La restauración del microRNA-499-5p protege a los ratones con lesiones pulmonares inducidas por sepsis mediante la selección de Sox6

Materiales y métodos

Cumplimiento de los estándares éticos

Todos los experimentos con animales se ajustaron a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue autorizado por el Comité de Ética de Experimentos con Animales del Hospital Municipal de Weihai, Facultad de Medicina de Cheeloo, Universidad de Shandong.

Animales de experimentación

Se adquirieron ratones macho sanos de grado BABL / c libres de patógenos específicos (de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 18 a 22 g) en el centro de animales experimentales de la Universidad de Shandong (Shandong, China). El ambiente se fijó en 24 ± 2 ° C con 12 ciclos de luz-oscuridad alternativamente. Los ratones se trataron con acceso libre a comida aséptica y agua esterilizada. Los experimentos se iniciaron después de la alimentación adaptativa durante 7 días.

Establecimiento del modelo de lesión pulmonar inducida por sepsis mediante ligadura y punción cecal (CLP) en ratones

Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en 2 grupos:el grupo simulado ( n =8) y el grupo modelo. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 12 h antes de la operación y luego se anestesiaron con pentobarbital sódico al 1% (70 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal. Se observó el efecto de la anestesia; se notó la respiración y los latidos del corazón de los ratones. La cabeza y las extremidades de los ratones se fijaron en posición supina y la piel abdominal se preparó y desinfectó con bolas de algodón yodóforo. Los ratones del grupo modelo se trataron con una incisión longitudinal (1,0 cm) en el segmento medio de la línea media abdominal, se abrió la cavidad abdominal y se extrajo el ciego de la cavidad abdominal evitando lesionar los vasos mesentéricos. Se ligó con un hilo de seda 1–0 a la mitad del extremo del ciego y se pinchó el ciego en el margen contralateral del mesenterio con una aguja de punción No. 16. Se extruyó una cantidad adecuada de contenido intestinal, se volvió a colocar el ciego y se suturó la incisión. Después de abrir la cavidad abdominal, a los ratones del grupo simulado se les extrajo solo el ciego y luego se volvió a colocar el ciego. Los ratones se inyectaron por vía subcutánea con 1 ml de solución de cloruro de sodio al 0,9% después de la operación, se separaron en jaulas y se alimentaron de forma rutinaria.

Transfección en vivo

Antes del modelado, los ratones se asignaron a 7 grupos ( n =8):el grupo modelo, el grupo agomir miR-499-5p, el grupo control negativo (NC) agomir, el grupo ARN interferente pequeño (si) -Sox6, el grupo si-NC, el grupo miR-499-5p agomir + Grupo de sobreexpresión (oe) -Sox6 y el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Una hora antes del modelado, se trató a los ratones según el agrupamiento. Los ratones se anestesiaron con pentobarbital sódico al 1% mediante inyección intraperitoneal, luego se fijaron en una posición supina inclinada de 45 ° y se movió la lengua de los ratones al otro lado de la boca para asegurar la permeabilidad del tracto respiratorio. La piel anterior del cuello de los ratones se desinfectó y cortó para exponer la tráquea. El complejo de transfección (50 μL) fue absorbido por un micromuestreador (se goteó de acuerdo con el grupo, se goteó la misma cantidad de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el grupo modelo) y luego se goteó lentamente en la tráquea. Después de la transfección, los ratones se rotaron verticalmente y el complejo de transfección se distribuyó por completo en los pulmones [15]. Durante el proceso de transfección, se observaron los latidos respiratorios y cardíacos de los ratones. Si ocurría el paro respiratorio y cardíaco, la transfección se detuvo inmediatamente y el tracto respiratorio no se obstruyó. La transfección continuó cuando la respiración y los latidos del corazón de los ratones estaban estables. MiR-499-5p agomir y su NC, así como los correspondientes plásmidos de Sox6, se compraron en Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Después de la transfección, los ratones se separaron en jaulas y se alimentaron durante 1 día, y luego se sacrificaron. Los ratones se anestesiaron con pentobarbital sódico al 1% mediante inyección intraperitoneal, se fijaron en posición supina y luego se sacrificaron mediante venesección de la aorta abdominal. Se desinfectó localmente la piel de los ratones, se abrió la cavidad torácica, se ligaron la tráquea y el bronquio principal derecho, se desconectó el bronquio principal derecho y se extrajo el pulmón derecho. El lóbulo inferior del pulmón derecho se colocó en formalina neutra al 10% para examen patológico, el lóbulo medio se pesó rápidamente para calcular el peso húmedo (W) y se horneó a 56 ℃, y el peso seco (D) se calculó después de 72 h. así se calculó la relación W / D. El lóbulo superior derecho se almacenó en nitrógeno líquido para la detección de ARNm y proteínas. El pulmón izquierdo se lavó tres veces con 0,4 ml de solución salina normal y se recogió aproximadamente 1 ml de líquido de lavado broncoalveolar (BALF), se trasladó a un tubo Eppendorf (EP) de 1,5 ml y se colocó en hielo. BALF se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min y se transfirió a un nuevo tubo EP, luego se almacenó a -80 ℃ para la detección de factores inflamatorios.

Además, los ratones se dividieron en 3 grupos ( n =10 / grupo):grupo simulado, grupo modelo y grupo agomir miR-499-5p (se instilaron 50 μl de agomir miR-499-5p en la tráquea 1 h antes de la cirugía). La tasa de supervivencia se controló cada 12 h, en total durante 7 d. Se observó el estado de supervivencia de los ratones en 7 días y se determinó la toxicidad de miR-499-5p [16].

Puntuación de tinción y lesiones con hematoxilina-eosina (H&E)

Los tejidos pulmonares se prepararon en secciones de parafina, se tiñeron con H&E y se observaron bajo un microscopio óptico. La lesión pulmonar se puntuó (congestión alveolar, hemorragia, infiltración o agregación de neutrófilos en la cavidad alveolar o en la pared del vaso, engrosamiento de la pared alveolar y / o formación de membrana hialina) mediante el sistema de puntuación patológica para la lesión pulmonar emitido por la American Thoracic Society. 0 puntos indicaron lesiones muy leves o nulas; 1 punto indicó lesiones leves; 2 puntos indicaron lesiones moderadas; 3 puntos indicaron lesiones graves; 4 puntos indicaron lesiones muy graves. La puntuación total de los cuatro elementos representó la puntuación total de la lesión pulmonar [17].

Puntuación y tinción de Masson

Los tejidos pulmonares se convirtieron en secciones de parafina (4 µm) y se trataron con tinción de Masson [18]. Las fibras de colágeno, el moco y el cartílago eran azules, el citoplasma, el músculo, la celulosa y la glía eran rojos y los núcleos celulares eran de color negro azulado. En el sistema de puntuación semicuantitativo de Ashcroft [19], 0 puntos indicaron pulmón normal; 1 punto indicó engrosamiento fibroso leve de la pared alveolar o bronquial; 3 puntos indicaron engrosamiento moderado de la pared alveolar o bronquiolar sin daño a la estructura pulmonar; 5 puntos indicaron empeoramiento de la fibrosis acompañado de daño a la estructura pulmonar, formando bandas o masas de fibras; 7 puntos indicaron daño severo a la estructura pulmonar y grandes áreas de fibrosis, formando bandas o grumos de fibras; 8 puntos indicaron todos los empaquetamientos fibrosos regionales.

Tinción de marcación de extremos de desoxinucleotidiltranserasa mediada por desoxiuridina trifosfato-biotina Nick (TUNEL)

La apoptosis de los tejidos pulmonares se probó con el kit TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se observó con un microscopio óptico. Las células apoptóticas se tiñeron de marrón en el núcleo. El índice de apoptosis indicó el porcentaje de células TUNEL-positivas [20].

Inmunohistoquímica

Las secciones de tejido pulmonar se desparafinaron con xileno, se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% y se bloquearon con suero de cabra. Luego, se usaron Caspasa-3 (ab13847, 1:500), Caspasa-9 (ab32539, 1:250) y SOX6 (ab30455, 1:500, todos de Abcam, MA, EE. UU.) Como anticuerpos para las secciones de inmunotinción. Se utilizó un microscopio óptico (Leica Microsystems, IL, EE. UU.) Para capturar imágenes que luego se analizaron con el software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, EE. UU.) [21].

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR)

Se adoptó el kit OMEGA (Solarbio science &technology Co., Ltd., Beijing, China) para la extracción de ARN total en los tejidos pulmonares y la determinación de la concentración de ARN. El ADN complementario (ADNc) se compuso mediante transcripción inversa en línea con el kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.). Los cebadores fueron diseñados por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.), Como se muestra en la Tabla 1. La reacción de PCR se llevó a cabo de acuerdo con el kit FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). El experimento fue analizado cuantitativamente por 2 ^{- △△ Ct} método. U6 fue el control de carga de miR-499-5p, y GAPDH fue el parámetro interno de otros genes [22].

Análisis de Western Blot

La proteína total se recogió usando tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación para tratar tejidos pulmonares. La concentración de proteína total se midió mediante el método del ácido bicinconínico. La muestra de proteína (30 μg) se procesó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10%, se transfirió a la membrana de fluoruro de polivinilideno, se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% y se hizo reaccionar con anticuerpos primarios Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspasa -3 (9661, 1:1000, Tecnología de señalización celular, MA, EE. UU.), Caspasa-9 (9502, 1:1000, Tecnología de señalización celular), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam ), interleucina-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, EE. UU.), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) y GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotecnología, Inc., CA, EE. UU.). Luego, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario (1:2000) y se desarrolló mediante quimioluminiscencia mejorada [23].

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en BALF se determinaron mediante un kit de ELISA (Boster, Hubei, China). La determinación colorimétrica se realizó a 450 nm.

Detección de índices de estrés oxidativo

Los tejidos pulmonares en nitrógeno líquido se pesaron y diluyeron en cierta proporción de solución salina en condiciones de baja temperatura, luego se homogeneizaron y centrifugaron a 4 ℃, 3000 r / min durante 20 min a baja temperatura, y se tomó el sobrenadante para su determinación. La actividad de la mieloperoxidasa (MPO) se evaluó mediante el kit de detección de MPO (Instituto de Bioingeniería NanJing JianCheng, Nanjing, China), y se analizaron malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSH-Px) y catalasa (CAT) por kits proporcionados por JianCheng Bioengineering Institute.

Ensayo génico indicador de luciferasa dual

Sox6 puede ser el gen diana de miR-499-5p que fue predicado por un sitio web biológico (http://www.targetscan.org/vert_72/). Había cuatro sitios de unión entre miR-499-5p y la región 3 'sin traducir del ARNm de Sox6 (UTR). Los vectores pmiR-RB-REPORT-Sox6 de tipo salvaje (WT) y pmiR-RB-REPORT-Sox6 de tipo mutante (MUT) fueron construidos por Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China), y los plásmidos indicadores de luciferasa correspondientes fueron construidos por generado. Células TC-1 (células epiteliales pulmonares de ratones, 1 × 10 ⁵ células / pocillo, Shanghai Yiyan Biology Technology Co., Ltd., Shanghai, China) se sembraron en una placa de 24 pocillos y se transfectaron con miR-499-5p agomir o agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT o pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT a través de Lipofectamine2000. Se aplicó un sistema de ensayo del gen indicador de luciferasa dual (Promega, WI, EE. UU.) Para medir la actividad de la luciferasa.

Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron con el software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EE. UU.). Los datos de medición se transmitieron por media ± desviación estándar. t realizó comparaciones entre dos grupos prueba, las comparaciones entre múltiples grupos se evaluaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), y se utilizó la prueba post hoc de Tukey para la comparación por pares después del análisis ANOVA. La curva de supervivencia se realizó mediante el método de Kaplan-Meier. P valor <0.05 fue indicativo de una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

La relación W / D y Sox6 aumentan mientras que miR-499-5p disminuye en los tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis

Se probó la toxicidad de miR-499-5p en ratones para detectar el tiempo de supervivencia de los ratones sépticos. Los resultados mostraron (Fig. 1a) que la tasa de supervivencia dentro de los 7 días de los ratones en el grupo simulado fue del 100%, y la de los ratones sépticos se redujo. Se mejoró la tasa de supervivencia de los ratones sépticos después del tratamiento con miR-499-5p. Los resultados de la relación W / D de los tejidos pulmonares demostraron que (Fig. 1b):en comparación con el grupo simulado, la relación W / D aumentó en el grupo modelo ( P <0,05). En comparación con el grupo agomir NC y el grupo si-NC, la relación W / D se redujo en el grupo agomir miR-499-5p y el grupo si-Sox6 (ambos P <0,05). La relación W / D aumentó notablemente en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 en relación con el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC ( P <0.05).

La relación W / D y Sox6 aumentan, mientras que miR-499-5p disminuye en tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. un Curva de supervivencia de ratones realizada por Kaplan-Meier. b Relación W / D de tejido pulmonar en cada grupo. c Expresión de miR-499-5p en tejidos pulmonares de ratones. d Expresión de ARNm de Sox6 en tejidos pulmonares de ratones. e Banda de proteína de Sox6 por análisis de transferencia Western. f Expresión de proteínas de Sox6 en tejidos pulmonares de ratones. g Inmunohistoquímica Sox6 de tejidos pulmonares de ratones. (a) P <0,05 frente al grupo simulado. (b) P <0,05 frente al grupo agomir NC. (c) P <0,05 frente al grupo si-NC. (d) P <0,05 frente al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Los datos de medición se representaron como media ± desviación estándar, y los datos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey

Se detectó la expresión de MiR-499-5p y Sox6 y encontramos que (Fig. 1c-f):en contraste con el grupo simulado, miR-499-5p se redujo y Sox6 aumentó en el grupo modelo (ambos P <0,05). En relación con el grupo agomir NC, miR-499-5p aumentó y Sox6 disminuyó en el grupo miR-499-5p agomir (ambos P <0,05). Frente al grupo si-NC, Sox6 deprimido en el grupo si-Sox6 ( P <0,05). En comparación con el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, Sox6 se elevó drásticamente en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0.05).

El contenido de proteína de Sox6 en tejidos pulmonares de ratones sépticos se determinó mediante inmunohistoquímica (Fig. 1g). Se observó que, en comparación con el grupo simulado, la expresión de la proteína Sox6 aumentó en el grupo Modelo ( P <0,05); En comparación con el grupo agomir NC y el grupo si-NC, se examinó una menor expresión de la proteína Sox6 en el grupo agomir miR-499-5p y el grupo si-Sox6 (ambos P <0,05); En relación con el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, la expresión de la proteína Sox6 mejoró en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0.05).

MiR-499-5p restaurado o Sox6 empobrecido alivia la patología de los tejidos pulmonares, reduce la puntuación de lesión pulmonar, las fibras de colágeno y el grado de fibrosis pulmonar en la lesión pulmonar inducida por sepsis Ratones

Los resultados de la tinción HE presentaron que (Fig. 2a):en el grupo simulado, la estructura del tejido pulmonar estaba intacta, el tabique alveolar se manifestaba básicamente sin edema ni inflamación y la cavidad alveolar estaba despejada. En el modelo, agomir NC, si-NC y miR-499-5p grupos agomir + oe-Sox6, se pudo observar exudación, edema y hemorragia en la mayoría de las cavidades alveolares de los tejidos pulmonares, y se mostró una infiltración masiva de células inflamatorias en el intersticial pulmonar. En los grupos miR-499-5p agomir, si-Sox6 y miR-499-5p agomir + oe-NC, la lesión de los tejidos pulmonares se redujo en comparación con el grupo modelo.

MiR-499-5p restaurado o Sox6 empobrecido alivia la patología de los tejidos pulmonares, reduce la puntuación de lesión pulmonar, las fibras de colágeno y el grado de fibrosis pulmonar en ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. un Resultados de la tinción de HE en tejidos pulmonares de ratones. b La puntuación de la lesión del tejido pulmonar de los ratones de cada grupo. c Tinción de Masson de tejido pulmonar en ratones. d Las puntuaciones de fibrosis pulmonar de los ratones de cada grupo. (a) P <0,05 frente al grupo simulado. (b) P <0,05 frente al grupo agomir NC. (c) P <0,05 frente al grupo si-NC. (d) P <0,05 frente al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Los datos de medición se representaron como media ± desviación estándar, y los datos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey

La puntuación de lesión pulmonar de ratones y la puntuación semicuantitativa de Ashcroft mostraron que (Fig.2b, d):en relación con el grupo simulado, la puntuación de lesión pulmonar y el grado de fibrosis pulmonar obviamente mejoraron en el grupo modelo ( P <0,05). En comparación con el grupo agomir NC y el grupo si-NC, la puntuación de la lesión pulmonar y el grado de fibrosis pulmonar se redujeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (ambos P <0,05). En contraste con el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, la puntuación de la lesión pulmonar y el grado de fibrosis pulmonar aumentaron notablemente en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0.05).

Los resultados de la tinción de Masson revelaron que (Fig. 2c):en el grupo simulado, los tejidos pulmonares de los ratones contenían una pequeña cantidad de fibras de colágeno azul. En el modelo, los grupos agomir NC, si-NC y miR-499-5p agomir + oe-Sox6, aumentaron las fibras de colágeno. En el grupo miR-499-5p agomir, el grupo si-Sox6 y el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, las fibras de colágeno disminuyeron en comparación con el grupo modelo.

MiR-499-5p restaurado o Sox6 empobrecido reduce las células TUNEL positivas, la expresión de la proteína caspasa-3 y caspasa-9 en tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis

Los resultados de inmunohistoquímica y tinción de Western blot, TUNEL indicaron que (Fig. 3a-f):el núcleo normal era azul y el núcleo apoptótico era marrón en diferentes tonos. En comparación con el grupo simulado, las células TUNEL positivas, la expresión de las proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 mejoraron en el grupo modelo (todas P <0,05). Frente a los grupos agomir NC y si-NC, las células TUNEL positivas, la expresión de las proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 se redujeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (todos P <0,05). En comparación con el grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, las células TUNEL positivas, la expresión de las proteínas Caspasa-3 y Caspasa-9 aumentaron en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P <0.05).

El miR-499-5p restaurado o el Sox6 empobrecido reducen las células TUNEL positivas, la expresión de la proteína Caspasa-3 y Caspasa-9 en tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. un Células positivas para TUNEL en tejidos pulmonares de ratones. b Número de células TUNEL positivas en tejidos pulmonares de ratones. c Inmunohistoquímica de Caspasa-3 y Caspasa-9 en tejido pulmonar de ratones; d Valor medio de DO de Caspasa-3 y Caspasa-9 en tejido pulmonar de ratones. e Bandas proteicas de Caspasa-3 y Caspasa-9 en tejidos pulmonares de ratones. f Expresión de las proteínas caspasa-3 y caspasa-9 en tejidos pulmonares de ratones de cada grupo. (a) P <0,05 frente al grupo simulado. (b) P <0,05 frente al grupo agomir NC. (c) P <0,05 frente al grupo si-NC. (d) P <0,05 frente al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Los datos de medición se representaron como media ± desviación estándar, y los datos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey

MiR-499-5p restaurado o Sox6 empobrecido disminuye el contenido de TNF-α, IL-1β e IL-6 en BALF y tejidos pulmonares de una lesión pulmonar inducida por sepsis Ratones

Los resultados del ensayo ELISA y Western blot mostraron que (Fig. 4a-g):Los contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaron en el grupo modelo en relación con el grupo simulado (todos P <0,05). En comparación con los grupos agomir NC y si-NC, los contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 disminuyeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (todos P <0,05). Frente al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, los contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 se elevaron en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P <0.05).

El miR-499-5p restaurado o el Sox6 empobrecido reducen los contenidos de TNF-α, IL-1β e IL-6 en BALF y tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. un Contenido de TNF-α en BALF de ratones de cada grupo. b Contenido de IL-1β en BALF de ratones en cada grupo. c Contenido de IL-6 en BALF de ratones de cada grupo. d bandas de proteínas de TNF-α, IL-1β e IL-6 en tejidos pulmonares de ratones en cada grupo. e expresión proteica de TNF-α en tejidos pulmonares de ratones de cada grupo. f expresión proteica de IL-1β en tejidos pulmonares de ratones de cada grupo. G expresión proteica de IL-6 en tejidos pulmonares de ratones de cada grupo. (a) P <0,05 frente al grupo simulado. (b) P <0,05 frente al grupo agomir NC. (c) P <0,05 frente al grupo si-NC. (d) P <0,05 frente al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Los datos de medición se representaron como media ± desviación estándar, y los datos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey

MiR-499-5p restaurado o Sox6 empobrecido aumenta las actividades de SOD, CAT y GSH-Px, así como reduce el contenido de MDA y MPO en los tejidos pulmonares inducidos por sepsis Ratones con lesión pulmonar

Los resultados de la detección de índices de estrés oxidativo presentaron que (Fig. 5a-e):versus el grupo simulado, las actividades de SOD, CAT y GSH-Px se deterioraron mientras que los contenidos de MDA y MPO aumentaron en el grupo modelo (todos P <0,05). En comparación con los grupos agomir NC y si-NC, las actividades de SOD, CAT y GSH-Px aumentaron mientras que los contenidos de MDA y MPO se redujeron en los grupos miR-499-5p agomir y si-Sox6 (todos P <0,05). Frente al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, las actividades de SOD, CAT y GSH-Px se suprimieron mientras que los contenidos de MDA y MPO mejoraron en el grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P <0.05).

El miR-499-5p restaurado o el Sox6 empobrecido aumentan las actividades de SOD, CAT y GSH-Px, así como también reducen los contenidos de MDA y MPO en tejidos pulmonares de ratones con lesión pulmonar inducida por sepsis. un Actividad de SOD en tejidos pulmonares de ratones. b Contenido de MDA en tejido pulmonar de ratones. c Actividad de GSH-Px en tejidos pulmonares de ratones. d Actividad CAT en tejidos pulmonares de cada grupo de ratones. e Contenido de MPO en tejidos pulmonares de ratones. (a) P <0,05 frente al grupo simulado. (b) P <0,05 frente al grupo agomir NC. (c) P <0,05 frente al grupo si-NC. (d) P <0,05 frente al grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Los datos de medición se representaron como media ± desviación estándar, y los datos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey

miR-499-5p apunta directamente a Sox6

A través del sitio web de bioinformática TargetScan, predijimos que había sitios de unión específicos entre miR-499-5p y SOX4 / 6. Usando RT-qPCR, se encontró que en comparación con el grupo simulado, la expresión de SOX2 / 4/6 aumentó en el grupo modelo y la expresión de SOX6 aumentó principalmente (todas las P <0,05); En comparación con el grupo NC de agomir, el grupo de agomir miR-499-5p no demostró cambios en la expresión de SOX2, mientras que mostró una expresión de SOX4 reducida, en su mayoría SOX6 disminuida (archivo adicional 1:Fig. S1a, b). Por lo tanto, finalmente seleccionamos SOX6 como el gen diana de miR-499-5p. El sitio web de predicción biológica (http://www.targetscan.org/vert_72/) reveló que miR-499-5p podría apuntar a Sox6 (Fig. 6a). El ensayo del gen indicador de luciferasa dual demostró que (figura 6b) frente al grupo de control, la actividad luciferasa se destruyó obviamente después de que el vector pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT y miR-499-5p agomir cotransfectaran en células TC-1 ( P ( P > 0.05), lo que sugiere que miR-499-5p podría unirse directamente a Sox6 3′UTR WT y luego inhibir la actividad luciferasa.

miR-499-5p apunta directamente a Sox6. un La relación objetivo entre miR-499-5p y Sox6 predicada por un sitio web biológico. b Los resultados de la verificación del ensayo del gen indicador de luciferasa dual. * P <0,05 frente al grupo NC mímico. Los datos de medición se representaron como media ± desviación estándar, y t realizó comparaciones entre dos grupos. prueba

Discusión

La sepsis es una causa crítica de shock y síndrome de disfunción orgánica múltiple, entre los cuales la LPA es la complicación orgánica más frecuente y significativa [24]. La LPA inducida por sepsis no sólo parece ser la más temprana, la de mayor incidencia, sino que también progresa rápidamente, la tasa de letalidad es alta y no existe un tratamiento eficaz en la actualidad [25]. Un estudio anterior ha pretendido que la regulación positiva de miR-218 atenúa la secreción de factores inflamatorios y previene la lesión pulmonar inducida por sepsis [26]. Además, la promoción de los niveles de miR-146a podría reducir la inflamación en la ALI [27] y la restauración de miR-125b mejora la supervivencia de los ratones con ALI y suprime la inflamación [28]. Aunque los estudios han destacado el papel de los miRNA en la lesión pulmonar, el mecanismo detallado de miR-499-5p en la lesión pulmonar inducida por sepsis apenas se ha investigado, por lo que nos centramos en miR-499-5p para descubrir su potencial terapéutico en casos de sepsis inducida. ALI. Además, un estudio ha proporcionado una prueba de que el aumento de Sox6 estaba involucrado en la apoptosis cardíaca inducida por sepsis [10]. Efforts should be made to deeply understand sepsis-induced lung injury. We aim to discuss the protective effect of miR-499-5p targeting Sox6 on sepsis-induced lung injury mice.

The W/D ratio of lung tissues was calculated in our study, and the expression of Sox6 and miR-499-5p in mouse lung tissues was assessed. The results showed that W/D ratio and Sox6 were increased while miR-499-5p was decreased in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. A recent study has proposed that miR-499-5p expression in patients with mild sepsis, severe sepsis and septic shock was dramatically decreased relative that in normal controls [9]. Another study has presented that miR-499-5p expression was markedly declined in non-small cell lung cancer (NSCLC) tissues and linked to poor clinical outcomes [29]. It is reported that the Sox6 expression was raised in lung cancer tissues in comparison with normal tissues [30]. Similarly, a previous study has revealed that the expression of Sox6 was remarkably elevated in the kidney tissues of mice with diabetic kidney disease [31]. Our study also presented that miR-499-5p directly targeted to Sox6. An important finding was that Sox6 is a target gene of miR-499 [10]. Another study provided data of that Sox6 was a target gene of miR-499-5p, and restoration of miR-499-5p suppressed the expression of Sox6 [32]. However, the target relation of miR-499-5p and Sox6 in lung tissues of sepsis-induced mice has not been uncovered yet.

In addition, it was revealed that restored miR-499-5p or depleted Sox6 alleviated lung tissues pathology, reduced lung injury score, collagen fibers and the degree of pulmonary fibrosis, and reduced TUNEL positive cells, Caspase-3 and Caspase-9 protein expression in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It has been previously suggested that up-regulating miR-499-5p suppresses cell proliferation and promotes apoptosis in vivo and in vitro of NSCLC [29]. Another study has verified that restoring miR-499-5p and depleting Sox6 attenuated hypoxia/re-oxygenation-induced cell apoptosis and reduced Caspase-3 expression [32]. It was presented that down-regulating Sox6 alleviates the pathological injury and represses neuronal apoptosis in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Moreover, a study revealed that depletion of Sox6 inhibited high glucose-induced cell apoptosis and renal interstitial fibrosis in mouse renal mesangial cells [31]. Another study demonstrated that low expression of Sox6 declined the activity of Caspase-3 and the percentage of apoptotic cells in mouse P19CL6 cells [34]. In addition, we verified that restored miR-499-5p or depleted Sox6 declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in BALF and lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. Xia y col. illuminated that TNF-α and IL-6 levels were dramatically raised in sepsis-induced lung injury mice [35]. A study has demonstrated that low expression of Sox6 declines the inflammatory reaction in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Another result in this study implied that restored miR-499-5p or depleted Sox6 raised SOD, CAT and GSH-Px activities as well as reduced MDA and MPO contents in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It was presented that CLP-induced ALI was featured by inflammation in morphology, enhanced W/D ratio, raised protein concentration in BALF, higher level of MPO and MDA contents as well as lower level of SOD, GSH-Px and CAT activities in lungs after CLP [36]. It was suggested that the activity of SOD and CAT were decreased in sepsis-induced ALI in mice [37]. Furthermore, a study reported that the overexpressed miR-499-5p and low expressed Sox6 decreased the level of MDA [32].

Conclusion

In conclusion, we found that high expression of miR-499-5p can attenuate the apoptosis of lung tissues cells and inhibit inflammation of sepsis-induced lung injury mice via depleting Sox6, which may have important therapeutic implications in the treatment of sepsis-induced lung injury. Nevertheless, clinical researches are needed to detect the efficacy for the treatment of sepsis-induced lung injury.

Availability of data and material

No aplica.

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