Entrega dirigida de paclitaxel e inhibidor de P-gp mediante nanoliposomas con anticuerpo PD-L1 para superar cáncer gástrico multirresistente

Resumen

La multirresistencia a fármacos (MDR) basada en transportadores de eflujo dependientes de ATP (glucoproteína P (P-gp)) sigue siendo un obstáculo mayor en el tratamiento quimioterápico exitoso. Aquí investigamos el potencial de nanoliposomas conjugados con anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 (mAb) para servir como plataforma de entrega dirigida para la co-entrega de paclitaxel (PTX) e inhibidor específico del transporte de P-gp (TQD, tariquidar) en cánceres gástricos resistentes a fármacos. Dos fármacos, PTX y TQD, se co-cargaron en un solo vehículo en una proporción precisa para mejorar la perspectiva del efecto quimioterapéutico combinado. El estudio de captación celular indicó que PD-PTLP tuvo mayor eficiencia de internalización en células SGC7901/ADR sobreexpresando receptor PD-L1 que PTLP no dirigido. La mayor sinergia se observó en fracción de peso 1/0.5 (PTX/TQD) y la combinación de PTX y TQD resultó en efecto sinérgico obvio comparado con fármacos individuales. Nuestros resultados in vitro mostraron que TQD fue efectivo revirtiendo la multirresistencia en células SGC7901/ADR. El valor IC50 de PD-PTLP fue 0.76 μg/ml comparado con 6.58 μg/ml y 7.64 μg/ml para PTX y TQD, respectivamente. PD-PTLP desencadenó niveles significativamente mayores de especies reactivas de oxígeno (ROS) y apoptosis celular comparado con PTX o TQD libres. Además, el estudio antitumoral in vivo mostró que la quimioterapia combinada de PD-PTLP mostró inhibición significativa de carga tumoral de tumores xenoinjertos resistentes a fármacos con células TUNEL-positivas significativamente mayores. Además, PTX libre resultó en aumento significativo de niveles de AST y ALT mientras PD-PTLP no difirió significativamente del control indicando índice de seguridad. En general, creemos que la combinación de fármaco anticancerígeno con inhibidor de P-gp podría proporcionar una dirección potencial hacia el tratamiento de tumores gástricos resistentes a fármacos.

Introducción

Los tratamientos quimioterápicos actuales basados en régimen de fármaco único están lejos de ser perfectos y sufren efectos adversos severos a dosis altas y simultáneamente conducen al desarrollo de resistencia a fármacos [1]. La última década ha testificado la alta eficacia terapéutica de regímenes de fármacos combinados en tratamiento del cáncer [2]. La combinación de dos o más fármacos ha demostrado producir eficacia anticancerígena sinérgica debido a diferente acción farmacológica de fármacos combinados [3, 4]. Sin embargo, elegir la combinación correcta de fármacos depende de múltiples factores incluyendo tipo de célula cancerosa, fármacos hidrofílicos/hidrofóbicos, actividades bioquímicas y patrones farmacocinéticos de los fármacos. Entre todos, la combinación de fármacos es selectiva para tipos específicos de cánceres [5].

El cáncer gástrico es una carga de salud global y la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo. La prevalencia de cáncer gástrico es alta en Asia Oriental como Japón, Corea y China, con esta última reportando la tasa de mortalidad más alta en el mundo [6]. En promedio, 400,000 nuevos casos se registran cada año en China y la mayoría se diagnostican en etapas avanzadas/tardías [7, 8]. Se ha hecho tremendo progreso en estrategias de tratamiento; sin embargo, no mejoró la tasa de supervivencia y resultó en fallo terapéutico. El fallo del tratamiento se atribuye principalmente al desarrollo de quimiorresistencia y toxicidad severa de dosis de quimioterapia y recurrencia de episodios de cáncer gástrico [9]. Por tanto, existe una tarea urgente de mejorar la eficacia terapéutica y superar la metástasis y recurrencia del cáncer gástrico.

El paclitaxel (PTX) es uno de los fármacos importantes indicados en tratamiento de cánceres gástricos [10]. PTX inhibe la replicación celular interfiriendo con la degradación de microtúbulos llevando a arresto del ciclo celular. Sin embargo, la adquisición de multirresistencia (MDR) es un problema mayor entre el éxito de la quimioterapia [11, 12]. El eflujo dependiente de ATP mediado por transportadores transmembrana de la familia de casetes de unión a ATP (ABC) en la que la glucoproteína P (P-gp) se considera el factor abundante se sobreexpresa en cánceres gástricos [13]. De otra manera, PTX sirve como sustrato para receptores P-gp donde el eflujo de fármaco reducirá la concentración intracelular del fármaco llevando a baja eficacia y alta resistencia [14]. En este sentido, Tariquidar (TQD) es un inhibidor potente de tercera generación de P-gp y se ha reportado que revierte la sobreexpresión de receptores P-gp en varias células cancerosas [15, 16]. Sin embargo, reportes sugirieron que la administración de TQD debe terminarse temprano ya que impide la función de P-gp del sistema fisiológico normal. La expresión de P-gp es requerida para mantener la barrera hematoencefálica (BBB) y elimina toxinas de tejidos normales [17]. Dado que P-gp está presente en tejidos normales y actúa como barrera contra toxinas celulares, la inhibición no específica de PTX o TQD podría interferir potencialmente con funciones fisiológicas normales y llevar a toxicidad adversa. Además, PTX y TQD son fármacos altamente lipofílicos con solubilidad limitada en soluciones acuosas y sangre sistémica, necesitando un sistema de entrega de fármacos estable dirigido a cánceres gástricos en el cuerpo [18].

El sistema de entrega de fármacos (SDF) aumentó significativamente la concentración de fármacos encapsulados en tejidos cancerosos y ofreció liberación sostenida de fármaco por período prolongado [19]. En este sentido, el liposoma es uno de los portadores de fármacos más usados para mejorar la eficacia terapéutica en cánceres. Los liposomas ganaron importancia creciente debido a su biocompatibilidad, modificaciones estructurales de superficie, carga de fármacos hidrofílicos/lipofílicos y alta capacidad de carga de fármacos [20]. Los fármacos podían incorporarse establemente en la bicapa lipídica del liposoma y fácilmente dotarse de larga capacidad de circulación (PEGilación) por efecto de permeación y retención mejorada (EPR) [21]. Recientemente, se reportó la capacidad del liposoma para retener ratios múltiples de fármacos tras administración intravenosa [22]. Esta idea se demostró en 2017 tras aprobación de FDA, Vyxeos® (formulación liposomal) conteniendo ratios de citarabina:daunorubicina en tratamiento de leucemia [23]. Comparado con formulaciones no dirigidas, las formulaciones dirigidas por ligando eran muy atractivas y prospectivas. En este sentido, PD-1 es un receptor de superficie celular conocido por la regulación negativa del sistema inmune y suprime actividad inflamatoria de células T. La expresión de PD-L1 se ha reportado en 50% de pacientes con cáncer gástrico haciendo PD-L1 como receptor diana para internalización de nanopartículas [24, 25]. El anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 (mAb) podría unirse específicamente al dominio extracelular de proteína PD-L1 y podría ser una excelente estrategia terapéutica para mejorar la eficacia anticancerígena [26].

El objetivo principal del presente estudio fue mejorar la entrega de fármacos combinados, PTX y TQD para mejorar la eficacia anticancerígena contra cánceres gástricos. Para este propósito, se formuló nanoliposoma cargado con PTX y TQD conjugado con PD-L1 mAb y se evaluó para eficacia anticancerígena en condiciones in vitro e in vivo. La eficacia in vivo se evaluó en modelo xenoinjerto basado en células de cáncer gástrico e inmunohistoquímica (IHC) se realizó.

Conclusión

En conclusión, nuestro trabajo realizó terapia combinada contra tumor MDR por estrategia de entrega programada. Hemos demostrado el potencial de combinación de PTX e inhibidor de P-gp (TQD) en inhibir la carga tumoral de tumores xenoinjertos SGC7901/ADR multirresistentes. La co-entrega de PTX y TQD en un nanotransportador multifuncional permitió el control ratiométrico de fármacos anticancerígenos co-cargados, inhibió la bomba de eflujo P-gp y exhibió eficacia anticancerígena sinérgica. Creemos que la combinación de fármaco anticancerígeno con inhibidor de P-gp podría proporcionar una dirección potencial hacia el tratamiento de tumores resistentes a fármacos.

Materiales y métodos

Formulación de nanoliposomas conjugados con mAb anti-PD-L1 cargados con PTX/TQD

Fosfatidilcolina de huevo (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG), y DSPE-PEG2000-maleimida (DSPE-PEG2000-Mal) se mezclaron en solución de cloroformo en ratio molar de 3/2/0.5/0.25 junto con PTX y TQD y luego el solvente orgánico se evaporó usando evaporador rotatorio seguido de liofilización por 3 h. La película lipídica se hidrató con solución de sulfato de amonio 250 mM mantenida a pH 7.0. Los liposomas multilamelares grandes se sonicaron por 30 min en sonicador de baño (Branson ultrasonicbath, EE. UU.) mantenido a 65 °C. Los liposomas se dializaron contra gran volumen de agua destilada por estrictamente 1 h para intercambiar fármaco libre y componentes iniciales. Los liposomas se re-dispersaron en tampón fosfato salino (PBS, pH 7.4). El mAb anti-PD-L1 se conjugó al liposoma mezclando en ratio 8:1 (liposoma:mAb) e incubando a 4 °C por 4 h. El mAb anti-PD-L1 se conjugará al DSPE-PEG2000-Mal interactuando entre residuos sulfhidrilo en los anticuerpos a grupos maleimida C-terminales de liposomas. Los liposomas conjugados con PD-L1 se centrifugaron a 10,000 rpm por 10 min y el sobrenadante se removió y re-dispersó en tampón PBS y almacenó a 4 °C hasta análisis posterior. La cantidad de PTX y TQD encapsulada en el liposoma se evaluó por método HPLC. Se usó sistema HPLC Agilent Technologies modelo 1260 Infinity equipado con autosampler Agilent Technologies y detector de arreglo de diodos G1315D. La fase móvil consiste en mezcla de acetonitrilo/agua (70:30 v/v) mantenida a flujo de 1 ml/min. Se usó columna C18 (5 μm, 150 × 60 mm, ODS-3) para eluir las muestras y detectar a 227 nm. Previo a, liposoma cargado con PTX/TQD se disolvió en acetonitrilo y vortexó por 15 min, filtró a través de filtro 0.45 μm, y 10 μl de alícuota se inyectó en columna HPLC.

Análisis de distribución de tamaño y morfología de partícula

La distribución de tamaño y potencial zeta de formulaciones cargadas con fármacos se determinaron por Malvern zetasizer (UK) a 25 °C. Antes del experimento real, las dispersiones de nanopartículas se diluyeron 10× con agua destilada y el experimento se realizó en ángulo de detección de 90° en triplicado. La morfología de nanopartículas se evaluó por microscopio electrónico de transmisión (TEM). Las dispersiones de nanopartículas se diluyeron 10× con agua destilada y colocaron en rejilla de cobre recubierta de carbono y secaron usando lámpara IR y luego la muestra se evaluó por TEM (CM 30, Philips (Eindhoven, Países Bajos)) tras tinción con acetato de uranilo (1% p/v).

Análisis de perfil de liberación

El perfil de liberación de PTX y TQD de nanoliposoma se evaluó por método de diálisis. Para este propósito, 15 mg de polvo liofilizado de nanoliposomas conjugados con mAb anti-PD-L1 cargados con PTX y TQD (PD-PTLP) se disolvieron en 1 ml de agua destilada y sellaron en membrana de diálisis (PMCO 3.5 kDa) e inmersaron en 30 ml de tampón de liberación respectivo mantenido a 37 °C. En tiempos predeterminados, alícuotas de muestras se retiraron y reemplazaron con igual cantidad de tampón de liberación. El estudio continuó por 72 h. Las muestras se filtraron a través de filtro de jeringa 0.22 μm e inyectaron en columna HPLC y evaluaron por el método mencionado arriba.

Estudios de captación celular

Células SGC7901/ADR se cultivaron en medio modificado de Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FBS y 100 UI/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina bajo condición de atmósfera 5% CO₂ a 37 °C. Se usó microscopio confocal de barrido láser (BX61WI; Olympus, Tokyo, Japón) para evaluar la distribución celular y captación celular de PTLP y PD-PTLP en células SGC7901/ADR. Para este propósito, 1 × 10⁵ células se sembraron en cada pozo de placa de 12 pozos e incubaron por 18 h. Las células se expusieron luego con PTLP y PD-PTLP e incubaron por 3 h. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y fijaron con 4% paraformaldehído (PFA) por 10 min. Las células se lavaron de nuevo con PBS y tiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 10 min. Finalmente, las células se lavaron cuidadosamente y observaron bajo CLSM. El experimento competitivo sobre captación de PD-PTLP se realizó pretratando las células con mAb anti-PD-L1 libre por 30 min y lavando. Las células se dividieron en dos grupos, uno tratado con mAb anti-PD-L1 libre y otro no tratado con mAb anti-PD-L1 libre. Las células se incubaron con PD-PTLP e incubaron por 3 h y se siguió el mismo método para evaluación de análisis de captación celular.

Expresión de proteína por ensayo Western blot

Las células SGC7901/ADR se sembraron en placa de 6 pozos a densidad de siembra de 3 × 10⁵ células/pozo e incubaron por 18 h. Las células se trataron con diferentes formulaciones (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) e incubaron por 24 h. Las células se lavaron y extrajeron con tampón de stripping y lisaron usando tampón de lisis estándar (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.). Las células se centrifugaron a velocidad de 12,000 rpm por 15 min y el sobrenadante se colectó y cuantificación de proteína se realizó usando ensayo BCA de proteína (Beyotime). Cantidad igual de proteínas se cargó en gel SDS-PAGE 8% y luego transfirió a membrana de nitrocelulosa (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La membrana se bloqueó con 5% leche descremada por 1 h para inhibir sitios de unión no específicos. La membrana se incubó con anticuerpos primarios (P-gp y GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, EE. UU.) a 4 °C durante la noche. La membrana se lavó con TBST e incubó de nuevo con anticuerpos secundarios de peroxidasa de rábano picante marcado anti-conejo o -ratón de cabra (conejo o ratón, 1:10,000, Abcam, MA, EE. UU.) a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron de nuevo con TBST. Los blot se visualizaron bajo método de quimioluminiscencia mejorada (EMD Millipore).

Análisis de citotoxicidad in vitro

El efecto citotóxico de fármacos individuales y formulaciones se evaluó por ensayo MTT. Brevemente, células cancerosas se estratificaron a densidad de 1 × 10⁴ células/pozo en placa de 96 pozos e incubaron por 18 h. Las células se trataron luego con PTX libre, TQD, PTLP, y PD-PTLP, respectivamente por 24 h. Luego, las células se lavaron cuidadosamente y añadieron 15 μl de solución MTT 5 mg/ml y sometieron a 3 h de incubación adicional y luego 100 μl de DMSO se añadió para extraer cristal de formazan. La absorbancia resultante se midió a 570 nm usando lector de microplacas automatizado. La viabilidad celular se calcula por OD de grupo de prueba/OD de control × 100%. El índice de combinación se evaluó por software Calcusyn^TM. Todos los experimentos se realizaron en triplicado.

Análisis de apoptosis y especies reactivas de oxígeno in vitro

Para ensayo de apoptosis, células cancerosas se estratificaron a densidad de 2 × 10⁵ células/pozo en placa de 12 pozos e incubaron por 18 h. Las células se trataron luego con PTX libre, TQD, PTLP, y PD-PTLP, respectivamente por 24 h. Las células se extrajeron por stripping y centrifugaron y los pellet se re-dispersaron en 100 μl de tampón de unión. Las células se co-tiñeron con combo de 5 μl de Annexin-V/FITC y 2.5 μl de solución de trabajo PI e incubaron por 15 min. Las células tiñidas se analizaron por citómetro de flujo usando BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, EE. UU.). Annexin-V y PI representan indicador de apoptosis temprana e indicador de apoptosis tardía basado en componentes estructurales de células vivas y muertas, respectivamente.

El 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) se usó como sonda para análisis de especies reactivas de oxígeno (ROS). Para análisis cuantitativo, 1 × 10⁴ células/pozo se sembraron en placa de 96 pozos de fondo negro e incubaron por 18 h. Las células se trataron luego con PTX libre, TQD, PTLP, y PD-PTLP, respectivamente por 24 h. Las células se lavaron con tampón PBS y luego incubaron con 1 ml de solución DCFH-DA según directrices del fabricante por 30 min. Seguido por lisis de células y centrifugado a 10,000 rpm por 15 min. El sobrenadante resultante se transfirió a nueva placa de 96 pozos y la fluorescencia se midió a 485 nm usando lector de microplacas automatizado. Simultáneamente, conjunto separado de células se procesaron de manera similar e imágenes se observaron usando microscopio de fluorescencia (Nikon A1, Japón).

Eficacia antitumoral de PD-PTLP en modelo xenoinjerto

El estudio de eficacia antitumoral se realizó en ratones nude BALB/c obtenidos del Centro de Animales de Laboratorio, Cuarto Hospital Afiliado de Universidad Médica de Harbin, Harbin. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con estándares nacionales para calidad de animales de laboratorio. Los experimentos se realizaron estrictamente de acuerdo con las directrices del Comité de Animales Experimentales del Cuarto Hospital Afiliado de Universidad Médica de Harbin, Harbin. Los animales se inyectaron subcutáneamente con 1 × 10⁶ células SGC7901/ADR en 150 μl de medio de cultivo en flanco derecho de los ratones. Los tumores se permitieron crecer hasta 100 mm³ antes del experimento real. Los ratones se dividieron equitativamente en cinco grupos con ocho ratones en cada grupo. La dosis individual de PTX y TQD se fijó en 5 mg/kg, mientras que la combinación usó dosis total de 5 mg/kg. La inyección en vena de cola fue cada tercer día, en total, tres inyecciones se realizaron. En días predeterminados, volumen tumoral y peso corporal se midieron. El volumen tumoral se calculó midiendo el diámetro más largo y más corto de los tumores usando calibre digital. Volumen tumoral (V) = ½ × largo × ancho (mm)². Los ratones se sacrificaron al final del estudio y el tumor se extrajo y pesó. El tumor se sometió a análisis inmunohistoquímico (IHC). Los tumores se extrajeron, cortaron en pieza delgada, y fijaron en solución de formalina 10%. Los tumores se incrustaron en cera de parafina y luego se realizó ensayo TUNEL según directrices del fabricante.

Análisis bioquímico sérico

Los ratones se administraron con formulaciones respectivas; 24 h después, los ratones se sacrificaron y muestras de sangre se colectaron de grupos de animales control y tratados. El suero se separó de la sangre total y almacenó a −80 °C hasta análisis posterior. Análisis bioquímico sérico se realizó para evaluar el desempeño del hígado. Aspartato transaminasa (AST) y alanina transaminasa (ALT) se midieron para evaluar función hepática. Todas las mediciones se realizaron según procedimientos del kit de ensayo bioquímico.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de nanoliposomas conjugados con PD-L1 cargados con PTX/TQD

El PTX se ha usado ampliamente en clínicas e indicado principalmente en tratamiento de cánceres gástricos. Sin embargo, la mayoría de pacientes aparentemente sufren pobre respuesta terapéutica debido a multirresistencia (MDR) de cánceres gástricos. Un aumento en dosis de PTX resultó en toxicidad sistémica aumentada por lo que MDR se convirtió en obstáculo mayor en tratamiento exitoso de cáncer. Entre la plétora de mecanismos MDR, el eflujo de fármaco mediado por P-gp se considera principalmente responsable de la resistencia a fármacos en células cancerosas [27]. Por tanto, en este estudio, usamos un segundo fármaco (TQD) como inhibidor de P-gp para superar el fenómeno MDR en células cancerosas y mejorar la eficacia anticancerígena de PTX. Estudiamos cuidadosamente la fracción de peso de dos fármacos en la que exhiben efecto sinérgico. Para maximizar el efecto anticancerígeno, es importante co-entregar los múltiples fármacos en un solo sistema de nanopartículas. La entrega de dos fármacos (PTX e inhibidor de P-gp) simultáneamente permitirá la supresión eficiente del mecanismo de eflujo de fármaco y aumentará la perspectiva de concentraciones intracelulares aumentadas en células cancerosas [28]. Para este propósito, en este estudio, cargamos dos fármacos en la bicapa lipídica de nanoliposomas que se consideran extremadamente estables en circulaciones sistémicas (Fig. 1). Para lograr direccionamiento tumoral mejorado, nanoliposomas se conjugaron en superficie con mAb anti-PD-L1. El grupo maleimida presente en el nanoliposoma se unirá con grupo tiol de mAb anti-PD-L1 y formará enlace covalente estable. Pero una posible limitación de conjugación maleimida es que la reacción es reversible: el producto podría sufrir reacciones retro-adición de Michael con tioles biológicos en plasma lo que puede llevar a liberación de maleimida. Sin embargo, superamos tal reacción por conjugación máxima de anticuerpo en superficie de liposoma maleimida. Se ha reportado que ligando direccionador de tumor entregará específicamente la carga terapéutica en tejidos tumorales y evitará efectos secundarios innecesarios en tejidos normales. Anteriormente, Patel et al. reportaron que incorporación de inhibidor de P-gp con PTX podría superar MDR en célula de cáncer ovárico en condiciones in vitro [11]. Similarmente, Zou et al. y Zhang et al. reportaron que citotoxicidad de PTX contra SKOV-3TR y A2780-Adr células multirresistentes aumentó significativamente en presencia de Tariquidar. Sin embargo, en estos estudios, se usó combinación física de PTX + TQD o se desarrolló portador no dirigido [29, 30]. Importante, todos estos estudios se realizaron solo en condiciones in vitro. El presente estudio se centró en diseñar nanotransportador dirigido usando clase relativamente nueva de agente direccionador, anticuerpo PDL1. Además, el presente estudio demostró la eficacia de PTX + TQD en modelo de tumor xenoinjerto y también evaluó parámetros sanguíneos para relacionar con toxicidad sistémica.

Ilustraciones esquemáticas de carga de paclitaxel y tariquidar en nanoliposomas conjugados en superficie con anticuerpo monoclonal (mAb) anti-PD-L1. El liposoma se preparó por hidratación de película lipídica delgada y sonicado para formar nanoliposomas cargados con fármacos

El tamaño de partícula promedio de PTLP fue 135.6 ± 1.26 nm mientras aumentó a 168.59 ± 1.34 nm tras conjugación con mAb anti-PD-L1 (PD-PTLP). El tamaño de partícula aumentó debido al alto peso molecular de mAb anti-PD-L1; no obstante, tamaño general menor a 200 nm y forma esférica fue punto digno de notar (Fig. 2a). Nanopartículas tamaño menor a 200 nm permitirán mayor acumulación en tejidos tumorales debido a efecto de permeación y retención mejorada (EPR). Además, la presencia de PEG permitirá tiempo de circulación sanguínea prolongado en circulación sistémica. El potencial zeta de PD-PTLP fue 22.1 ± 1.21 mV que no permitirá unión no específica a componentes sanguíneos. PD-PTLP exhibió alta eficiencia de encapsulación de ~95% para ambos fármacos (PTX y TQD). PD-PTLP también exhibió alta carga de fármacos de 12-14% p/p para PTX y TQD, respectivamente (Fig. 2b).

Caracterización fisicoquímica de nanoliposoma conjugado con PD-L1 cargado con PTX/TQD. a Análisis de morfología de PD-PTLP usando microscopio electrónico de transmisión (TEM). b Capacidad de carga de fármacos de PD-PTLP. c Liberación in vitro de PTX y TQD de PD-PTLP en condiciones de tampón pH 7.4 y pH 5.0 a 37 °C. **p < 0.01 es la diferencia estadística en liberación de fármacos entre tampones pH 7.4 y pH 5.0

Liberación in vitro de fármacos

El comportamiento de liberación de PTX y TQD de PD-PTLP se estudió en condiciones pH 7.4 y pH 5.0 a 37 °C. Como se muestra en Fig. 2c, se observó liberación controlada de fármacos (PTX y TQD) de PD-PTLP durante todo el período de estudio (72 h). La liberación de fármaco de la bicapa gruesa de nanoliposoma podría ser responsable de la liberación lenta y sostenida de dos fármacos de PD-PTLP. Debe notarse que no se observó diferencia significativa en el patrón de liberación de PTX y TQD en pH 7.4 y pH 5.0. En punto de tiempo más largo, diferencia significativa en liberación se observó en diferentes condiciones de pH. Vale notar que no se añadieron elementos pH-responsivos en el nanoliposoma y mayor liberación de fármaco en condiciones ácidas podría atribuirse a mayor difusión a pH más bajo. Por ejemplo, ~85% de PTX liberado en condiciones pH 5.0 comparado con ~55% de liberación de fármaco en entorno pH fisiológico. Un patrón similar de liberación rápida de moléculas pequeñas en condiciones ácidas y liberación más lenta en condiciones de pH básico ha sido demostrado por otros investigadores. No obstante, liberación de fármaco relativamente baja en condiciones pH 7.4 podría reducir efectos secundarios sistémicos innecesarios y prolongar circulación sistémica mientras mayor liberación de fármaco en pH 5.0 podría beneficiar mayor eficacia terapéutica en tejidos tumorales.

Análisis de captación celular in vitro

La eficiencia de entrega de nanoliposomas dirigidos (PD-PTLP) y no dirigidos (PTLP) se probó en SGC7901/ADR. La captación celular se evaluó usando rodamina-B como rastreador de fluorescencia. Rodamina-B es fluoróforo comúnmente usado sin interacciones biológicas celulares. Núcleo se tiñó con DAPI de color azul y color rojo originado de nanopartículas. Los datos CLSM revelan claramente que PD-PTLP exhibió fluorescencia roja fuerte en células cancerosas comparado con PTLP no dirigido. Una mayor fluorescencia roja en células cancerosas tratadas con PD-PTLP atribuida a mayor internalización de nanopartículas (Fig. 3a). El resultado de datos CLSM indica que el receptor PD-L1 expresado en membrana celular fue reconocido por mAb anti-PD-L1 conjugado en superficie de nanoliposoma. Un mecanismo de captación pasiva o no específica fue evidente en células cancerosas tratadas con PTLP. La especificidad de diana PD-L1 se confirmó más por experimento de pretratamiento con mAb anti-PD-L1. Las células SGC7901/ADR se pretrataron con mAb anti-PD-L1 e incubaron por 30 min. Las células se expusieron luego con PD-PTLP y PTLP e incubaron por 3 h. Como se muestra (Fig. 3b), células pretratadas con mAb anti-PD-L1 mostraron fluorescencia roja significativamente menor comparado con células no tratadas indicando que mAb anti-PD-L1 fue consumido por receptores expresados en superficie y no había receptores adicionales disponibles para unión e internalización resultando en menor captación de nanopartículas y menor internalización. Estas CLSM revelaron claramente la especificidad de direccionamiento de PD-PTLP en células cancerosas SGC7901/ADR.

a Imágenes de microscopía confocal de barrido láser (CLSM) de células SGC7901/ADR tras incubación con PTLP y PD-PTLP por 3 h; imágenes CLSM de células SGC7901/ADR pretratadas con/sin mAb anti-PD-L1 tras incubación con PD-PTLP por 3 h. Rodamina B se usó como rastreador fluorescente y DAPI para teñir núcleo de células cancerosas

Nanoliposomas de doble carga mejoran efecto antiproliferativo

Para terapia combinada, diferentes ratios de dos fármacos (PTX y TQD) se usaron para establecer el grado de efecto sinérgico o aditivo en células de cáncer gástrico resistentes. Para calcular isobolograma e índice de combinación (CI), se usó software CalcuSyn (Biosoft, Versión 2.1). El gráfico isobolograma puede explicarse basado en ecuación Chou-Talalay. Los valores CI se caracterizan por sinérgico (CI < 0.9), aditivo (CI = 1), y antagónico (CI > 1). Como se muestra, todos los ratios de combinación de PTX y TQD revelaron valor CI de < 1 significando mecanismo de acción sinérgico (Fig. 4a). Para ser específico, mayor sinergia se observó en fracción de peso 1/0.5 (P/T) mientras el nivel de sinergia disminuyó con aumento de fracción de peso de TQD indicando importancia de presencia de dos fármacos en fracción de peso específica. Concentración demasiado baja y demasiado alta de TQD en régimen combinado no rindió el mejor efecto sinérgico. Para todos los experimentos in vitro, usamos ratio P/T = 1/0.5 en el estudio.

a Índice de combinación (CI) de diferentes fracciones de peso de PTX y TQD en células SGC7901/ADR. El índice de combinación se evaluó por software Calcusyn^TM. b Viabilidades celulares in vitro de células SGC7901/ADR tras tratamiento con varias concentraciones de PTX libre, TQD, PTLP, y PD-PTLP por período de incubación 24-h. c Análisis Western blot de expresión de P-gp en células SGC7901/ADR tras tratamiento con formulaciones respectivas. **p < 0.01 y ***p < 0.001 es la diferencia estadística entre grupo tratado con PTX libre y grupo tratado con PD-PTLP

El efecto citotóxico in vitro de fármacos individuales y combinacionales se determinó por protocolo MTT tras incubación 24-h. Como se muestra en Fig. 4b, NP blanco no tuvo efecto en viabilidad celular descartando posibilidad de interferencia en resultados finales. La monoterapia con PTX y TQD aunque mostró efecto citotóxico dependiente de concentración en células de cáncer gástrico resistentes; quedó corto de efectividad apreciable en tratamiento. El efecto antiproliferativo de agente único fue notablemente mejorado cuando se combinó con segundo fármaco encapsulado en nanoliposoma. La combinación de PTX y TQD resultó en efecto sinérgico obvio comparado con fármacos individuales solos. Además, nanoliposoma conjugado con mAb anti-PD-L1 (PD-PTLP) exhibió el efecto antiproliferativo más fuerte indicando la influencia del ligando direccionador en superficie de nanopartícula. Este efecto mejorado de muerte celular en grupo de tratamiento dirigido por PD-L1 podría atribuirse a alta internalización celular de nanoliposomas dirigidos por PD-L1 por células SGC7901/ADR consistente con análisis de captación celular. El valor IC50 de PD-PTLP fue 0.76 μg/ml comparado con 6.58 μg/ml y 7.64 μg/ml para PTX y TQD, respectivamente. Una disminución de diez veces en valor IC50 de PD-PTLP indica claramente que la resistencia a PTX en SGC7901/ADR sobreexpresando P-gp fue revertida por TQD. Nuestros resultados in vitro mostraron que TQD fue efectivo revirtiendo la multirresistencia en células SGC7901/ADR. Resultados también mostraron que nanoliposomas retuvieron acciones farmacológicas de fármacos encapsulados y liberaron fármaco de manera controlada en células cancerosas. La terapia combinada con PTX y TQD mejoró la eficacia anticancerígena con actividad sinérgica aumentada, superando las ventajas mínimas de monoterapia y posibles efectos secundarios asociados. En general, tratamiento combinado de PTX con inhibidor efectivo de P-gp en nanoliposoma podría ser estrategia prometedora para superar MDR y tratar cánceres gástricos.

Para evaluar el mecanismo molecular, se realizó análisis Western blot en SGC7901/ADR. Como se muestra (Fig. 4c), PTX no tuvo efecto en expresión de proteína P-gp mientras por el contrario, TQD redujo significativamente la expresión de P-gp confirmando su papel farmacológico como inhibidor de P-gp. Interesantemente, PTLP y PD-PTLP basados en fármacos combinados mostraron diferencia insignificante en expresión de proteína comparado con células cancerosas tratadas con TQD. El resultado demostró la ventaja de cargar PTX y TQD (inhibidor de P-gp) juntos en un solo sistema de nanotransportador. El resultado de Western blot podría corroborarse con resultados de viabilidad celular donde combinación de PTX + TQD revirtió MDR y exhibió mayor eficacia anticancerígena en células de cáncer gástrico.

Análisis de apoptosis por citómetro de flujo

Análisis de apoptosis de formulación individual se evaluó por método de tinción Annexin V-FITC/PI usando citómetro de flujo. Resultados de apoptosis se presentan en Fig. 5a. Como se muestra, células control no mostraron signo de apoptosis, mientras PTX libre y TQD exhibieron aumento obvio en células en apoptosis. Fármaco combinado PTLP mostró apoptosis dos veces mayor comparado con fármacos individuales indicando efecto anticancerígeno sinérgico de formulaciones. Más importante, PD-PTLP mostró la apoptosis más alta de células cancerosas con alrededor de 60% en región de apoptosis. Efecto de apoptosis mejorado de PD-PTLP atribuido a mayor internalización de nanotransportadores de doble carga y potencial sinérgico de PTX y TQD de manera ratiométrica. El efecto de silenciamiento de P-gp de TQD en régimen combinado mejoró el efecto anticancerígeno de PTX en células cancerosas. La tasa de apoptosis de fármaco individual estuvo en rango entre 20 y 25% mientras alrededor de 60% de células en apoptosis se observaron para células tratadas con PD-PTLP. PD-PTLP indujo más apoptosis que fármacos libres y liposomas no dirigidos, sugiriendo que PD-L1 podría entregar PTX/TQD más eficientemente para inducir apoptosis de células SGC7901/ADR.

a Ensayo de apoptosis de células SGC7901/ADR tras tinción con combo Annexin V/PI usando citómetro de flujo. Las células se trataron con concentración fija de 2 μg/ml. b Análisis de especies reactivas de oxígeno (ROS) de células SGC7901/ADR usando 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) como sonda. ***p < 0.001 es la diferencia estadística entre grupo tratado con PTX libre y grupo tratado con PD-PTLP

Determinación de nivel intracelular de ROS

Exploramos la capacidad de fármacos individuales y duales para afectar el estado redox de células cancerosas evaluando nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células de cáncer gástrico. Niveles de ROS en célula cancerosa se evaluaron por DCFH-DA (fluorescencia verde). Datos cuantitativos de ROS se presentan en Fig. 5b. Como se muestra, células no tratadas no tuvieron signo de ROS; sin embargo, PTX o TQD indujeron niveles apreciables de generación de ROS. Importante, TPLP y PD-TPLP desencadenaron niveles significativamente mayores de ROS comparado con PTX libre o TQD o células control no tratadas. Un ROS notablemente mayor indica el potencial de PD-TPLP para promover mayor apoptosis. Imágenes microscópicas corroboran con resultados cuantitativos con fluorescencia verde más brillante y de mayor intensidad comparado con células no tratadas o tratadas con PTX libre o TQD. La mayor intensidad de fluorescencia verde es indicación de mayor producción de ROS. Estrés oxidativo como ROS se considera indicador importante de citotoxicidad celular. Estudios han mostrado que inducción de ROS induce una serie de eventos fisiológicos incluyendo daño de ADN, inflamación y apoptosis celular.

Combinación de PTX y TQD inhibió crecimiento en tumores resistentes a fármacos

Finalmente, eficacia terapéutica y parámetros de toxicidad de formulaciones se investigaron en modelo de tumor xenoinjerto SGC7901/ADR resistente a fármacos (Fig. 6a). Los fármacos se administraron intravenosamente a dosis fija de 5 mg/kg cada 3 días con total de tres inyecciones. PTX/TQD se administró en fracción de peso fija de 1/0.5. En línea esperada, PTX libre y TQD libre no mostraron efecto inhibitorio en crecimiento de tumores MDR, sugiriendo que células SGC7901/ADR manifiestan tolerancia a fármacos en proliferación de tumores MDR. Inhibidor de P-gp (TQD) aunque eficiente inhibiendo bombas de eflujo de fármacos no se convierte en resultado terapéutico mejorado. En comparación, combinación de PTX + TQD (PTLP) mostró inhibición significativa de crecimiento de tumores resistentes a fármacos. La mejor eficacia antitumoral se observó con PD-PTLP que fue tres veces efectiva comparado con control, 2.5 comparado con fármacos libres, y aproximadamente dos veces efectiva reduciendo carga tumoral comparado con formulaciones no dirigidas (p < 0.05; p < 0.001). El volumen tumoral final de control, PTX libre, TQD, PTLP, y PD-PTLP fue ~2000 mm³, ~1650 mm³, 1625 mm³, ~1000 mm³, y ~650 mm³, respectivamente. Fármacos libres fueron ligeramente efectivos durante punto de tiempo inicial; sin embargo, crecieron igual que grupo control no tratado. Resultados revelan claramente el potencial de combinación de PTX + inhibidor de P-gp como estrategia única para controlar efectivamente carga tumoral. La extensa supresión tumoral en PD-PTLP sugiere claramente la mayor eficacia antitumoral del grupo de formulaciones dirigidas. Los tumores se extrajeron y pesaron; pesos tumorales fueron consistentes con datos de volumen tumoral (Fig. 6b). Grupo de ratones tratados con PD-PTLP mostró el tumor más pequeño comparado con cualquier otro grupo tratado con formulaciones (p < 0.001). Para verificar más el efecto inhibitorio de tumores individuales, tumores se sometieron a ensayo TUNEL (Fig. 6c). Como se muestra, PD-PTLP mostró grandes extensiones de tinción de apoptosis comparado con control no tratado o fármacos libres. PD-PTLP mostró rasgos de apoptosis aparentes con arreglos celulares desorganizados. El prominente efecto de muerte tumoral de PD-PTLP muestra la mayor inhibición de células cancerosas en células tumorales resistentes a fármacos. La excelente eficacia de PD-PTLP se atribuyó principalmente a presencia de ligando dirigido (mAb anti-PD-L1) que se une con receptores respectivos y aumenta concentraciones intracelulares. La presencia de régimen combinado y liberación de manera controlada por tiempo prolongado también contribuyó para su eficacia mejorada. Además, corona superficial PEG hidrofílica densa podría ofrecer excelente estabilidad física a las partículas y potencialmente evitar absorción de proteínas innecesaria y evitar aclaramiento rápido. La larga circulación y tamaño nano a su vez benefician mayor acumulación de partículas en tejidos tumorales [31,32,33].

Eficacia antitumoral in vivo de diferentes formulaciones contra tumores SGC7901/ADR multirresistentes (MDR); a volumen tumoral, b análisis de peso tumoral, y c ensayo TUNEL de tejidos tumorales. Los ratones se administraron con dosis fija de 5 mg/kg con duración de tres veces para tres administraciones. Células apoptóticas evaluadas por ensayo TUNEL. *p < 0.05 y **p < 0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p < 0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-grupo tratado.

Análisis de toxicidad sistémica

El cambio en peso corporal es buen indicador de toxicidad sistémica. Como se muestra (Fig. 7a), ratones tratados con PTX libre perdieron ~20% de peso corporal en día 10 que disminuyó gradualmente para recuperar peso corporal original hacia fin del estudio. Pérdida de más de 5% de peso corporal se considera causa de toxicidad interna severa y 20% de pérdida de peso corporal se considera efecto adverso significativo de fármacos libres [31]. Por el contrario, PTLP o PD-PTLP no causaron tal pérdida de peso y los ratones permanecieron saludables durante todo el período de estudio indicando índice de seguridad de nanoliposomas. Sistema de entrega sin toxicidad sistémica y eficacia antitumoral mejorada se considera altamente efectivo en tratamiento de tumores. La seguridad de nanopartículas se estudió más midiendo niveles plasmáticos de enzimas. Niveles plasmáticos de aminotransferasas (AST y ALT) se midieron tras administración 24-h de formulaciones respectivas (Fig. 7b, c). Como se muestra, PTX libre resultó en aumento significativo (p < 0.01) en niveles de AST y ALT mientras PD-PTLP y PTLP fueron insignificantemente diferentes comparados con control no tratado. AST se libera en suero tras daño de órganos como corazón, riñón o hígado mientras ALT se libera específicamente en caso de lesión hepática [34]. Los niveles de AST y ALT sirven como indicador específico de daño orgánico y en este sentido PD-PTLP mostró ser portador seguro.

Análisis de toxicidad sistémica de formulaciones individuales en tumores SGC7901/ADR; a análisis de peso corporal de ratones; b, c evaluación bioquímica de sangre de niveles séricos de AST y ALT como parámetros de toxicidad sistémica. *p < 0.05 y **p < 0.01 es la diferencia estadística entre grupo tratado con PTX libre y grupo tratado con PD-PTLP

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo publicado y sus archivos de información suplementaria.

Abreviaturas

EPR:

Efecto de permeación y retención mejorada

PD-PTLP:

Nanoliposomas conjugados con mAb anti-PD-L1 cargados con PTX y TQD

P-gp:

Glucoproteína P

PTLP:

Nanoliposomas cargados con PTX y TQD

PTX:

Paclitaxel

TQD:

Tariquidar