Un grupo de complejos basados en PAMAM y puntos cuánticos utilizados en inmunoensayos clínicos

Resumen

Divulgamos un grupo de complejos utilizados en inmunoensayos clínicos. Los complejos incluyen una IgG anti-conejo de cabra conjugada con PAMAM y una IgG anti-ratón de cabra conjugada con QDs. Cuando se agregan antígeno de conejo y antígeno de ratón, se detectará el antígeno correspondiente. El experimento, que utiliza los complejos, es simple, conveniente, breve en el tiempo y en pasos breves. También es aplicable a diferentes métodos experimentales, como el uso con FCM (citometría de flujo), ICC (inmunocitoquímica) e IHC (inmunohistoquímica) para detectar muchos tipos de antígenos.

Introducción

Los puntos cuánticos (QD) se utilizan ampliamente como luminarias debido a sus altos rendimientos cuánticos de fluorescencia, alta fotoestabilidad y bajas propiedades de fotoblanqueo. También se utilizan ampliamente como fluoróforos orgánicos en imágenes celulares y aplicaciones biotecnológicas. En particular, los QD que contienen cadmio (es decir, CdSe y CdTe) tienen ventajas significativas porque bajo irradiación de la misma longitud de onda dentro del rango de 430-660 nm, tienen un espectro electromagnético de emisión dependiente del tamaño [1, 2]. Por lo tanto, las QD conjugadas con anticuerpos son las sondas más prometedoras para la obtención de imágenes moleculares.

El dendrímero de poliamidoamina (PAMAM), como una de las macromoléculas dendríticas más ampliamente estudiadas, tiene las siguientes características:una gran cantidad de grupos funcionales superficiales, una gran cantidad de cavidades dentro de las moléculas, un tamaño a nanoescala y una alta biocompatibilidad. Cuando se conjugan con fármacos y anticuerpos, estos dendrímeros pueden mejorar la solubilidad y la circulación sistémica de un fármaco, pero no obstaculizan la actividad biológica del fármaco [3]. Por lo tanto, los anticuerpos modificados con PAMAM se utilizan a menudo en la inmunización clínica.

Los inmunoensayos clínicos incluyen muchos métodos, como WB, ELISA, IHC (inmunohistoquímica), ICC (inmunocitoquímica) y FCM (citometría de flujo). Entre ellos, el FCM que utiliza sondas de anticuerpos específicos realiza un análisis rápido de una sola célula u otras partículas biológicas a nivel celular y molecular. Por tanto, FCM es uno de los inmunoensayos más utilizados. Si se lleva a cabo un cribado celular, el uso de la sonda de anticuerpo correspondiente es suficiente; sin embargo, si se desea el cribado de moléculas biológicas pequeñas, como el de una proteína pequeña, virus o citocina, se debe adoptar el método CBA (matriz de perlas citométricas) porque el FCM no puede detectar directamente citocinas pequeñas. El método CBA utiliza perlas marcadas con colorante construidas con anticuerpos de captura específicos en la superficie. Cuando las perlas de CBA se mezclan con la muestra y los correspondientes anticuerpos marcados con colorante, se formarán complejos sándwich como en ELISA, y el antígeno pequeño puede ser detectado por FCM.

En este estudio, presentamos un grupo de complejos que incluyen una IgG anti-conejo de cabra conjugada con PAMAM y una IgG anti-ratón de cabra conjugada con QDs. Este grupo de complejos se puede utilizar para FCM, ICC e IHC. Cuando se agregan antígeno de conejo y antígeno de ratón, se detectará el antígeno correspondiente. Este modelo puede detectar muchos tipos de antígenos, incluidas pequeñas proteínas, virus y citocinas cuando están presentes los correspondientes anticuerpos de ratón y conejo. El esquema 1 muestra los complejos usados en FCM, tomamos HSP27 como ejemplo. HSP27 también se conoce como HSPB1 (familia de proteínas de choque térmico B número 1) y es una proteína importante implicada en la resistencia a los fármacos, el crecimiento celular, la apoptosis, la aparición de tumores y la metástasis, etc. [4, 5]. En este modelo, la IgG de cabra anti-conejo conjugada con PAMAM actúa como un portador y una captura, similar a las perlas CBA (matriz de perlas citométricas), permitiendo que los antígenos de molécula pequeña sean detectados por FCM. La IgG anti-ratón de cabra conjugada con QD actúa como una sonda fluorescente. Si los antígenos son proteínas de membrana o proteínas intracelulares, podemos utilizar el método tradicional de FCM para detectar los antígenos. Solo necesitamos agregar los QD y no el resto PAMAM. Para proteínas intracelulares y proteínas de membrana, las células pueden considerarse como dianas que pueden detectarse directamente mediante el método FCM; no necesitan el resto PAMAM para constituir una pseudocélula. Por lo tanto, podemos dividir los complejos y usarlos individualmente.

Representación de cómo FCM forma y utiliza los complejos para detectar HSP27. Primero, el G5 amino PAMAM debe reaccionar con anhídrido succínico para formar PAMAM neutro

Resultados y discusión

El grupo de complejos incluye dos partes, una parte PAMAM y una parte QDs. La parte de PAMAM es una IgG de cabra anti-conejo conjugada con PAMAM. Usamos dendrímeros PAMAM terminados en amino de quinta generación (G5 PAMAM) como agente estabilizador de superficie para proporcionar características de solubilidad ideales para ambientes acuosos, pero este dendrímero tiene una carga positiva fuerte que es dañina para la unión de anticuerpos. Para neutralizar la carga positiva, disolvimos PAMAM en DMSO y agregamos anhídrido succínico (dihidro-2,5-diceotetrahidrofurano) para neutralizar el grupo amino PAMAM. El grupo amino en PAMAM reacciona con anhídrido succínico para formar enlaces amida [6,7,8,9,10]. Después de la reacción, el producto fue dializado, liofilizado, pesado y redisuelto, la producción es casi neutra y llamamos al producto “N-PAMAM”, que es capaz de conjugarse con IgG anti-conejo de cabra. PAMAM, especialmente G5 PAMAM, contiene un gran número de cavidades, y la IgG puede encapsularse dentro de los espacios vacíos de G5 PAMAM [11]. Primero se disolvió IgG de cabra anti-conejo en tampón MES (0,1 mol / L, pH 6,0), luego se añadieron EDC y sulfo-NHS (en una relación molar de 1:1) y la mezcla se incubó durante 15 min. Finalmente, se añadió N-PAMAM (PAMAM neutro) seguido de incubación a 4 ° C en un lecho agitador durante la noche. Este polímero se autoensambló en solución acuosa para formar micelas poliméricas que encapsularon los huéspedes de bajo peso molecular que de otro modo serían insolubles [12]; después de la reacción, se requirió diálisis para eliminar los materiales sin reaccionar. Luego, la producción se liofilizó, se pesó y se redisolvió en tampón de conservación y, finalmente, se preparó la IgG de cabra anti-conejo conjugada con N-PAMAM.

Los espectros de fluorescencia y UV-vis de N-PAMAM-IgG (cabra anti-conejo) en MES se muestran en la Fig. 1. En comparación con N-PAMAM (PAMAM neutral) e IgG, el pico de emisión de fluorescencia de N-PAMAM-IgG fue de la menor intensidad. El espectro UV-vis muestra que en comparación con IgG, tampón MES, PAMAM y N-PAMAM, solo N-PAMAM-IgG tenía un pico de absorción a una longitud de onda de 200 nm. Ya sea el espectro de fluorescencia o el espectro UV-vis, N-PAMAM-IgG muestra características diferentes en comparación con N-PAMAM e IgG, lo que demuestra indirectamente que N-PAMAM e IgG se han combinado en lugar de simplemente mezclados. Para detectar la actividad de anticuerpos de N-PAMAM-IgG, se llevó a cabo ELISA. Como se muestra en la Fig. 2, la resistencia al anticuerpo IgG (cabra anti-conejo) no se perdió al acoplarse con N-PAMAM.

un Espectros de fluorescencia de PAMAM-IgG (cabra anti-conejo) en MES. La longitud de onda de excitación fue de 548 nm. b Espectros UV-vis de PAMAM-IgG (cabra anti-conejo) en MES y espectros de emisión en un rango de longitudes de onda

Método ELISA para detectar la resistencia a anticuerpos N-PAMAM-IgG (cabra anti-conejo). Se utilizó N-PAMAM-IgG como antígeno y se diluyó a diferentes concentraciones. Se utilizó IgG-HRP de conejo como sonda de anticuerpo para detectar la resistencia de N-PAMAM-IgG. La medición de la absorbancia se tomó a una longitud de onda de 450 nm

La parte de QD es una IgG de cabra anti-ratón conjugada con QD. Los QD conjugados con anticuerpos suelen formarse mediante reacciones de acoplamiento cruzado, en las que las moléculas de anticuerpos se unen a grupos funcionales como los grupos carboxilo o los grupos amino en la superficie de los QD [13, 14]. En este estudio, usamos puntos cuánticos solubles en agua de núcleo / capa CdSe / ZnS estabilizados con ligandos carboxilo y la reacción de acoplamiento de carbodiimida usando EDC (clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida). Este método es uno de los métodos más populares para conjugar un anticuerpo a la superficie de QDs [15,16,17]. Las micelas de CdSe / ZnS QD se incubaron primero en presencia de EDC y sulfo-NHS en tampón borato (BS 5 mM, pH 7,2). Luego, se añadió IgG anti-ratón de cabra y la mezcla se incubó a 4 ° C en un lecho agitador durante la noche en la oscuridad. Finalmente, se añadió BSA (albúmina de suero bovino) al 10% para bloquear las QD sin reaccionar, y la producción se purificó mediante centrifugación sucesiva y redisolución para eliminar los materiales sin reaccionar. La actividad de anticuerpos de la IgG conjugada con QD (anti-ratón de cabra) puede mantenerse durante 3 meses después del almacenamiento a 4 ° C en la oscuridad.

El tamaño de partícula de QDs-IgG (cabra anti-ratón) y QDs en tampón de conservación (BS 2,5 mM, pH 8,0, BSA al 0,1%) se muestran en la Fig. 3a. Después de la reacción de acoplamiento, el diámetro de los productos aumentó obviamente y los productos tuvieron buena homogeneidad y estabilidad. Estas características son la clave para su uso como sonda de detección. Los espectros de fluorescencia de QDs-IgG y QDs se muestran en la Fig.3b, y como se muestra en la Fig.3a, el diámetro de producción aumentado muestra que la IgG se combinó con los QDs, pero el pico de emisión de fluorescencia QDs-IgG fue el mismo como los QD. Este resultado significa que el acoplamiento de IgG y QD no alteró las características ópticas de los QD, lo que es útil para su aplicación en inmunoensayos. Para detectar la actividad del anticuerpo del QDs-IgG, utilizamos un método ELISA con membrana de PVDF. El anticuerpo anti-AKT de ratón se diluyó a concentraciones de 1 μg / ml, 10 μg / ml, 100 μg / ml y 200 μg / ml, y los cuatro antígenos de gradiente de concentración se hibridaron con QDs-IgG (anti-ratón de cabra). a la misma concentración de 0,1 mg / ml. Después de la hibridación durante 40 min a 37ºC en la oscuridad, la membrana de PVDF se lavó con PBST (pH 6,0, Tween 20 al 0,1%) 3 veces y la membrana de PVDF se irradió con luz ultravioleta. La intensidad de la fluorescencia se mostró en la Fig. 3c, la intensidad de la fluorescencia aumentó con el aumento de la concentración de antígeno, lo que indica que QDs-IgG tiene una alta actividad de anticuerpos.

un Distribución del diámetro hidrodinámico de las QD y de la IgG conjugada con QD (anti-ratón de cabra). ( a ) Diámetros de QD y ( b ) IgG conjugada con QD (anti-ratón de cabra). El diámetro medio de los QDs es de 64,87 nm, y el de QDs-IgG es de 211,4 nm, detectado por DLS. b Espectros de fluorescencia de QDs-IgG (cabra anti-ratón), QDs y tampón de conservación (BS 2,5 mM, pH 8,0, BSA 0,1%). El pico de emisión de fluorescencia de QDs-IgG fue el mismo que el de los QD, lo que indica que el acoplamiento de IgG a QD no alteró las características ópticas de los QD. c Método ELISA para detectar la resistencia a anticuerpos de QDs-IgG (cabra anti-ratón), se evaluó la membrana de PVDF con UV

Esta sección presenta cómo utilizar este grupo de complejos en FCM. Como se mencionó anteriormente, podemos detectar muchos tipos de antígenos, como proteínas pequeñas, virus y citocinas [18], y usamos la proteína HSP27 como ejemplo, ahora repasemos el proceso en detalle. HSP27 se encuentra en el citoplasma y se secreta en grandes cantidades en las células tumorales, especialmente en cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de epitelio urinario, cáncer de riñón, cáncer de mama y cáncer de piel tipo melanoma. Dado que una pequeña parte de HSP27 se secreta extracelular, necesitamos lisar la célula para extraer la proteína. En este experimento, seleccionamos dos líneas celulares, MCF-7 (células de cáncer de mama humano) como grupo de prueba y L02 (células de hígado humano normal) como grupo de control. Las células se lisaron para extraer las proteínas intracelulares. Se recogieron las proteínas totales, luego se añadieron anti-HSP27 de conejo y anti-HSP27 de ratón de acuerdo con la concentración de proteína, seguido de incubación a 37 ° C durante 50 min. Luego se añadió N-PAMAM-IgG a la mezcla, la mezcla se incubó a 37 ° C durante 30 min y luego se dividió en dos grupos iguales:un grupo de prueba y un grupo PAMAM. Finalmente, se añadió QDs-IgG al grupo de prueba y se incubó a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. La Figura 4 muestra el análisis de fluorescencia para los dos grupos de células por citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia de la curva de prueba fue mucho mayor que la de la curva PAMAM en el grupo MCF-7, mientras que en el grupo L02, las dos curvas casi se superpusieron. Cuando existe HSP27 en extractos celulares, N-PAMAM-IgG y QDs-IgG se unirán indirectamente para formar una combinación sándwich en presencia de anti-HSP27 de conejo y anti-HSP27 de ratón. Si HSP27 no existe, solo una pequeña cantidad de QDs-IgG se unirá a N-PAMAM-IgG por adsorción inespecífica. Por lo tanto, si la intensidad de fluorescencia de la curva de prueba es mayor que la de la curva PAMAM de control, la muestra contiene HSP27. La Figura 4 muestra que las células MCF-7 secretaron más proteína HSP27 que las células L02.

Análisis de fluorescencia de HSP27 por citometría de flujo. un Células L02. b Células MCF-7. El grupo de prueba se incubó con N-PAMAM-IgG y QDs-IgG, grupo PAMAM como control, que solo se incubó con N-PAMAM-IgG para formar una pseudocélula para la proteína micromolécula detectada por FCM. Cuando las dos curvas casi se superponen, se puede determinar que no hay HSP27 en la muestra; por lo tanto, ya sea que se agregue QDs-IgG o no, la intensidad de la fluorescencia no cambiará

Como se mencionó anteriormente, estos complejos pueden detectar proteínas intracelulares secretadas por FCM; en principio, estos complejos se pueden aplicar a cualquier tipo de antígeno. Además, las dos partes de la combinación se pueden utilizar por separado. Si el antígeno que queremos detectar está ubicado en la célula o en la superficie celular, solo podemos usar la parte de QD. Por ejemplo, la β-actina es uno de los componentes principales del citoesqueleto ubicado en las células y existe ampliamente en las células eucariotas. La Figura 5a muestra que el análisis de fluorescencia solo usó parte QD para β-actina en células HeLa por FCM. Las células HeLa se lavaron y trataron con metanol para mejorar la penetración de la membrana celular y luego se dividieron en dos grupos iguales. El grupo de β-actina se incubó con anti-β-actina de ratón a 37 ° C durante 30 min, y el grupo de control se incubó con BSA. Después de lavar con PBS, ambos grupos se incubaron con QDs-IgG (anti-ratón de cabra) a 37 ° C durante 30 min. Después de lavar dos veces con PBS, FCM detectó ambos grupos. La intensidad de fluorescencia de la curva de β-actina fue mucho mayor que la de la curva de control, lo que indicó que las células HeLa contenían la proteína β-actina.

un Análisis de fluorescencia para β-actina en células HeLa. El grupo de β-actina se incubó con anti-β-actina de ratón y QDs-IgG (cabra anti-ratón), y el grupo de control se incubó con BSA y QDs-IgG. El grupo de control puede permitir la exclusión de la fluorescencia de fondo causada por la adsorción inespecífica de QDs-IgG. b Imágenes de microscopio de fluorescencia de células HeLa bajo irradiación UV-vis. DAPI tiñó los núcleos celulares y emitió fluorescencia azul; QDs-IgG se combinó indirectamente con β-actina y emitió fluorescencia roja. Barra de escala de 20 μm

Además, estos complejos también se pueden aplicar a ICC. Sin embargo, para ICC, se requiere que el antígeno diana esté ubicado en la célula o en la superficie celular y esté presente en grandes cantidades [19]; de lo contrario, será difícil distinguir el objetivo experimental del fondo. Tomamos la proteína β-actina, por ejemplo, y sembramos células HeLa en una placa de células de 10 cm y colocamos un cubreobjetos de microscopio en ella, usamos metanol para inmovilizar las células. A continuación, las células se incubaron con anti-β-actina de ratón (PBS, BSA al 1%) a 37 ° C durante 1 h, se lavaron dos veces con PBST y se incubaron con QDs-IgG (anti-ratón de cabra) a 37 ° C en el oscuro durante 1 h. Después de lavar dos veces con PBST y teñir el núcleo celular con DAPI, se detectó la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia [20, 21]. La Figura 5b muestra las imágenes de microscopio de fluorescencia de las células HeLa. La ventaja de las QD como colorante fluorescente es que la señal de las QD y la señal DAPI se pueden observar simultáneamente bajo la irradiación del canal ultravioleta; por lo tanto, de acuerdo con el núcleo, la diana se puede localizar obviamente. En este experimento, la β-actina son proteínas del citoesqueleto alrededor del núcleo celular y obviamente se pueden observar.

Conclusiones

En conclusión, demostramos la aplicación de los complejos utilizados en inmunoensayos clínicos, como FCM e ICC. El grupo de complejos incluye una IgG anti-conejo de cabra conjugada con PAMAM y una IgG anti-ratón de cabra conjugada con QDs. Cuando se añadieron antígeno de conejo y antígeno de ratón, se detectó el antígeno correspondiente. Estos complejos son ventajosos debido a su amplio espectro, alta biocompatibilidad, alta estabilidad a la luz y baja toxicidad biológica. Este complejo es un modelo universal que solo requiere el cambio de los correspondientes anticuerpos primarios. En este artículo, usamos los complejos para detectar HSP27 y β-actina, pero en teoría, este proceso se puede aplicar a cualquier tipo de antígeno. Además, podemos elegir el método de detección según las características de los antígenos, y también podemos dividir los complejos y utilizarlos individualmente según las necesidades reales. Este método también permite detectar moléculas pequeñas, como pequeñas proteínas y virus, mediante citometría de flujo. Creemos que con la mejora adecuada, también se puede aplicar a otros métodos, como inmunoflurescencia (IF), western blot (WB) y tira inmunocromatográfica de flujo lateral (LCS).

Métodos / Experimental

Materiales

Los puntos cuánticos de CdSe / ZnS (QD solubles en agua con grupos carboxilo, nº de cas N / A) se adquirieron en NEPQD, China. Se adquirió PAMAM (quinta generación con terminación amino, número de lote CYD-150A) de CYD, China. Se adquirieron IgG anti-conejo de cabra (ab6702) y anti-β-actina de ratón (ab8226) de Abcam, Reino Unido; anti-HSP27 de ratón (BF0624) y anti-HSP27 de conejo (AF6082) se adquirieron en Affinity, EE.UU. Se adquirió IgG anti-ratón de cabra (bs0296G) de Bioss, China; Se adquirieron EDC y sulfo-NHS de Thermo Fisher; Se adquirieron DMEM y suero fetal bovino de Gibco; y membranas de PVDF (0,2 µm) se adquirieron de Millipore. Todos los demás reactivos químicos eran de grado reactivo analítico.

Preparación de N-PAMAM-IgG (anti-conejo de cabra)

a)
Preparación de N-PAMAM (PAMAM neutro):Se disolvió PAMAM (G5 terminado en amino, PM promedio 28826) (60 mg, 2,081 mM) en DMSO (2 ml) y anhídrido succínico (dihidro-2,5-diceotetrahidrofurano) (0,266 g, 2,66 mM) para neutralizar los grupos amino. Debido a que un mol de macromoléculas G5 PAMAM tiene 128 moles de grupos amino, 60 mg de PAMAM contienen grupos amino 0,266 mM y la relación molar para grupos amino PAMAM y anhídrido succínico es aproximadamente 1:10. Luego, la mezcla se mezcló en un lecho agitador a 100 rpm durante 4 h, después de lo cual la solución se dializó a través de una membrana de diálisis de 3500 MWCO durante 24 h, y se obtuvo N-PAMAM después de la liofilización.
b)
Preparación de N-PAMAM-IgG (cabra anti-conejo):tampón MES formulado (100 mM, pH 6,0), luego tome 100 μl de tampón MES en un tubo, agregue 20 μM de EDC y 20 μM de sulfo-NHS y luego agite con un vórtice a baja velocidad. Agregar 35.7 μl de IgG (pH, 0.5 μM) y agitar con vórtex, luego agregar 19 μg de N-PAMAM e incubar a 4 ° C durante la noche, finalmente la solución se dializará a través de una membrana de diálisis de 3500MWCO y 8000MWCO durante 3 días, después de la liofilización, se obtendrá N-PAMAM-IgG.

Preparación de QDs-IgG (anti-ratón de cabra)

a)
Formulación de tampón BS:

1.
Preparar tampón de bórax (50 mM):pesar 19,07 g de bórax y disolver en 1 L de agua ultrapura.
2.
Preparar tampón de ácido bórico (50 mM):pesar 3,09 g de ácido bórico y disolver en 1 L de agua ultrapura.
3.
El tampón BS de pH 8,0 y el tampón BS de pH 7,2 se prepararon mezclando las dos soluciones anteriores.
4.
El tampón de lavado, también utilizado como tampón de conservación, se preparó diluyendo el tampón BS de pH 8,0 a una concentración de 5 mM y añadiendo Tween 20 al 0,1%.
5.
La solución de activación se preparó diluyendo el tampón BS de pH 7,2 a una concentración de 5 mM y añadiendo Tween 20 al 0,1%.
6.
El tampón de EDC se preparó disolviendo 0,27 g de EDC en 5 ml de solución de activación, y el tampón de sulfo-NHS se preparó disolviendo 0,378 g de sulfo-NHS en 5 ml de solución de activación.

b)
Preparación de QDs-IgG (anti-ratón de cabra):

Primero, se disolvieron 450 μl de QD (CdSe / ZnS, 5 mg / ml) en 2,25 ml de solución de activación, luego se agregaron 150 μl de tampón EDC y 150 μl de tampón sulfo-NHS, y la solución se sonicó en hielo durante 5 min. En segundo lugar, la solución se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 min para eliminar el sobrenadante y el precipitado se disolvió en 1,2 ml de tampón de lavado. Después de 30 min de mezcla ultrasónica, se agregaron 100 μg de anticuerpo IgG, luego la solución se incubó durante la noche en un lecho agitador a una temperatura de 4 ° C. En tercer lugar, se añadieron 150 µl de BSA al 10% seguido de incubación a 30ºC durante 30 min y centrifugación a 12.000 rpm durante 2 min para eliminar el sobrenadante. El precipitado se redisolvió en 1 ml de tampón de lavado, luego se centrifugó a 12.000 rpm durante 2 min, se repitió este paso y finalmente se resolvió el precipitado en 1 ml de tampón conservante. Al final, se añadió BSA al 10%; la mezcla se mezcló con mezcla de choque ultrasónico completo y se centrifugó a 820 g / min para eliminar el precipitado, conteniendo el sobrenadante QDs-IgG. QDs-IgG debe almacenarse a 4 ° C en la oscuridad durante 3 meses. Cabe señalar que las muestras solo se pueden almacenar a 4 ° C y no se pueden congelar ni siquiera con glicerina; de lo contrario, se producirá una gran cantidad de puntos cuánticos reunidos en grupos, formando una precipitación que no podría eliminarse con PBST, lo que provocará una fluorescencia de fondo grave.

Análisis FCM para la proteína HSP27

HSP27 se encuentra en el citoplasma y se secreta en grandes cantidades en las células tumorales. En este experimento, seleccionamos dos líneas celulares, MCF-7 (células de cáncer de mama humano) como grupo de prueba y L02 (células de hígado humano normal) como grupo de control. Los dos grupos de células se sembraron en una placa de cultivo de 10 cm y se incubaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal (FBS) al 10% a 37 ° C. Cuando las células cubrieron el 80% de la placa, las células se digirieron con tripsina y se lavaron dos veces con PBS. Luego, las células se resuspendieron en 1 ml de PBS. Se contaron las células con un hemocitómetro, se añadió tampón de lisis celular T-PER de acuerdo con la concentración celular, después de lo cual se extrajo la proteína intracelular del lisado celular. Luego, se centrifugó el lisado celular a 14000 rpm por 10 min para recolectar el sobrenadante, y se midió la concentración de proteína por el método BCA, de acuerdo a la concentración de proteína, se adicionó el anti-HSP27 de conejo y anti-HSP27 de ratón y se incubó a 37 ° C durante 50 min. En este experimento, la concentración de proteína de L02 fue de aproximadamente 0,2 mg / ml y MCF-7 fue de 0,25 mg / ml, y el volumen de ambos fue de 500 µl. Los dos anticuerpos, anti-HSP27 de conejo y anti-HSP27 de ratón, se agregaron a las células (0,625 μl a MCF-7 y 0,5 μl a células L02).

Luego, se añadió 1 mg / ml de N-PAMAM-IgG a las mezclas seguido de incubación a 37ºC durante 30 min; Se añadieron 6,25 µl al grupo MCF-7 y se añadieron 5 µl al grupo L02. Después de la incubación, la producción se dividió en dos grupos iguales, el grupo de prueba y el grupo PAMAM. Finalmente, se agregó QDs-IgG al grupo de prueba, que se incubó a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. Luego, los dos grupos de células se analizaron mediante citometría de flujo.

Análisis FCM para la proteína β-actina

La β-actina es una proteína intracelular que es uno de los componentes principales del citoesqueleto y existe ampliamente en las células eucariotas. Se sembraron células HeLa en una placa de cultivo de 10 cm y se incubaron en DMEM con FBS al 10% a 37ºC durante 2 días, luego se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con PBS. Las células se digirieron con tripsina, después de lo cual las células se centrifugaron a 800 rpm durante 3 min para eliminar el sobrenadante y se añadió 1 ml de metanol frío para resuspender las células. Después de 5 min, las células se centrifugaron a 800 rpm durante 3 min para eliminar el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 ml de PBS. Este paso se repitió y las células HeLa se dividieron en dos grupos iguales. El grupo de prueba se incubó con anti-β-actina de ratón a 37 ° C durante 30 min, y el grupo de control se incubó con BSA (albúmina de suero bovino). En este experimento, se disolvió anti-β-actina de ratón en PBST (1% BSA, 5 μg / ml), y se agregaron 100 μl de IgG a 300 μl del grupo de prueba, y se agregó una cantidad equivalente de BSA al grupo de control. Después de media hora de incubación, ambos grupos se incubaron con QDs-IgG (cabra anti-ratón) a 37 ° C durante 30 min. Después de lavar dos veces con PBS, FCM evaluó a ambos grupos.

Análisis ICC para la proteína β-actina

Se sembraron células HeLa en una placa de cultivo de 10 cm y se incubaron en DMEM con FBS al 10% a 37ºC durante 1 día. Luego, se colocaron varios cubreobjetos esterilizados en la placa de células y las células se cultivaron adicionalmente durante 2 días. Se retiraron los cubreobjetos y se lavaron dos veces con PBS, luego se incubaron los cubreobjetos en 400 μl de metanol durante 20 min a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se lavaron 3 veces con PBS. Luego, se preparó tampón de bloqueo con PBST (Tween 20 al 0,1%), glicina 22,52 mg / ml y BSA al 10%. Se colocó un cubreobjetos en tampón de bloqueo y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, se retiró el tampón de bloqueo y se incubó un cubreobjetos con anti-β-actina de ratón (PBS, 1% BSA) a 37 ° C durante 1 h, se lavó dos veces con PBST y se incubó con QDs-IgG (cabra anti- ratón) a 37 ° C durante 1 h en la oscuridad. Después de lavar dos veces con PBST y teñir el núcleo celular con DAPI durante 2 min, el cubreobjetos se enjuagó una vez con PBS y una vez con agua para su visualización bajo un microscopio de fluorescencia.