Complejos avanzados PAMAM-Puntos Cuánticos para inmunoensayos clínicos rápidos

Resumen

Se reporta un grupo de complejos para uso en inmunoensayos clínicos. Los complejos incluyen un anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra conjugado con PAMAM y un anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra conjugado con puntos cuánticos (QDs). Al añadir anticuerpos anti-antígeno de conejo y ratón, se detecta el antígeno correspondiente. El experimento con estos complejos es simple, conveniente, corto en tiempo y pasos. También es aplicable a diferentes métodos experimentales, como citometría de flujo (FCM), inmunocitoquímica (ICC) e inmunohistoquímica (IHC) para detectar muchos tipos de antígenos.

Introducción

Los puntos cuánticos (QDs) se usan ampliamente como luminóforos por su alto rendimiento cuántico de fluorescencia, alta fotoestabilidad y baja fotodegradación. También se usan como fluoróforos orgánicos en imagen celular y aplicaciones biotecnológicas. En particular, QDs que contienen cadmio (CdSe, CdTe) tienen ventajas significativas: bajo irradiación de misma longitud de onda (430–660 nm), presentan espectro de emisión electromagnética dependiente del tamaño. Por tanto, anticuerpos conjugados con QDs son sondas prometedoras para imagen molecular.

El dendrímero poliamidoamina (PAMAM), uno de los macromoléculas dendríticas más estudiadas, presenta: gran número de grupos funcionales superficiales, numerosas cavidades internas, tamaño nanométrico y alta biocompatibilidad. Al conjugarse con fármacos y anticuerpos, estos dendrímeros mejoran la solubilidad y circulación sistémica del fármaco sin obstaculizar su actividad biológica. Por tanto, anticuerpos modificados con PAMAM se usan a menudo en inmunización clínica.

Los inmunoensayos clínicos incluyen muchos métodos: Western blot (WB), ELISA, IHC, ICC, FCM. Entre ellos, FCM con sondas de anticuerpos específicos realiza análisis rápido de células individuales u otras partículas biológicas a nivel celular y molecular, siendo uno de los inmunoensayos más usados. Si se realiza cribado celular, basta con sonda de anticuerpo correspondiente; pero para cribado de pequeñas moléculas biológicas (pequeñas proteínas, virus, citocinas), debe adoptarse el método CBA (array de cuentas citométrico) porque FCM no detecta directamente citocinas pequeñas. CBA usa cuentas marcadas con colorante con anticuerpos de captura específicos en superficie. Al mezclar cuentas CBA con muestra y anticuerpos marcados con colorante correspondientes, se forman complejos sándwich como en ELISA, y el antígeno pequeño se detecta por FCM.

En este estudio presentamos un grupo de complejos: PAMAM conjugado con anti-IgG de conejo de cabra y QDs conjugado con anti-IgG de ratón de cabra. Este grupo sirve para FCM, ICC e IHC. Al añadir anti-antígeno de conejo y ratón, se detecta el antígeno correspondiente. Este modelo detecta muchos tipos de antígenos, incluidas pequeñas proteínas, virus y citocinas cuando están presentes anticuerpos de ratón y conejo correspondientes. El Esquema 1 muestra los complejos usados en FCM, tomando HSP27 como ejemplo. HSP27 (HSPB1) es proteína importante en resistencia a fármacos, crecimiento celular, apoptosis, aparición y metástasis tumoral. En este modelo, PAMAM-anti-IgG conejo actúa como transportador y captura, similar a cuentas CBA, permitiendo detectar antígenos de pequeña molécula por FCM. QDs-anti-IgG ratón actúa como sonda fluorescente. Si antígenos son proteínas de membrana o intracelulares, podemos usar FCM tradicional detectando antígenos solo con QDs (sin PAMAM). Para proteínas intracelulares y de membrana, las células son blancos detectables directamente por FCM; no necesitan PAMAM para constituir una pseudocélula. Por tanto, los complejos pueden separarse y usarse individualmente.

Resultados y discusión

El grupo de complejos incluye dos partes: parte PAMAM y parte QDs. Parte PAMAM: PAMAM conjugado con anti-IgG conejo de cabra. Se usó dendrímero PAMAM terminación amino quinta generación (G5 PAMAM) como agente estabilizador superficial para proporcionar características de solubilidad ideales en medios acuosos, pero este dendrímero tiene fuerte carga positiva perjudicial para unión anticuerpo. Para neutralizarla, se disolvió PAMAM en DMSO y se añadió anhídrido succínico (dihidro-2,5-dicetotetrahidrofurano) para neutralizar grupos amino PAMAM. Grupo amino PAMAM reacciona con anhídrido succínico formando enlaces amida. Tras reacción, producto dializado, liofilizado, pesado y redisoluto; producto casi neutro llamado "N-PAMAM", capaz de conjugar con anti-IgG conejo. PAMAM, especialmente G5, contiene numerosas cavidades; IgG puede encapsularse en espacios vacíos de G5 PAMAM. Anti-IgG conejo disuelto en buffer MES (0,1 mol/L, pH 6,0), añadidos EDC y sulfo-NHS (ratio molar 1:1), incubación 15 min. Finalmente N-PAMAM añadido e incubación 4 °C en agitador overnight. Polímero se autoensambla en solución acuosa formando micelas poliméricas que encapsulan huéspedes insolubles de bajo peso molecular; tras reacción, diálisis para eliminar materiales no reaccionados. Liofilizado, pesado, redisoluto en buffer conservante, obteniendo N-PAMAM-anti-IgG conejo.

Espectros fluorescencia y UV-Vis de N-PAMAM-IgG (anti-conejo) en MES (Fig. 1). Comparado con N-PAMAM e IgG, pico emisión fluorescencia N-PAMAM-IgG menor intensidad. Espectro UV-Vis: solo N-PAMAM-IgG tiene pico absorción a 200 nm vs IgG, MES, PAMAM, N-PAMAM. Tanto en fluorescencia como UV-Vis, N-PAMAM-IgG muestra características diferentes vs N-PAMAM e IgG, probando indirectamente que se combinaron, no solo mezclaron. Para detectar actividad anticuerpo N-PAMAM-IgG, se realizó ELISA (Fig. 2): resistencia anticuerpo IgG (anti-conejo) no se perdió al acoplar con N-PAMAM.

Parte QDs: QDs conjugado con anti-IgG ratón de cabra. Anticuerpo-QDs usualmente formados por reacciones de acoplamiento cruzado, donde anticuerpos se unen a grupos funcionales (carboxilo, amino) en superficie QDs. En este estudio, QDs núcleo/capa CdSe/ZnS hidrosolubles estabilizados con ligandos carboxilo y reacción acoplamiento carbodiimida usando EDC. Método popular para conjugar anticuerpo a superficie QDs. Micelas QDs CdSe/ZnS incubadas con EDC y sulfo-NHS en buffer borato (5 mM BS, pH 7,2). Añadido anti-IgG ratón, incubación 4 °C agitador overnight en oscuridad. Finalmente 10 % BSA (albúmina sérica bovina) añadida para bloquear QDs no reaccionados, purificación por centrifugaciones sucesivas y redisolución para eliminar materiales no reaccionados. Actividad anticuerpo QDs-IgG (anti-ratón) se mantiene 3 meses almacenado 4 °C en oscuridad.

Tamaño partícula QDs-IgG (anti-ratón) y QDs en buffer conservante (2,5 mM BS, pH 8,0, 0,1 % BSA) en Fig. 3a. Tras reacción acoplamiento, diámetro productos aumenta notablemente, con buena homogeneidad y estabilidad, clave para uso como sonda detección. Espectros fluorescencia QDs-IgG y QDs en Fig. 3b: pico emisión QDs-IgG igual que QDs, indicando acoplamiento IgG-QDs no altera características ópticas QDs, útil para inmunoensayos. Para detectar actividad anticuerpo QDs-IgG, ELISA con membrana PVDF. Anticuerpo anti-AKT ratón diluido 1, 10, 100, 200 μg/ml, cuatro gradientes concentrados hibridados con QDs-IgG (anti-ratón) misma concentración 0,1 mg/ml. Tras hibridación 40 min a 37 °C oscuridad, membrana PVDF lavada PBST (pH 6,0, 0,1 % Tween 20) 3×, irradiada UV. Intensidad fluorescencia Fig. 3c: aumenta con concentración antígeno, indicando QDs-IgG alta actividad anticuerpo.

Esta sección introduce uso del grupo complejos en FCM. Detectan muchos antígenos: pequeñas proteínas, virus, citocinas. Usamos HSP27 como ejemplo. HSP27 localizado en citoplasma, secretado en gran cantidad en células tumorales (cáncer pulmón, páncreas, epitelio urinario, riñón, mama, melanoma). Parte HSP27 extracelular, por tanto lisar célula para extraer proteína. Dos líneas celulares: MCF-7 (cáncer mama humano) grupo test, L02 (hígado humano normal) control. Células lisadas para extraer proteínas intracelulares. Proteínas totales recogidas, añadidos anti-HSP27 conejo y ratón según concentración proteína, incubación 37 °C 50 min. Añadido N-PAMAM-IgG, incubación 37 °C 30 min, dividido en dos grupos iguales: test y PAMAM. Finalmente QDs-IgG añadido a grupo test, incubación 37 °C 30 min oscuridad. Fig. 4: análisis fluorescencia dos grupos células por citometría flujo. Intensidad curva test mucho mayor que curva PAMAM en grupo MCF-7; en L02 ambas curvas casi se superponen. Cuando HSP27 existe en extractos, N-PAMAM-IgG y QDs-IgG se unen indirectamente formando combinación sándwich con anti-HSP27 conejo y ratón. Si HSP27 no existe, solo pequeña cantidad QDs-IgG se une a N-PAMAM-IgG por adsorción inespecífica. Si intensidad fluorescencia curva test > curva control PAMAM, HSP27 contenido en muestra. Fig. 4 muestra MCF-7 secretan más HSP27 que L02.

Estos complejos detectan proteínas intracelulares secretadas por FCM; en principio aplicables a cualquier antígeno. Las dos partes pueden usarse por separado. Si antígeno está en célula o superficie, solo parte QDs. Ejemplo: β-actina, componente principal citoesqueleto en células, amplia en eucariotas. Fig. 5a: análisis fluorescencia solo parte QDs para β-actina en células HeLa por FCM. HeLa lavadas, tratadas metanol para mejorar penetración membrana, divididas en dos grupos. Grupo β-actina incubado anti-β-actina ratón 37 °C 30 min, control incubado BSA. Tras lavado PBS, ambos incubados QDs-IgG (anti-ratón) 37 °C 30 min. Lavado PBS 2×, ambos detectados FCM. Intensidad curva β-actina mucho mayor que control, indicando HeLa contienen β-actina.

Además, complejos aplicables a ICC. Requiere antígeno diana en célula o superficie y en gran cantidad; sino, objetivo difícil distinguir de fondo. Ejemplo β-actina: HeLa sembradas en placa 10 cm con cubreobjetos, metanol para inmovilizar. Incubación anti-β-actina ratón (PBS, 1 % BSA) 37 °C 1 h, lavado 2× PBST, incubación QDs-IgG (anti-ratón) 37 °C 1 h oscuridad. Lavado 2× PBST, tinción núcleo DAPI, fluorescencia detectada microscopio fluorescencia. Fig. 5b: imágenes microscopio fluorescencia HeLa. Ventaja QDs como colorante fluorescente: señal QDs y DAI observables simultáneamente bajo irradiación canal ultravioleta; según núcleo, objetivo localizado obviamente. β-actina proteínas citoesqueleto alrededor núcleo, observables claramente.

Conclusiones

En conclusión, demostramos aplicación de complejos en inmunoensayos clínicos (FCM, ICC). Grupo incluye PAMAM-anti-IgG conejo cabra y QDs-anti-IgG ratón cabra. Al añadir anti-antígeno conejo y ratón, se detecta antígeno correspondiente. Ventajas: amplio espectro, alta biocompatibilidad, alta estabilidad lumínica, baja toxicidad biológica. Modelo universal solo requiere cambiar anticuerpos primarios correspondientes. En artículo detectamos HSP27 y β-actina, pero en teoría aplicable a cualquier antígeno. Además, podemos elegir método detección según características antígenos, y separar complejos usándolos individualmente según necesidades. Este método permite detectar pequeñas moléculas (proteínas, virus) por citometría flujo. Creemos que con mejoras apropiadas, también aplicable a otros métodos: inmunofluorescencia (IF), Western blot (WB), tira inmunocromatográfica lateral (LCS).

Materiales y métodos

Materiales

QDs CdSe/ZnS (hidrosolubles con grupos carboxilo, cas no. N/A) de NEPQD, China. PAMAM (quinta generación terminación amino, lote CYD-150A) de CYD, China. Anti-IgG conejo cabra (ab6702) y anti-β-actina ratón (ab8226) de Abcam, Reino Unido; anti-HSP27 ratón (BF0624) y anti-HSP27 conejo (AF6082) de Affinity, EE. UU.; anti-IgG ratón cabra (bs0296G) de Bioss, China; EDC y sulfo-NHS de Thermo Fisher; DMEM y suero fetal bovino de Gibco; membranas PVDF (0,2 μm) de Millipore. Reactivos químicos grado analítico.

Preparación N-PAMAM-IgG (anti-conejo cabra)

1. a) Preparación N-PAMAM (PAMAM neutro): PAMAM (G5 terminación amino, PM medio 28826) (60 mg, 2,081 mM) disuelto en DMSO (2 ml), añadido anhídrido succínico (0,266 g, 2,66 mM) para neutralizar grupos amino. Un mol G5 PAMAM tiene 128 mol grupos amino; 60 mg PAMAM contienen 0,266 mM grupos amino, ratio molar grupos amino PAMAM : anhídrido succínico ~1:10. Mezcla en agitador 100 rpm 4 h, diálisis membrana 3500 MWCO 24 h, N-PAMAM obtenido tras liofilización.
2. b) Preparación N-PAMAM-IgG (anti-conejo cabra): buffer MES formulado (100 mM, pH 6,0), 100 μl buffer en tubo, añadidos 20 μM EDC y 20 μM sulfo-NHS, agitación vórtice velocidad baja. Añadidos 35,7 μl IgG (pH, 0,5 μM) agitación vórtice, luego 19 μg N-PAMAM incubación 4 °C overnight, finalmente diálisis membranas 3500 y 8000 MWCO 3 días, liofilización obtiene N-PAMAM-IgG.

Preparación QDs-IgG (anti-ratón cabra)

1. a) Formulación buffer BS:
   1. 1. Buffer borax (50 mM): 19,07 g borax en 1 L agua ultrapura.
   2. 2. Buffer ácido bórico (50 mM): 3,09 g ácido bórico en 1 L agua ultrapura.
   3. 3. Buffer BS pH 8,0 y pH 7,2 preparados mezclando ambas soluciones.
   4. 4. Buffer lavado/conservante: diluir buffer BS pH 8,0 a 5 mM + 0,1 % Tween 20.
   5. 5. Solución activación: diluir buffer BS pH 7,2 a 5 mM + 0,1 % Tween 20.
   6. 6. Buffer EDC: 0,27 g EDC en 5 ml solución activación; buffer sulfo-NHS: 0,378 g sulfo-NHS en 5 ml solución activación.
2. b) Preparación QDs-IgG (anti-ratón cabra): Primero, 450 μl QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) en 2,25 ml solución activación, añadidos 150 μl buffer EDC y 150 μl buffer sulfo-NHS, sonicación hielo 5 min. Segundo, centrifugación 12000 rpm 5 min eliminar sobrenadante, precipitado disuelto 1,2 ml buffer lavado. Tras 30 min mezcla ultrasónica, 100 μg anticuerpo IgG añadido, incubación overnight agitador 4 °C. Tercero, 150 μl 10 % BSA añadido, incubación 30 °C 30 min, centrifugación 12000 rpm 2 min eliminar sobrenadante. Precipitado redisoluto 1 ml buffer lavado, centrifugación 12000 rpm 2 min, paso repetido, finalmente precipitado resuelto 1 ml buffer conservante. Al final, 10 % BSA añadido, mezcla con choque ultrasónico completo, centrifugación 820 g/min eliminar precipitado, sobrenadante contiene QDs-IgG. Almacenar 4 °C oscuridad 3 meses. Nota: solo almacenar 4 °C, no congelar ni con glicerina; si no, QDs se agregan en racimos formando precipitado no lavable con PBST, causando fluorescencia fondo grave.

Análisis FCM proteína HSP27

HSP27 en citoplasma, secretado gran cantidad en células tumorales. Dos líneas: MCF-7 (cáncer mama) test, L02 (hígado normal) control. Sembradas plato 10 cm DMEM 10 % FBS 37 °C. Al 80 % confluencia, digestión tripsina, lavado 2× PBS. Resuspensión 1 ml PBS. Conteo hemocitómetro, buffer lisis T-PER según concentración celular, extracción proteína intracelular lisado. Centrifugación 14000 rpm 10 min recoger sobrenadante, concentración proteína método BCA. Según concentración, añadidos anti-HSP27 conejo y ratón, incubación 37 °C 50 min. Concentración proteína L02 ~0,2 mg/ml, MCF-7 ~0,25 mg/ml, volumen 500 μl ambos. Anticuerpos añadidos: 0,625 μl MCF-7, 0,5 μl L02.

Luego 1 mg/ml N-PAMAM-IgG añadido a mezclas, incubación 37 °C 30 min; 6,25 μl MCF-7, 5 μl L02. Tras incubación, producción dividida dos grupos iguales: test y PAMAM. Finalmente QDs-IgG añadido a grupo test, incubación 37 °C 30 min oscuridad. Dos grupos analizados citometría flujo.

Análisis FCM proteína β-actina

β-actina intracelular, componente principal citoesqueleto, amplia en eucariotas. HeLa sembradas plato 10 cm DMEM 10 % FBS 37 °C 2 días, sobrenadante removido, lavado 2× PBS. Digestión tripsina, centrifugación 800 rpm 3 min eliminar sobrenadante, 1 ml metanol frío resuspender. 5 min, centrifugación 800 rpm 3 min eliminar sobrenadante, resuspensión 1 ml PBS. Paso repetido, HeLa divididas dos grupos iguales. Test incubado anti-β-actina ratón 37 °C 30 min, control incubado BSA. Anti-β-actina disuelto PBST (1 % BSA, 5 μg/ml), 100 μl IgG a 300 μl test, BSA equivalente control. 30 min incubación, ambos incubados QDs-IgG (anti-ratón) 37 °C 30 min. Lavado 2× PBS, ambos evaluados FCM.

Análisis ICC proteína β-actina

HeLa sembradas plato 10 cm DMEM 10 % FBS 37 °C 1 día. Varios cubreobjetos esterilizados en plato, cultivo 2 días más. Cubreobjetos removidos, lavado 2× PBS, incubación 400 μl metanol 20 min temp. ambiente. Lavado 3× PBS. Buffer bloqueo: PBST (0,1 % Tween 20), 22,52 mg/ml glicina, 10 % BSA. Cubreobjetos en buffer bloqueo 30 min temp. ambiente. Buffer bloqueo removido, cubreobjetos incubado anti-β-actina ratón (PBS, 1 % BSA) 37 °C 1 h, lavado 2× PBST, incubado QDs-IgG (anti-ratón) 37 °C 1 h oscuridad. Lavado 2× PBST, tinción núcleo DAPI 2 min, cubreobjetos enjuague 1× PBS 1× agua visualización microscopio fluorescencia.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos disponibles sin restricción.

Abreviaturas

CBA:

Array de cuentas citométrico

DMEM:

Medio Eagle modificado Dulbecco

FBS:

Suero fetal bovino

FCM:

Citometría de flujo

ICC:

Inmunocitoquímica

N-PAMAM:

PAMAM neutro

PAMAM:

Dendrímero poliamidoamina

QDs:

Puntos cuánticos