentéricos. Se ligó con hilo de seda 1-0 a 1/2 del extremo del ciego, y el ciego se punció en el margen contralateral del mesenterio con aguja de punción N° 16. Se extruyó una cantidad adecuada de contenido intestinal, el ciego se devolvió y la incisión se suturó. Tras abrir la cavidad abdominal, los ratones en el grupo sham solo se sacó el ciego, y luego se devolvió. Los ratones se inyectaron subcutáneamente con 1 mL de solución salina 0,9% post-operación, separados en jaulas y alimentados rutinariamente.

Transfección In Vivo

Antes del modelado, los ratones se asignaron en 7 grupos (n = 8): grupo modelo, grupo miR-499-5p agomir, grupo control negativo (NC) agomir, grupo pequeño ARN interferente (si)-Sox6, grupo si-NC, grupo miR-499-5p agomir + sobreexpresión (oe)-Sox6 y grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Una hora antes del modelado, los ratones fueron tratados según la agrupación. Los ratones se anestesiaron con 1% pentobarbital sódico por inyección intraperitoneal, luego se fijaron en posición supina a 45°, y la lengua de los ratones se movió al otro lado de la boca para asegurar la permeabilidad de su tracto respiratorio. La piel anterior del cuello de los ratones se desinfectó y cortó para exponer la tráquea. El complejo de transfección (50 μL) fue absorbido por un microsampler (goteado de acuerdo con el grupo, la misma cantidad de solución salina fosfatada (PBS) se goteó en el grupo modelo) y luego se gotearon lentamente en la tráquea. Después de la transfección, los ratones fueron rotados verticalmente y el complejo de transfección se distribuyó completamente en los pulmones. Durante el proceso de transfección, se observaron la respiración y latidos del corazón de los ratones. Si ocurría paro respiratorio y cardíaco, la transfección se detenía inmediatamente, y se despejaba el tracto respiratorio. La transfección continuaba cuando la respiración y latidos de los ratones eran estables. El miR-499-5p agomir y su NC, así como los plásmidos correspondientes de Sox6, se compraron de Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Después de la transfección, los ratones se separaron en jaulas y alimentaron durante 1 día, y luego se eutanasió. Los ratones se anestesiaron con 1% pentobarbital sódico por inyección intraperitoneal, fijados en posición supina y luego eutanasió por venosección de aorta abdominal. La piel de los ratones se desinfectó localmente, se abrió la cavidad torácica, se ligaron la tráquea y bronquio principal derecho, se desconectó el bronquio principal derecho, y se removió el pulmón derecho. El lóbulo inferior del pulmón derecho se colocó en formalina neutra al 10% para examen patológico, el lóbulo medio se pesó rápidamente para calcular el peso húmedo (H) y se horneó a 56 °C, y el peso seco (S) se calculó tras 72 h, así se calculó la relación H/S. El lóbulo superior derecho se almacenó en nitrógeno líquido para detección de ARNm y proteínas. El pulmón izquierdo se lavó tres veces con 0,4 mL de suero salino normal, y se recolectó aproximadamente 1 mL de líquido de lavado broncoalveolar (BALF), se trasladó a un tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL y se colocó en hielo. El BALF se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min y se transfirió a un nuevo tubo EP, luego se almacenó a -80 °C para detección de factores inflamatorios.

Además, los ratones se dividieron en 3 grupos (n = 10/grupo): grupo sham, grupo modelo y grupo miR-499-5p agomir (50 μL de miR-499-5p agomir instilado en la tráquea 1 h antes de la cirugía). La tasa de supervivencia se monitoreó cada 12 h, totalmente durante 7 días. Se observó el estado de supervivencia de los ratones dentro de 7 días, y se determinó la toxicidad de miR-499-5p.

Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) y Puntuación de Lesión

Los tejidos pulmonares se prepararon en secciones de parafina, teñidos con H&E y observados bajo microscopio óptico. La lesión pulmonar se puntuó (congestión alveolar, hemorragia, infiltración o agregación de neutrófilos en la cavidad alveolar o pared vascular, engrosamiento de la pared alveolar y/o formación de membrana hialina) por el sistema de puntuación patológica para lesión pulmonar emitido por la Sociedad Torácica Americana. 0 puntos indicaba lesiones nulas o muy leves; 1 punto indicaba lesiones leves; 2 puntos indicaba lesiones moderadas; 3 puntos indicaba lesiones severas; 4 puntos indicaba lesiones muy severas. La puntuación total de los cuatro ítems representó la puntuación total de lesión pulmonar.

Tinción de Masson y Puntuación

Los tejidos pulmonares se hicieron en secciones de parafina (4 µm) y se trataron con tinción de Masson. Fibras de colágeno, moco y cartílago fueron azules, citoplasma, músculo, celulosa y glía fueron rojos, y núcleos celulares fueron azul-negro. En el sistema de puntuación semi-cuantitativa de Ashcroft, 0 puntos indicaba pulmón normal; 1 punto indicaba engrosamiento fibroso leve de pared alveolar o bronquial; 3 puntos indicaba engrosamiento moderado de pared alveolar o bronquiolar sin daño a la estructura pulmonar; 5 puntos indicaba fibrosis empeorada acompañada de daño a la estructura pulmonar, formando bandas o masas fibrosas; 7 puntos indicaba daño severo de estructura pulmonar y grandes áreas de fibrosis, formando bandas o grumos fibrosos; 8 puntos indicaba empaquetamiento fibroso de todas las regiones.

Tinción TUNEL

La apoptosis de tejidos pulmonares se probó con kit TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se observó por microscopio óptico. Las células apoptóticas se tiñeron de marrón en el núcleo. El índice de apoptosis indicó el porcentaje de células positivas TUNEL.

Inmunohistoquímica

Las secciones de tejido pulmonar se desparafinizaron con xileno, incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% y bloquearon con suero de cabra. Luego, se usaron Caspasa-3 (ab13847, 1:500), Caspasa-9 (ab32539, 1:250) y SOX6 (ab30455, 1:500, todos de Abcam, MA, EE. UU.) como anticuerpos para inmunotinción de secciones. Se utilizó un microscopio óptico (Leica Microsystems, IL, EE. UU.) para capturar imágenes que luego se analizaron con software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, EE. UU.).

Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Inversa Cuantitativa (RT-qPCR)

Se adoptó el kit OMEGA (Solarbio science & technology Co., Ltd., Beijing, China) para extracción de ARN total en tejidos pulmonares y determinación de concentración de ARN. El ADN complementario (ADNc) se compuso por transcripción inversa según el kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.). Los cebadores fueron diseñados por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.), como se muestra en Tabla 1. La reacción PCR se realizó según el kit FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). El experimento se analizó cuantitativamente por el método 2^−△△Ct. U6 fue el control de carga de miR-499-5p, y GAPDH fue el parámetro interno de otros genes.

Análisis de Western Blot

La proteína total se recolectó usando tampón de lisis de radio-inmunoprecipitación para tratar tejidos pulmonares. La concentración total de proteína se midió por método de ácido bicinconínico. La muestra de proteína (30 μg) se procesó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio al 10%, se transfirió a membrana de fluoruro de polivinilideno, se bloqueó con leche descremada en polvo al 5% y reaccionó con anticuerpos primarios Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspasa-3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, EE. UU.), Caspasa-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam), interleucina-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, EE. UU.), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) y GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, EE. UU.). Luego, la membrana se incubó con anticuerpo secundario (1:2000) y se reveló por quimioluminiscencia mejorada.

Ensayo de Inmunoabsorción Enzimática (ELISA)

Los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en BALF se determinaron por kit ELISA (Boster, Hubei, China). La determinación colorimétrica se realizó a 450 nm.

Detección de Índices de Estrés Oxidativo

Los tejidos pulmonares en nitrógeno líquido se pesaron y diluyeron en una cierta proporción de suero salino bajo condición de baja temperatura, luego se homogeneizaron y centrifugaron a 4 °C, 3000 r/min durante 20 min a baja temperatura, y se tomó el sobrenadante para determinación. La actividad de mieloperoxidasa (MPO) se probó por kit de detección MPO (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), y malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSH-Px) y catalasa (CAT) se probaron por kits proporcionados por JianCheng Bioengineering Institute.

Ensayo de Gen Reportero de Luciferasa Dual

Sox6 puede ser el gen objetivo de miR-499-5p predicho por un sitio web biológico (https://www.targetscan.org/vert_72/). Había cuatro sitios de unión entre miR-499-5p y región 3' no traducida (UTR) de ARNm de Sox6. Los vectores pmiR-RB-REPORT-Sox6 tipo salvaje (WT) y pmiR-RB-REPORT-Sox6 tipo mutante (MUT) fueron construidos por Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China), y se generaron los plásmidos reporteros de luciferasa correspondientes. Células TC-1 (células epiteliales pulmonares de ratón, 1 × 10⁵ células/pozo, Shanghai Yiyan biological technology Co., Ltd., Shanghai, China) se sembraron en placa de 24 pozos, y se transfirieron con miR-499-5p agomir o agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT o pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT vía Lipofectamine2000. El sistema de ensayo de gen reportero de luciferasa dual (Promega, WI, EE. UU.) se aplicó para medir la actividad de luciferasa.

Análisis Estadístico

Todos los datos se analizaron con software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EE. UU.). Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron por prueba t, comparaciones entre múltiples grupos se evaluaron por análisis de varianza unidireccional (ANOVA), y la prueba post hoc de Tukey se usó para comparación pareada después del análisis ANOVA. La curva de supervivencia se hizo por método Kaplan-Meier. Valor P < 0,05 indicó diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

La Relación H/S y Sox6 Aumentan Mientras miR-499-5p Disminuye en Tejidos Pulmonares de Ratones con Lesión Pulmonar Inducida por Sepsis

La toxicidad de miR-499-5p se probó en ratones para detectar el tiempo de supervivencia de ratones sépticos. Los resultados mostraron (Fig. 1a) la tasa de supervivencia dentro de 7 días de ratones en el grupo sham fue 100%, y la de ratones sépticos se redujo. La tasa de supervivencia de ratones sépticos tras tratamiento con miR-499-5p mejoró. Los resultados de relación H/S de tejidos pulmonares demostraron que (Fig. 1b): versus el grupo sham, la relación H/S aumentó en el grupo modelo (P < 0,05). En comparación con el grupo NC agomir y grupo si-NC, la relación H/S se redujo en el grupo miR-499-5p agomir y grupo si-Sox6 (ambos P < 0,05). La relación H/S aumentó marcadamente en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 relativo al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC (P < 0,05).

Se detectó la expresión de miR-499-5p y Sox6 y se encontró que (Fig. 1c-f): en contraste con el grupo sham, miR-499-5p redujo y Sox6 aumentó en el grupo modelo (ambos P < 0,05). En relación con el grupo NC agomir, miR-499-5p aumentó y Sox6 disminuyó en el grupo miR-499-5p agomir (ambos P < 0,05). Versus el grupo si-NC, Sox6 deprimió en el grupo si-Sox6 (P < 0,05). Por comparación con el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, Sox6 se elevó dramáticamente en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

El contenido proteico de Sox6 en tejidos pulmonares de ratones sépticos se determinó por inmunohistoquímica (Fig. 1g). Se observó que versus el grupo sham, la expresión de proteína Sox6 aumentó en el grupo modelo (P < 0,05); comparado con el grupo NC agomir y si-NC, se examinó menor expresión de proteína Sox6 en el grupo miR-499-5p agomir y grupo si-Sox6 (ambos P < 0,05); relativo al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, la expresión de proteína Sox6 se incrementó en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

La Restauración de miR-499-5p o Depleción de Sox6 Alivia la Patología de Tejidos Pulmonares, Reduce la Puntuación de Lesión Pulmonar, Fibras de Colágeno y Grado de Fibrosis Pulmonar en Ratones con Lesión Pulmonar Inducida por Sepsis

Los resultados de tinción HE presentaron que (Fig. 2a): en el grupo sham, la estructura del tejido pulmonar estaba intacta, el tabique alveolar se manifestaba básicamente sin edema o inflamación, y la cavidad alveolar era clara. En el grupo modelo, NC agomir, si-NC y miR-499-5p agomir + oe-Sox6, se pudo ver exudación, edema y hemorragia en la mayoría de cavidades alveolares de tejidos pulmonares, y se mostró infiltración masiva de células inflamatorias en el intersticio pulmonar. En los grupos miR-499-5p agomir, si-Sox6 y miR-499-5p agomir + oe-NC, la lesión de tejidos pulmonares se redujo versus el grupo modelo.

Los resultados de puntuación de lesión de tejido pulmonar y puntuación semi-cuantitativa de Ashcroft mostraron que (Fig. 2b,d): en relación con el grupo sham, la puntuación de lesión pulmonar y el grado de fibrosis pulmonar aumentaron obviamente en el grupo modelo (P < 0,05). Versus el grupo NC agomir y si-NC, la puntuación de lesión pulmonar y el grado de fibrosis pulmonar se redujeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (ambos P < 0,05). En contraste con el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, la puntuación de lesión pulmonar y el grado de fibrosis pulmonar aumentaron marcadamente en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

Los resultados de tinción de Masson revelaron que (Fig. 2c): en el grupo sham, los tejidos pulmonares de ratones contenían una pequeña cantidad de fibras de colágeno azules. En el grupo modelo, NC agomir, si-NC y miR-499-5p agomir + oe-Sox6, las fibras de colágeno aumentaron. En el grupo miR-499-5p agomir, grupo si-Sox6 y grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, las fibras de colágeno disminuyeron versus el grupo modelo.

La Restauración de miR-499-5p o Depleción de Sox6 Reduce Células Positivas TUNEL, Expresión de Proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 en Tejidos Pulmonares de Ratones con Lesión Pulmonar Inducida por Sepsis

Los resultados de Western blot, tinción TUNEL e inmunohistoquímica indicaron que (Fig. 3a-f): núcleo normal era azul y núcleo apoptótico era marrón en diferentes tonos. Versus el grupo sham, células positivas TUNEL, expresión de proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 aumentaron en el grupo modelo (todos P < 0,05). Versus los grupos NC agomir y si-NC, células positivas TUNEL, expresión de proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 se redujeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (todos P < 0,05). Versus el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, células positivas TUNEL, expresión de proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 aumentaron en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P < 0,05).

La Restauración de miR-499-5p o Depleción de Sox6 Disminuye Contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 en BALF y Tejidos Pulmonares de Ratones con Lesión Pulmonar Inducida por Sepsis

Los resultados de ensayo ELISA y Western blot mostraron que (Fig. 4a-g): contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaron en el grupo modelo relativo al grupo sham (todos P < 0,05). Versus los grupos NC agomir y si-NC, contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 disminuyeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (todos P < 0,05). Versus el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaron en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P < 0,05).

La Restauración de miR-499-5p o Depleción de Sox6 Aumenta Actividades de SOD, CAT y GSH-Px y Reduce Contenidos de MDA y MPO en Tejidos Pulmonares de Ratones con Lesión Pulmonar Inducida por Sepsis

Los resultados de detección de índices de estrés oxidativo presentaron que (Fig. 5a-e): versus el grupo sham, actividades de SOD, CAT y GSH-Px se deterioraron mientras contenidos de MDA y MPO aumentaron en el grupo modelo (todos P < 0,05). Versus los grupos NC agomir y si-NC, actividades de SOD, CAT y GSH-Px aumentaron mientras contenidos de MDA y MPO disminuyeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (todos P < 0,05). Versus el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, actividades de SOD, CAT y GSH-Px se suprimieron mientras contenidos de MDA y MPO aumentaron en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P < 0,05).

miR-499-5p Dirige Directamente a Sox6

Predecimos a través del sitio web bioinformático TargetScan que había sitios de unión dirigidos entre miR-499-5p y SOX4/6. Usando RT-qPCR, se encontró que comparado con el grupo sham, la expresión de SOX2/4/6 aumentó en el grupo modelo, y la expresión de SOX6 aumentó principalmente (todos P < 0,05); versus el grupo NC agomir, el grupo miR-499-5p agomir demostró sin cambio en expresión de SOX2 mientras mostró reducción en expresión de SOX4, principalmente disminuyó SOX6 (Archivo adicional 1: Fig. S1a, b). Por tanto, finalmente seleccionamos SOX6 como gen objetivo de miR-499-5p. El sitio web de predicción biológica (https://www.targetscan.org/vert_72/) reveló que miR-499-5p podría dirigir a Sox6 (Fig. 6a). El ensayo de gen reportero de luciferasa dual demostró que (Fig. 6b) versus el grupo control, la actividad de luciferasa fue obviamente destruida tras co-transfectar vector pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT y miR-499-5p agomir en células TC-1 (P < 0,05), mientras que la actividad de luciferasa no mostró diferencia distinta tras co-transfectar miR-499-5p agomir con vector pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT o agomir-NC co-transfectado con vector pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT (P > 0,05), sugiriendo que miR-499-5p podría unirse directamente a Sox6 3'UTR WT, e inhibir la actividad de luciferasa.

Discusión

La sepsis es una causa crítica de shock y síndrome de disfunción multiorgánica, entre los cuales la LPA es la complicación orgánica más frecuente y significativa. La LPA inducida por sepsis aparece no solo la más temprana, la mayor incidencia, sino que también progresa rápidamente, la tasa de fatalidad es alta, y no hay terapia efectiva en la actualidad. Un estudio previo ha propuesto que la up-regulación de miR-218 atenuó la secreción de factores inflamatorios y previno la lesión pulmonar inducida por sepsis. Además, promover los niveles de miR-146a podría reducir la inflamación en LPA y la restauración de miR-125b mejora la supervivencia de ratones con LPA y suprime la inflamación. Aunque estudios han destacado el papel de miARN en lesión pulmonar, el mecanismo detallado de miR-499-5p en lesión pulmonar inducida por sepsis ha sido escasamente investigado, por tanto nos centramos en miR-499-5p para descubrir su potencial terapéutico en LPA inducida por sepsis. También, un estudio ha proporcionado una prueba de que el aumento de Sox6 estuvo involucrado en apoptosis cardíaca inducida por sepsis. Se deben hacer esfuerzos para entender profundamente la lesión pulmonar inducida por sepsis. Nuestro objetivo es discutir el efecto protector de miR-499-5p dirigiéndose a Sox6 en ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis.

La relación H/S de tejidos pulmonares se calculó en nuestro estudio, y se evaluó la expresión de Sox6 y miR-499-5p en tejidos pulmonares de ratón. Los resultados mostraron que la relación H/S y Sox6 aumentaron mientras miR-499-5p disminuyó en tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. Un estudio reciente ha propuesto que la expresión de miR-499-5p en pacientes con sepsis leve, sepsis severa y shock séptico disminuyó dramáticamente relativa a la de controles normales. Otro estudio ha presentado que la expresión de miR-499-5p disminuyó marcadamente en tejidos de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y se vinculó a malos resultados clínicos. Se reporta que la expresión de Sox6 aumentó en tejidos de cáncer de pulmón en comparación con tejidos normales. Similarmente, un estudio previo ha revelado que la expresión de Sox6 fue notablemente elevada en tejidos renales de ratones con enfermedad renal diabética. Nuestro estudio también presentó que miR-499-5p dirigió directamente a Sox6. Un hallazgo importante fue que Sox6 es un gen objetivo de miR-499. Otro estudio proporcionó datos de que Sox6 era un gen objetivo de miR-499-5p, y la restauración de miR-499-5p suprimió la expresión de Sox6. Sin embargo, la relación objetivo de miR-499-5p y Sox6 en tejidos pulmonares de ratones sépticos no ha sido descubierta aún.

Además, se reveló que la restauración de miR-499-5p o depleción de Sox6 alivió la patología de tejidos pulmonares, redujo la puntuación de lesión pulmonar, fibras de colágeno y grado de fibrosis pulmonar, y redujo células positivas TUNEL, expresión de proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 en tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. Se ha sugerido previamente que la up-regulación de miR-499-5p suprime la proliferación celular y promueve apoptosis in vivo e in vitro de CPNM. Otro estudio ha verificado que la restauración de miR-499-5p y depleción de Sox6 atenuaron la apoptosis celular inducida por hipoxia/reoxigenación y redujeron la expresión de Caspasa-3. Se presentó que la down-regulación de Sox6 alivia la lesión patológica y reprime la apoptosis neuronal en tejidos hipocampales de enfermedad de Alzheimer. Además, un estudio reveló que la depleción de Sox6 inhibió la apoptosis celular inducida por alta glucosa y fibrosis intersticial renal en células mesangiales renales de ratón. Otro estudio demostró que la baja expresión de Sox6 disminuyó la actividad de Caspasa-3 y el porcentaje de células apoptóticas en células P19CL6 de ratón. Además, verificamos que la restauración de miR-499-5p o depleción de Sox6 redujo contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 en BALF y tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. Xia et al. iluminaron que los niveles de TNF-α e IL-6 aumentaron dramáticamente en ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. Un estudio ha demostrado que la baja expresión de Sox6 disminuye la reacción inflamatoria en tejidos hipocampales de enfermedad de Alzheimer. Otro resultado en este estudio implicó que la restauración de miR-499-5p o depleción de Sox6 aumentó actividades de SOD, CAT y GSH-Px así como redujo contenidos de MDA y MPO en tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. Se presentó que la LPA inducida por CLP se caracterizó por inflamación en morfología, relación H/S aumentada, concentración de proteína elevada en BALF, mayor nivel de contenidos de MPO y MDA así como menor nivel de actividades de SOD, GSH-Px y CAT en pulmones tras CLP. Se sugirió que la actividad de SOD y CAT disminuyeron en LPA inducida por sepsis en ratones. Además, un estudio reportó que la sobreexpresión de miR-499-5p y baja expresión de Sox6 disminuyeron el nivel de MDA.

Conclusiones

En conclusión, encontramos que la alta expresión de miR-499-5p puede atenuar la apoptosis de células de tejidos pulmonares e inhibir la inflamación de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis mediante la depleción de Sox6, lo que puede tener importantes implicaciones terapéuticas en el tratamiento de la lesión pulmonar inducida por sepsis. No obstante, se necesitan investigaciones clínicas para detectar la eficacia para el tratamiento de la lesión pulmonar inducida por sepsis.