Impacto de nanopartículas de sílice en expresión génica y metilación ADN en tejidos pulmonar y testicular

Resumen

La nanotecnología se ha desarrollado rápidamente y ahora se usa en muchas terapéuticas médicas de vanguardia. Sin embargo, existe preocupación creciente de que la exposición a nanopartículas (NPs) pueda inducir diferentes enfermedades sistémicas ya que los mecanismos epigenéticos se asocian con más y más enfermedades. El papel de la modificación epigenómica por NPs es importante para la etiología de enfermedades. Nuestro estudio tuvo como objetivo determinar los mecanismos epigenéticos de daño en células pulmonares y testiculares exponiendo células a NPs SiO₂. Usamos ratones machos C57BL/6 para caracterizar el efecto dañino de NPs SiO₂ en células pulmonares y testiculares así como el estado de metilación resultante en la región del dominio impreso Dlk1/Dio3. Las células A549 expuestas a NPs SiO₂ tuvieron apoptosis celular, y ratones machos expuestos a NPs SiO₂ tuvieron tejidos pulmonares y testiculares alterados. Los genes en los dominios impresos región Dlk1/Dio3 cambiaron en ambos tejidos; Dlk1, Rtl1 y Dio3 se sobreexpresan en testículo mientras Dlk1 y Dio3 también se sobreexpresan en tejidos pulmonares. La secuenciación PCR con bisulfito de pulmón y testículo de ratones machos adultos fueron mayormente hipometilados, con pocos CpGs hipermetilados. Estos hallazgos indican que las nanopartículas juegan papel importante en metilación ADN de genes impresos.

Antecedentes

El dióxido de silicio es un óxido de silicio con fórmula química SiO₂, encontrado comúnmente en naturaleza como cuarzo y en diversos ambientes orgánicos [1]. Las nanopartículas diseñadas han sido generalizadas en el rápido crecimiento y aplicación de nanotecnología en industrias de alta tecnología. Esta nanopartícula particular se usa ampliamente en gama de productos de consumo incluyendo electrónica, productos plásticos, médicos, cosméticos y materiales de recubrimiento debido a sus propiedades físico-científicas como gran área superficial específica, abundantes sitios reactivos, alta energía superficial, enlaces químicos insaturados, fuerte capacidad adsorción y fuerte tendencia a interactuar con metales y materia orgánica, alterando contaminantes y su transporte en ambiente [2]. La presencia de NPs SiO₂ en amplia gama de consumibles aumenta su probabilidad de ser liberadas en ambiente y entrar en contacto con población humana.

Estudios experimentales previos han mostrado que una instilación intratraqueal dosis única o inyecciones intraperitoneales múltiples de una especie nanopartícula metal y metal-óxido causan efectos tóxicos desde nivel celular a sistémico y orgánico [3]. El tratamiento con NPs SiO₂ reprime crecimiento de líneas celulares cáncer mama aumentando apoptosis y reduciendo motilidad celular. Además, la exposición a NPs SiO₂ perturba significativamente el receptor factor crecimiento epidérmico (EGFR) [4]. Cuando modelos rata se trataron con tres diferentes tamaños NPs TiO₂ y compararon con controles, el tratamiento fluido lavado broncoalveolar (BALF) con aerosoles aglomerados grandes (>100 nm) indujo respuesta inflamatoria aguda, mientras aerosoles aglomerados pequeños (<100 nm) produjeron daño oxidativo significativo y citotoxicidad [5].

El estudio de toxicidad nanopartículas en reproducción es campo creciente. Un estudio demostró que bajo misma dosis tratamiento, NPs Ni indujeron mayor toxicidad reproductiva en C. elegans que MPs Ni (micropartículas). Estas toxicidades reproductivas observadas en C. elegans incluyeron tamaño camada reducido, óvulo fertilizado y activación espermátide [6]. Hay evidencia creciente que ciertos efectos ambientales pueden pasarse a descendencia vía vías paternas sin cambios en genoma espermático [7, 8]. La información paterna existe no solo en genoma, sino también en marcadores epigenéticos específicos, contenido ARNm y ARN no codificante.

El estrés oxidativo es mecanismo importante en toxicidad nanopartículas, que puede desencadenar daño ADN, inflamación, desnaturalización proteínas y peroxidación lípidos [9]. Estos efectos biológicos son influenciados por propiedades fisicoquímicas nanopartículas, incluyendo tamaño, área superficial, forma, química superficial, funcionalización y solubilidad [10, 11]. Hay evidencia creciente que demuestra claramente la exposición a nanopartículas puede desencadenar alteraciones epigenéticas en tejidos y células incluso a dosis bajas, no citotóxicas [12, 13]. La epigenética es el estudio de cambios heredables en función génica que no involucran cambios en secuencia ADN incluyendo metilación ADN, impronta génica, modificaciones histonas y regulación por ARNs no codificantes [14]. Tales alteraciones epigenéticas están asociadas con desarrollo y progresión numerosos estados patológicos y enfermedades [15]. Por tanto, efectos epigenéticos son parte crucial de evaluación riesgo paciente a nivel celular.

El dominio impreso Dlk1/Dio3 contiene tres regiones diferencialmente metiladas (DMRs) conocidas que son metiladas paternamente: DMR intergénico (IG-DMR), DMR expresado maternamente 3 (Gtl2-DMR), y DMR Dlk1 [16]. Estudios previos sugieren que IG-DMR dicta estado metilación alélico del promotor DMR Gtl2, que luego controla expresión génica a través de todo el clúster [17]. El genoma ratón tiene gran número genes impresos en dominio Dlk1/Dio3 en región distal cromosoma 12. El IG-DMR ubicado entre gen impreso Dlk1 y Gtl2 está específicamente metilado en línea germinal masculina y regula expresión alélica específica parental de región gen impresa [18]. El estado metilación IG-DMR se establece antes del nacimiento y se mantiene así durante toda la vida del macho en línea germinal masculina durante diferenciación células germinales masculinas, significando metilación IG-DMR se mantiene en espermatogonias y espermatocitos de testículo maduro.

Nuestro objetivo fue encontrar cambios en expresión génica línea germinal masculina durante espermatogénesis antes de silenciamiento transcripcional y translational para explicar influencia paterna en descendencia a través de cambios ambientales. Factores ambientales pueden modificar modificaciones transcripcionales espermáticas, lo que puede llevar a alteraciones en desarrollo progenie. Para llevar a cabo esta investigación en nuestro trabajo, usamos líneas celulares y ratones como modelos para cribado efectos tóxicos NPs SiO₂. A nuestro conocimiento, este es el primer estudio demostrando mecanismos epigenéticos de regiones impresas Dlk1/Dio3 que nanopartículas causan daño en ambos tejidos pulmonar y testicular.

Métodos

Animal Experimental

El manejo animal se realizó de acuerdo con Guía Cuidado Uso Animales Laboratorio bajo protocolo correspondiente uso animal en Universidad Médica Nanjing. Ratones se obtuvieron de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Todos los animales se alojaron a 23 °C con ciclo luz 12 h. Agua esterilizada y pienso roedor consumidos por ratones ad libitum. Actividad y comportamiento ratones monitoreados diariamente. Tras 2 semanas, ratones inyectados nano-SiO₂ 12,5 mg/kg.

Químicos

Nano-SiO₂ (99,5% base traza metal, tamaño partícula 10-20 nm) se obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). Nanopartículas suspendidas en Medio RPMI 1640 para crear solución stock, dispersadas por vibración ultrasónica 20 min, diluidas a concentraciones apropiadas, y dispersadas otro 20 min.

Características NPs SiO₂

Tamaño y potencial zeta registrados usando Malvern Zetasizer Nano ZSP.

Extracción ARN y qRT-PCR

Muestras pulmón y testículo congeladas flash en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C tras ~4 h. Descongelamos muestras antes de extraer.

ARN total aislado de muestras usando 1 mL Reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies Co, EE. UU.). Mezcla ultrasonificada 80% potencia 5 min, añadido 0,2 mL cloroformo, centrifugado 12.000g/min a 4 °C 15 min. Luego, tres pasos purificación fenol/cloroformo añadidos para eliminar proteínas. Luego, absorbancia UV usada para medir contenido ARN y calidad cada muestra a 260 y 280 nm. Secuencias primers ARNm mostradas en Archivo adicional 1: Tabla S1 y S2. qRT-PCR realizado según instrucciones fabricante, como descrito previamente [19]. PCR tiempo real realizado usando SYBR Green (Vazyme). Ciclo PCR: desnaturalización inicial 95 °C 30 s, seguido 40 ciclos desnaturalización 95 °C 15 s, hibridación 60 °C 15 s, extensión 72 °C 30 s. Cantidad genes diana analizada usando método 2^-ΔCt tras normalización con β-actina.

Extracción ADN, Tratamiento Bisulfito, y PCR Secuenciación Bisulfito

ADN aislado de tejidos testicular y pulmonar usando kit ADN (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; EE. UU.) siguiendo recomendaciones fabricante. Conversión bisulfito 500 ng todo ADN genómico lograda usando kit (EpiTect® Bisulfite kit; Qiagen. No. 59104; EE. UU.) siguiendo recomendaciones fabricante. Diferentes oligonucleótidos metilación CpG diseñados usando software Methyl Primer Express v1.0 y secuencias son P1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGTAGTA-3', P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'; P2-F 5'-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3', P2-R 5'-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3'; P3-F 5'-TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3', P3-R 5'-ACCCATAACAAACCACAACA-3'; P4-F 5'-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3', P4-R 5'-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3'.

Cada muestra ADN amplificada por PCR: 2,5 μl 10× buffer PCR reacción mix con 500 ng ADN tratado bisulfito, 0,5 μl cada primer forward y reverse, 0,5 μl dNTP Mix, 0,5 μl rTaq (500 U, dNTP, Mg²⁺) (Takara Bio, Tokyo, Japón), adición ddH₂O hasta volumen 25 μl. Tras activación polimerasa 94 °C 10 min, seguido 40 ciclos: 30 s 94 °C, 30 s 58 °C, 1 min 72 °C, extensión final 72 °C 10 min.

Cultivo Celular y Tratamiento

Células A549 compradas ATCC (Manassas, VA, EE. UU.) cultivadas en 1640 suplementado 10% suero fetal bovino (FBS) a 37 °C 5% CO₂ en incubadora humidificada. Células sembradas placas 96 pozos, incubadas diferentes concentraciones NPs SiO₂: 62,5, 125, 250, 500, 1000, 2000 μg/ml 24 h.

Ensayo Viabilidad Celular

Viabilidad celular evaluada por ensayo proliferación CCK8. Células sembradas densidad 1,5 × 10⁴ por pozo placa 96 pozos incubadas overnight. Tras exposición NPs SiO₂ diferentes concentraciones, 100 μl CCK8 añadido cada pozo, células incubadas 30 min 37 °C permitir metabolismo CCK8. Finalmente, absorbancia determinada 450 nm. Tasas inhibición celular calculadas y transformadas IC₅₀ usando SPSS 15.0.

Análisis Estadístico

Todos cómputos realizados usando software SPSS 15.0. Comparaciones entre grupos hechas usando pruebas t no relacionadas y prueba chi-cuadrado Pearson para BSP. Datos presentados media ± DE. En todos casos, valor p < 0,05 considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización NPs SiO₂

Caracterizamos NPs SiO₂ bajo condiciones experimentales. Radio hidrodinámico promedio y potencial zeta NPs SiO₂ en medio cultivo fueron 371,77 ± 18,46 nm y 18,83 ± 2,12 mV respectivamente (Fig. 1).

Efecto NPs SiO₂ en Línea Celular A549

Para determinar toxicidad NPs SiO₂, realizamos prueba proliferación células A549, determinar IC₅₀ NPs SiO₂ en células A549. Como ilustra Fig. 1c, NPs SiO₂ disminuyen viabilidad células A549 manera dependiente concentración. Reducción viabilidad celular significativa en concentración NPs SiO₂ mayor 62,5 μg/ml (p < 0,001). IC₅₀ 24 h definido como concentración afecta 50% células tras 24 h exposición. IC₅₀ 24 h determinado para NPs SiO₂ fue 4942 μg/ml.

Efectos NPs SiO₂ en Pulmón y Testículo Murino

Determinamos si exposición NPs SiO₂ dosis 12,5 mg/kg peso corporal llevaría a daño membrana pulmonar e incluso daño testicular en nuestro modelo ratón. Como muestran figuras, exposición NPs SiO₂ llevó a cuerpo laminar disrumpido en secciones histológicas pulmón (Fig. 2a, b) y daño crestas mitocondriales comparado grupo control en testículo (Fig. 2c, d). Luego investigamos efectos pulmón y testículo NPs SiO₂ en activación impronta región impresa Dlk1/Dio3.

Expresión Genes Impresos en Pulmón y Testículo Murino

Para ilustrar cambios pulmón y testículo, detectamos genes impresos en estos tejidos. Elegimos 24 genes impresos; eran Dio3, Ddc, Dlk1, Gpr1, Gtl2, H19, Igf2, Igf2as, Igf2r, Inpp5f, Magel2, Magi2, Mest, Mir296, Mir298, Ndn, Nnat, Peg10, Plagl1, Pwcr1, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn, Snurf. Trece de estos genes expresados en ambos pulmón y testículo: Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn (Fig. 3a, b). Genes diferencialmente expresados foco principal fueron región impresa Dlk1/Dio3, que contiene Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3.

Expresión Región Impresa Dlk1/Dio3

Región impresa Dlk1/Dio3 contiene tres genes codificantes proteínas (Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3) en alelo heredado [20] (Fig. 4c). Para elucidar papel región Dlk1/Dio3 en respuesta tejido pulmón y testículo a tratamiento NPs SiO₂, analizamos patrón metilación DMR comparado controles. Diferentes genes son blanco metilación en pulmón y testículo. Expresión Dlk1 y Dio3 sobreexpresadas en ambos pulmones y testículo, mientras Rtl1 sobreexpresada solo en testículo (Fig. 4a, b).

Metilación Regiones DMR Dlk1/Dio3

Para investigar si expresión genes cambia respuesta metilación ADN, abordamos estado metilación esta región en pulmón y testículo ratón. En análisis metilación ADN, determinamos secuencias tres secciones islas CpG. En testículo, son hipometiladas; sin embargo, en isla CpG 1, son significativamente hipermetiladas (Fig. 5). En pulmón, metilación total igual testículo, mientras isla CpG 2 mostró hipermetilación (Fig. 6).

Discusión

Uso creciente nanomateriales ha planteado preocupaciones sobre impactos potenciales salud humana e impactos ambientales. Estudios previos demostraron NPs SiO₂ pueden causar daño pulmonar y cardiovascular, como inflamación pulmón y daño isquémico miocardio ratas viejas [21]. Además, nanopartículas pueden tener efecto líneas germinales, ya que tales células parecieron más sensibles efectos tóxicos Ag NPs y demostraron efectos adversos tras exposición dosis menores. Exposición Ag NP aumentó número anomalías observadas células espermáticas rata y redujo integridad tanto acrosoma como membrana plasmática además reducir actividad mitocondrial [22]. Nuestra investigación es parte serie estudios usando plataforma experimental evaluar potencial nanopartículas dirigirse organismos machos e incluso su descendencia no expuesta.

En nuestro previo estudio in vitro, reportamos exposición corto plazo algunas nanopartículas resulta apoptosis celular y expresión aberrante genes impresos en células TM-4 Sertoli. Estos hallazgos demuestran expresión anormal genes impresos puede ser mecanismo subyacente nanopartículas inducen toxicidad reproductiva [23]. Además, en nuestro previo estudio in vivo, algunos factores ambientales, como disruptores endocrinos, también promueven fenotipo o estado enfermedad no solo en individuo expuesto sino también en generaciones sucesivas progenie. Epimutaciones en línea germinal que se programan permanentemente pueden permitir transmisión fenotipos transgeneracionales epigenéticos [19]. Objetivo este estudio investigar cambios hechos estado epigenético por tratamiento NPs SiO₂ en modelo murino para sentar base mecanística efectos transgeneracionales masculinos.

Estado epigenético término usado definir modificaciones químicas ocurren dentro genoma sin cambiar secuencia ADN [24]. Mecanismos epigenéticos, incluyendo metilación ADN, genes impresos, modificaciones histonas, expresión ARN no codificante, pueden afectar función genómica en ambiente exógeno [25]. A nuestro conocimiento, nuestro estudio es primero investigar NPs SiO₂ induciendo toxicidad pulmón y testículo a nivel epigenético.

Primero examinamos toxicidad aguda NPs SiO₂ en células A549, línea celular epitelial pulmonar humana. Sin embargo, hallazgos ratones experimentales revelaron lesión células epiteliales tipo II laminar pulmón y lesión cresta mitocondrial testicular tras contacto NPs SiO₂ concentraciones ambientales [26]. Para entender mejor mecanismo patología pulmón y testículo, expresamos genes impresos. Impronta genómica se refiere silenciamiento un alelo parental en cigotos gametos dependiendo origen parental; este silenciamiento ocurre vía procesos epigenéticos como metilación ADN y/o modificación histonas [27]. Estudios previos mostrado expresión genes impresos dominio Dlk1/Dio3 importante para crecimiento fetal [28], momento pubertad humana [29], susceptibilidad enfermedad metabólica [30]. Estudios sugirieron IG-DMR dicta estado metilación alélico promotor DMR Gtl2, que luego controla expresión génica toda región Dlk1/Dio3 [17]. Función principal esta región control impresa es heredar metilación ADN impulsada células germinales como señal gamética, y luego mantener posteriores patrones metilación alélica específica dentro células somáticas [31]. Nuestro estudio demostró NPs SiO₂ inducen cambios expresión región Dlk1/Dio3 tanto tejidos pulmón y testículo. En región Dlk1/Dio3, genes expresados paternamente (Dlk1, Rtl1, Dio3) son particularmente anormales comparados controles tras tratamiento NPs. Resultados secuenciación bisulfito muestran diferentes niveles hipometilación pulmón y testículo. Estado metilación IG-DMR generalmente menor tejidos tratados, e esta hipometilación puede representar mecanismo expresión diferencial genes impresos.

Conclusiones

En conclusión, nuestros resultados indican exposición NPs SiO₂ puede inducir importantes cambios metilación ADN que desencadenan daño celular y estos cambios son altamente importantes para expresión clúster genes impresos Dlk1/Dio3. Importantemente, cambios metilación ADN afectan tanto tejidos pulmón como testículo. Estos resultados juegan papel importante en nuestra futura investigación examinando efectos epigenómicos nanopartículas heredados por descendencia modelos expuestos y clarificación mecanismos moleculares median tales alteraciones epigenéticas.

Abreviaturas

BALF:

Fluidos lavado broncoalveolar

CCK-8:

Kit conteo celular-8

DMRs:

Regiones diferencialmente metiladas

EGFR:

Receptor factor crecimiento epidérmico

IG-DMR:

DMR intergénico

MPs:

Micropartículas

NPs:

Nanopartículas