Puntos de carbono derivados de corteza de Phellodendron chinensis carbonizada protegen riñones de lesión renal aguda inducida por veneno de Deinagkistrodon acutus

Resumen

Antecedentes

Como nanomaterial emergente, los puntos de carbono (CDs) han sido foco de tremenda atención para aplicaciones biomédicas. Sin embargo, hay poca información sobre su bioactividad para inhibir lesión renal aguda (AKI) inducida por veneno de serpiente.

Métodos

Este estudio reporta el desarrollo de un proceso verde de pirólisis en un paso para sintetizar CDs usando corteza de Phellodendron chinensis (PCC) como único precursor, y se investigó por primera vez su potencial aplicación como protectante contra AKI inducida por veneno de Deinagkistrodon acutus (D. acutus). El modelo de AKI se estableció inyectando veneno de D. acutus en la cavidad abdominal de ratones y se investigaron los efectos protectores potenciales de CDs de PCC Carbonisata (PCCC-CDs) sobre anomalías renales incluyendo disfunción, reacciones inflamatorias, daño tisular y trombocitopenia en seis puntos temporales (1, 3 y 12 h, y 1, 2 y 5 días).

Resultados

Estos resultados demostraron que PCCC-CDs inhibieron significativamente la disfunción renal (redujeron concentraciones de creatinina sérica (SCR), nitrógeno ureico en sangre (BUN), proteína total urinaria (UTP) y microalbuminuria (MALB)) y la producción de quimioatrayente (proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1)), citoquinas proinflamatorias (interleucina (IL)-1β) y citoquina antiinflamatoria (IL-10) en respuesta a inyección intraperitoneal de veneno de D. acutus. El efecto beneficioso de PCCC-CDs en ratones envenenados fue similar al del cambio en histología renal y trombocitopenia.

Conclusiones

Estos resultados demostraron los notables efectos protectores de PCCC-CDs contra AKI inducida por veneno de D. acutus, lo que no solo ampliaría las aplicaciones biomédicas de CDs sino que también proporcionaría un objetivo potencial para el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos para AKI inducida por mordedura de serpiente D. acutus.

Introducción

Deinagkistrodon acutus (D. acutus), perteneciente a la familia Viperidae, se considera una de las serpientes terrestres más peligrosas en China. El envenenamiento por D. acutus se asocia con una serie de síntomas como hemorragia, trombocitopenia y posible daño directo al riñón. La lesión renal aguda (AKI) es el efecto sistémico más grave y complicación común del envenenamiento por D. acutus que conduce directamente a disfunción renal persistente y alta morbilidad. El tratamiento tópico actual implica el uso de antiveneno hiperinmune derivado de caballo como antídoto. Sin embargo, su efectividad es limitada para neutralizar daño tisular local, especialmente en la ocurrencia de AKI, y tiene varios efectos insatisfactorios como reacciones anafilácticas y pirogénicas. Además, el costo relativamente alto y la pobre estabilidad del antiveneno también contribuyen al tratamiento insatisfactorio de personas mordidas por D. acutus, especialmente en áreas silvestres o rurales. Por tanto, existe una necesidad urgente de medicinas complementarias efectivas, seguras y asequibles para el tratamiento de AKI inducida por veneno de D. acutus.

Los puntos de carbono (CDs), una nueva clase de nanomateriales de carbono con tamaño < 10 nm, fueron descubiertos fortuitamente por separación y purificación de nanotubos de carbono de pared simple en 2004 y han atraído mucho interés en la última década debido a sus notables propiedades novedosas como apreciable biocompatibilidad, baja toxicidad, alta solubilidad en agua y materias primas abundantes. El advenimiento de CDs ha contribuido a la investigación en desarrollo de varios nanosistemas "inteligentes" principalmente incluyendo bioimagen, biomedicina, administración de fármacos y fotocatálisis.

Cabe destacar que el desarrollo de CDs con potencial bioactivo inherente proporciona muchas estrategias para el descubrimiento de una nueva generación de fármacos para el control o tratamiento efectivo de algunas enfermedades debido a las notables ventajas mencionadas. En varias bioactividades como antibacterianas para tratar queratitis bacteriana, hemostáticas, tipo peroxidasa, anticancerígenas, antivirales y antiinflamatorias se han reportado. Estos efectos han atraído la atención de científicos para estudiar aplicaciones farmacéuticas y biomédicas adicionales de CDs. Especialmente, las actividades aliviadoras de CDs derivados de Schizonepetae Spica Carbonisata sobre hemorragia inducida por veneno de D. acutus han proporcionado una nueva perspectiva sobre la investigación de efectos beneficiosos de CDs en AKI inducida por mordedura de D. acutus, que permanecía poco comprendida hasta ahora.

Los CDs de Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC-CDs) se sintetizan por pirólisis directa de PCC (un tipo de medicina tradicional china, usada por > 1000 años) usando un tratamiento de pirólisis en un paso. PCCC-CDs son CDs hipotóxicos con diámetro de 1.2 a 4.8 nm. Se ha reportado que PCCC-CDs poseen notables efectos hemostáticos, lo que no solo ha ampliado la aplicación biomédica de CDs sino que también ha iniciado el esclarecimiento de la base material hemostática de PCCC. Cabe destacar que PCCC, una medicina tradicional china preparada por procesamiento con carbón, se registró por primera vez en las Recetas Sagradas de Taiping para Alivio Universal (978-992 DC, en China). El perfil de seguridad y eficacia terapéutica satisfactoria de PCCC, como hemostasia y antiinflamación, fomentaron su aplicación clínica continua por más de 1000 años, lo cual fue reconocido en la Farmacopea de la República Popular China (FRC, 2015). Sin embargo, el estudio de bioactividades adicionales subyacentes de PCCC-CDs ha sido un desafío. Especialmente, hay poca información sobre la inhibición de AKI inducida por envenenamiento de D. acutus.

Además, el envenenamiento por mordedura de serpiente se ha reportado que posiblemente pone en peligro la fisiología renal directamente a través de componentes nefrotóxicos o por activación o modulación de mediadores inmunes e inflamatorios. Estos efectos son principalmente sobre parámetros biomédicos (creatinina sérica (SCR), nitrógeno ureico en sangre (BUN), proteína total urinaria (UTP) y concentración de microalbuminuria (MALB)), citoquinas inflamatorias (interleucina (IL)-1β), citoquina antiinflamatoria (IL-10) y proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), cambio en histología renal y recuento de plaquetas (PLT). En el presente estudio, sintetizamos PCCC-CDs usando un método verde de pirólisis en un paso e, por primera vez, investigamos sus efectos protectores contra el desarrollo de estas anomalías en AKI inducida por inyección intraperitoneal de ratones con veneno de D. acutus.

Materiales y métodos

Reactivos

El material PCC se compró en Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, China), y PCCC se preparó en nuestro laboratorio. Membranas de diálisis con peso molecular de 1000 Da se compraron en Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, China). El kit de conteo celular (CCK)-8 se compró en Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japón). El veneno liofilizado de D. acutus fue provisto por An Ren Snake Farm (Condado de Yujiang, Yingtan, Jiangxi, China) para uso experimental. Otros reactivos químicos de grado analítico se obtuvieron de Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, China). Kits ELISA de MCP-1, IL-10 e IL-1β de ratón se compraron en Cloud-Clone Corp. (Wuhan, China). Todos los experimentos se realizaron usando agua desionizada (DW).

Animales

La gestión y protocolos de investigación animal fueron apoyados y aprobados por el Comité Institucional de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Medicina China de Beijing. Ratones machos Kunming (peso 30.0 ± 2.0 g) se compraron en Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., con certificado de conformidad de animal de laboratorio, y se mantuvieron en jaulas a temperatura y humedad constantes en ciclo luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a comida y agua.

Preparación de solución de veneno

El veneno liofilizado se disolvió en suero salino normal con mezcla suave durante 20 min (concentración final: 5 mg/mL) y se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Preparación de PCCC-CDs

PCCC se preparó usando un método de pirólisis en un paso con PCC como único precursor según métodos previos. Brevemente, las muestras de PCC se colocaron en crisoles de porcelana separados y se calentaron 1 h a 350 °C en horno precalentado. Tras enfriar a 30 °C, los residuos negros homogéneos obtenidos se molieron en polvo fino y se hirvieron dos veces en agua a 100 °C durante 1 h cada vez. Luego, la solución se recogió prefiltrando la suspensión a través de membrana de acetato de celulosa de 0.22 μm. Impurezas no carbonáceas se eliminaron por diálisis contra DW durante 72 h (peso molecular retenido: 1000 Da). La solución de PCCC-CDs se concentró y almacenó a 4 °C hasta su uso. El diagrama de flujo en Fig. 1 ilustra el proceso anterior.

Caracterización de PCCC-CDs

La morfología de los CDs se estudió usando microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM-2100 electron, JEOL, Japón) con energía de electrón de 200 kV. Detalles estructurales se examinaron usando TEM de alta resolución (HRTEM) usando microscopio electrónico Tecnai G2 20 (FEI, EE. UU.). El espectro ultravioleta-visible (UV-Vis) y propiedades de fluorescencia se registraron y midieron usando espectroscopía UV-Vis (CECIL, Cambridge, Reino Unido) y fluorescencia (F-4500, Tokio, Japón), respectivamente. Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se usó para analizar información de grupos funcionales superficiales en ventana espectral entre 400 y 4000 cm⁻¹.

Ensayo de citotoxicidad

Líneas celulares de hepatocitos humanos L02 y riñón embrionario humano 293 T se usaron para evaluar la potencial citotoxicidad de PCCC-CDs usando ensayo CCK-8. Células L02 se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) con 10% suero fetal bovino (FBS) mientras que células 293 T crecieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, conteniendo 10% FBS. Ambas líneas celulares se incubaron a 37 °C en atmósfera humidificada de 5% CO₂.

Células L02 y 293 T se sembraron a densidad de 2.0 × 10⁴ células/pocillo en placas de 96 pocillos y cultivaron a 37 °C en atmósfera humidificada de 5% CO₂ durante 24 h. Luego ambos tipos celulares se trataron con 100 μL de diferentes concentraciones (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 y 19.5 μg/mL) de soluciones de PCCC-CDs en medio libre de suero e incubaron por otras 24 h. Posteriormente, el medio conteniendo PCCC-CDs se removió y las células se lavaron con solución salina fosfato bufferizada (PBS) dos veces. La citotoxicidad se determinó leyendo la placa a 450 nm inmediatamente tras añadir 10 μL de reactivo CCK-8 e incubar 4 h a 37 °C.

AKI inducida por veneno de D. acutus y tratamiento

Modelo de AKI inducido por veneno de D. acutus

El modelo de AKI en ratones se estableció inyectando intraperitoneal veneno de serpiente D. acutus. Los ratones se dividieron aleatoriamente en cinco grupos de 36 animales cada uno: control; modelo; y grupos de tratamiento con dosis alta, media y baja de PCCC-CDs. El grupo modelo recibió veneno de D. acutus a 1 mg/kg (0.15 mg/mL, 0.2 mL) peso corporal y 0.5 mL suero salino normal intraperitonealmente, mientras que los grupos de tratamiento con dosis alta, media y baja de PCCC-CDs recibieron volumen equivalente de veneno de serpiente y extracto de PCCC-CDs a dosis de 8.0, 4.0 y 2.0 mg/kg, respectivamente. Ratones inyectados intraperitonealmente solo con suero salino normal (NS) sirvieron como controles. Seis ratones de cada grupo fueron sacrificados a 1, 3 y 12 h tras administración de NS, veneno de D. acutus y PCCC-CDs en el horario descrito, mientras que ratones sacrificados en día 1, 2 y 5 fueron administrados continuamente con NS, veneno de serpiente D. acutus y PCCC-CDs dos veces al día.

Análisis de concentraciones de UTP y MALB

Tras administración de los respectivos tratamientos, animales en grupos control, modelo y PCCC-CDs-tratados (4.0 mg/kg) fueron colocados inmediatamente en jaulas metabólicas apropiadas para recolección de orina hasta que terminó el período de incubación (24 h). Las concentraciones de UTP y MALB se analizaron usando analizador bioquímico automático.

Análisis de biomarcadores de función renal

La función renal se evaluó midiendo niveles de SCR y BUN. Antes de eutanasia, se extrajeron muestras de sangre del plexo retroorbitario y luego se colocaron en tubos plásticos por al menos 4 h a 4 °C. El suero se obtuvo por centrifugación a 750×g durante 15 min, y niveles de BUN y SCR se analizaron usando analizador bioquímico automático.

Detección de niveles de citoquinas inflamatorias

Los riñones derechos de los ratones se removieron, congelaron rápidamente en hielo seco y almacenaron a -80 °C hasta su uso en procedimientos siguientes. Muestras de tejido (100 mg) de diferentes grupos se homogeneizaron con PBS en hielo y luego centrifugaron a 750×g durante 15 min. Los sobrenadantes se recogieron para determinar niveles de MCP-1, IL-10 e IL-1β usando kits ELISA respectivos según instrucciones del fabricante.

Histología renal

Muestras de tejido renal izquierdo de ratones se fijaron en formalina neutra bufferizada al 10% a 4 °C por más de 48 h, deshidrataron, incluyeron en parafina, cortaron en secciones y tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Cambios morfológicos se compararon entre grupos control, modelo y PCCC-CDs-tratados.

Actividad trombocitopénica

El PLT se realizó en sangre extraída de ratones del plexo retroorbitario y detectado usando analizador hematológico automático (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japón).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó usando el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS, versión 13.0). Los datos normalmente distribuidos y varianzas homogéneas se expresan como medias ± desviación estándar (DE). ANOVA de un factor seguido de prueba de diferencia mínima significativa (LSD) se usó para comparaciones múltiples. P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización de PCCC-CDs

TEM se usó para observar directamente la morfología y distribución de tamaño de PCCC-CDs (Fig. 2a, c, d). Los CDs preparados fueron esféricos y uniformes en tamaño, con la mayoría a 2.84 ± 0.89 nm sin agregaciones distintas. La imagen HRTEM mostró franjas de red (0.24 nm) de los CDs, que correspondieron a carbono grafítico como se muestra en Fig. 2b.

Como se muestra en Fig. 3a, los CDs exhibieron fluorescencia azul distinta con pico máximo a 445 nm tras excitación a 370 nm. Correspondientemente, la información óptica de PCCC-CDs mostrada en el espectro UV-Vis mostró un pico de absorción fuerte a 265 nm correspondiente a transición π-π* de moléculas orgánicas conjugadas en superficies de CDs (Fig. 3b).

Además, los grupos funcionales de los CDs formulados se identificaron en detalle basándose en el espectro FTIR, como se muestra en Fig. 3c. El pico a 3433 cm⁻¹ se asignó a bandas de absorción de vibraciones de estiramiento O-H y N-H, mientras vibraciones de estiramiento C-H aparecieron a 2923 cm⁻¹ y 2853 cm⁻¹. Además, el pico de absorción a 1624 cm⁻¹ indicó presencia de C=O. Enlaces C-O-C se observaron a 1109 cm⁻¹, y el pico a 1400 cm⁻¹ se atribuyó a estiramiento C-N. Estos hallazgos fueron consistentes con reportes previos.

Citotoxicidad in vitro

Para evaluar citotoxicidad, células L02 y 293 T se expusieron a varias concentraciones de PCCC-CDs durante 24 h y la viabilidad se examinó usando ensayo CCK-8. Como se ilustra en Fig. 4a, la viabilidad de células L02 tratadas con PCCC-CDs fue > 85% comparada con células control, incluso a concentración tan alta como 5 mg/mL. Similarmente, PCCC-CDs no afectaron crecimiento de células 293 T a concentraciones hasta aproximadamente 2500 μg/mL (Fig. 4b). Estos resultados indicaron que PCCC-CDs mostraron baja citotoxicidad.

Efecto de PCCC-CDs en concentraciones de UTP y MALB

Comparado con nivel de UTP en grupo control (0.98 ± 0.38 mg/L), los niveles de UTP aumentaron significativamente en grupo tratado con veneno de D. acutus (3.08 ± 0.92 mg/L, P < 0.01) y grupo PCCC-CDs (2.36 ± 0.83 mg/L, P < 0.05) (Fig. 5a). Además, el nivel de UTP disminuyó tras tratamiento con PCCC-CDs comparado con niveles tras administración de veneno (P < 0.05). Adicionalmente, el nivel de MALB aumentó obviamente 24 h tras inyección intraperitoneal de veneno de D. acutus (17.78 ± 5.96 mg/L, P < 0.01) comparado con grupo control (2.02 ± 0.91 mg/L). En contraste, ratones tratados con PCCC-CDs mostraron tendencia a disminución en nivel de MALB (14.25 ± 4.16 mg/L, Fig. 5b).

PCCC-CDs alivian disfunción renal en ratones con AKI inducida por veneno de D. acutus

La función renal se evaluó midiendo niveles de BUN y SCR, mostrados en Figs. 6 y 7. Ratones tratados con veneno de D. acutus tuvieron niveles significativamente más altos de BUN (12.07 ± 1.00 mmol/L [1 día], P < 0.01; 11.43 ± 1.37 mmol/L [2 días], P < 0.01; 14.83 ± 2.53 mmol/L [5 días], P < 0.01) y SCR (12.83 ± 1.43 μmol/L [1 día], P < 0.01; 13.48 ± 2.26 μmol/L [2 días]; P < 0.01. 13.80 ± 1.90 μmol/L [5 días], P < 0.01) que ratones tratados con NS (BUN: 8.95 ± 1.04 [1 día], 9.53 ± 1.40 [2 días], y 9.07 ± 1.57 [5 días] mmol/L; SCR: 9.40 ± 0.89 [1 día], 10.27 ± 2.04 [2 días], y 9.85 ± 1.99 [5 días] μmol/L) del día 1 al 5 (Figs. 6a y 7a). Notablemente, comparado con grupo modelo, tratamiento con PCCC-CDs a dosis baja inhibió significativamente el aumento de niveles de SCR (9.77 ± 0.79 μmol/mL, P < 0.01) y BUN (10.50 ± 1.38 mmol/L, P < 0.05), mientras que dosis altas (9.62 ± 1.87 μmol/mL, P < 0.01) y medias (10.75 ± 1.48 μmol/mL, P < 0.05) inhibieron el aumento de SCR (Fig. 7b) pero no de BUN (Fig. 6b) inducido por veneno de D. acutus en día 1. Los niveles de SCR (Fig. 7c) de grupos tratados con dosis alta, media y baja de PCCC-CDs disminuyeron (10.97 ± 0.88, 10.42 ± 1.75 y 10.68 ± 1.41 μmol/mL, respectivamente; P < 0.05) que en grupo modelo en día 2. Además, comparado con grupo modelo, niveles de BUN disminuyeron significativamente en grupos de dosis alta (9.57 ± 0.52 mmol/L, P < 0.01) y baja (10.72 ± 2.04 mmol/L, P < 0.05) de PCCC-CDs pero no en grupo de dosis media (Fig. 6c) en día 2. Como se muestra en Figs. 6d y 7d, efectos inhibidores se observaron en niveles de ambos índices a dosis alta (12.28 ± 1.65 mmol/L, P < 0.01 (BUN); 11.38 ± 1.80 μmol/mL, P < 0.05 (SCR), respectivamente) y media (12.40 ± 1.33 mmol/L, P < 0.05 (BUN); 10.83 ± 2.57 μmol/mL, P < 0.05 (SCR), respectivamente) de PCCC-CDs. Además, no se observó diferencia significativa entre grupos control y PCCC-CDs-tratados en SCR.

PCCC-CDs inhiben secreción de citoquinas

Se investigaron los efectos de tres concentraciones de PCCC-CDs sobre la producción de quimioatrayente (MCP-1) y citoquinas proinflamatorias (IL-1β) y antiinflamatorias (IL-10) en respuesta a inyecciones de veneno de D. acutus. La Figura 8 mostró que la inyección de veneno aumentó la IL-1β liberada en modelo murino (1 h: 58.19 ± 5.35 ng/mL, P < 0.01; 3 h: 56.57 ± 3.54 ng/mL, P < 0.01; 12 h: 49.48 ± 7.74 ng/mL, P < 0.05; día 1: 41.09 ± 4.82 ng/mL, P < 0.05; día 2: 47.96 ± 8.33 ng/mL, P < 0.05; día 5: 45.11 ± 6.95 ng/mL, P < 0.05) comparado con niveles en ratón tratado con NS (1 h: 35.96 ± 4.72 ng/mL, 3 h: 34.94 ± 2.58 ng/mL, 12 h: 36.42 ± 5.25 ng/mL, día 1: 34.47 ± 3.67 ng/mL, día 2: 39.84 ± 3.71 ng/mL, día 5: 36.82 ± 8.27 ng/mL). Como se muestra en Fig. 8b-d, comparación con grupo inducido por veneno de D. acutus mostró que exposición de 1, 3 y 12 h a dosis alta (50.09 ± 7.68 ng/mL, P < 0.05 [1 h]; 40.36 ± 8.51 ng/mL, P < 0.01 [3 h]; 39.87 ± 4.64 ng/mL, P < 0.05 [12 h], respectivamente) y baja (46.64 ± 3.83 ng/mL, P < 0.01 [1 h]; 37.65 ± 9.61 ng/mL, P < 0.01 [3 h]; 38.75 ± 6.64 ng/mL, P < 0.05 [12 h], respectivamente) de PCCC-CDs disminuyeron significativamente niveles de IL-1β. Además, PCCC-CDs a dosis media redujeron significativamente nivel de IL-1β (41.50 ± 11.08 ng/mL, P < 0.01) comparado con ratones tratados con veneno a 3 h pero no en otros puntos temporales.

Los niveles de citoquina antiinflamatoria IL-10 aumentaron dramáticamente en grupo tratado con veneno de D. acutus en diferentes puntos temporales (23.27 ± 0.72 ng/mL, P < 0.01; 22.03 ± 0.96 ng/mL, P < 0.05; 21.76 ± 1.99 ng/mL, P < 0.05; 26.31 ± 6.55 ng/mL, P < 0.01; 3 h, 12 h, día 1 y día 2, respectivamente) comparado con grupo tratado con NS (Fig. 9). En marcado contraste, tratamiento con dosis alta y media de PCCC-CDs (17.17 ± 4.04 y 17.25 ± 5.64 ng/mL, respectivamente, ambos P < 0.05) inhibieron secreción de IL-10 inducida por veneno a 3 h mientras que dosis baja de PCCC-CDs inhibió los niveles a 3 h, 12 h y día 1 (17.17 ± 5.24, 17.83 ± 4.11 y 18.31 ± 2.14 ng/mL, respectivamente, todos P < 0.05). No se observó diferencia significativa entre grupos tratados con PCCC-CDs y NS.

Además, Fig. 10 muestra que la inyección de veneno de D. acutus aumentó significativamente la liberación de MCP-1 en grupo modelo (1 h: 197.45 ± 22.34 ng/mL, P < 0.01; 3 h: 182.42 ± 12.94 ng/mL, P < 0.01; 12 h: 169.20 ± 26.74 ng/mL, P < 0.01; 24 h: 142.81 ± 25.85 ng/mL, P < 0.05) comparado con control tratado con NS (1 h: 115.82 ± 14.80 ng/mL; 3 h: 106.46 ± 13.76 ng/mL; 12 h: 120.35 ± 15.75 ng/mL; y 24 h: 108.81 ± 25.60 ng/mL). Más notable, tratamiento de ratones envenenados con las tres dosis de PCCC-CDs inhibió el aumento en niveles de MCP-1. Dosis media (3 h: 136.84 ± 39.94 ng/mL, P < 0.01; 12 h: 127.48 ± 13.75 ng/mL, P < 0.01) y baja (1 h: 152.13 ± 18.89 ng/mL, P < 0.05; 3 h: 129.54 ± 30.85 ng/mL, P < 0.01; 12 h: 118.75 ± 19.96 ng/mL, P < 0.01) de PCCC-CDs inhibieron el aumento en niveles de MCP-1 a 1, 3 y 12 h, excepto dosis media a 1 h (178.20 ± 22.79 ng/mL). Tratamiento con dosis alta de PCCC-CDs disminuyó efectivamente nivel de MCP-1 solo a 3 h (131.42 ± 24.62 ng/mL, P < 0.01).

En contraste, niveles de IL-1β, IL-10 y MCP-1 de grupos tratados con PCCC-CDs en ciertos puntos temporales no fueron significativamente diferentes de los del grupo modelo, y mostraron tendencia decreciente.

Efecto de PCCC-CDs en la inhibición de trombocitopenia

Las PLT tienen un papel específico en la patogénesis de AKI; por tanto, se investigó el recuento de PLT y los resultados se muestran en Fig. 11. Comparado con valores de PLT del grupo control (1 h: [1228 ± 51] × 10⁹; 3 h: [1120 ± 36] × 10⁹; 12 h: [1245 ± 111] × 10⁹; día 1: [1177 ± 69] × 10⁹; día 2: [1195 ± 51] × 10⁹; y día 5: [1181 ± 46] × 10⁹), ocurrió una reducción drástica tan temprano como 1 h tras administración de veneno de D. acutus, con un nadir a 3 h. Posteriormente, PLT aumentó constantemente hasta día 5 (1 h: [354 ± 70] × 10⁹, P < 0.01; 3 h: [315 ± 77] × 10⁹, P < 0.01; 12 h: [435 ± 91] × 10⁹, P < 0.01; día 1: [663 ± 226] × 10⁹, P < 0.01; día 2: [941 ± 248] × 10⁹, P < 0.05; día 5: [1083 ± 89] × 10⁹). Notablemente, incluso en este intervalo, los valores de PLT fueron significativamente menores que los de ratones control. Además, administración de PCCC-CDs a dosis de 8 mg/kg inhibió marcadamente la trombocitopenia inducida por veneno a 1 h ([435 ± 91] × 10⁹, P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10⁹, P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10⁹, P < 0.01), día 1 ([1028 ± 248] × 10⁹, P < 0.01) y día 2 ([1183 ± 89] × 10⁹, P < 0.01). Este efecto inhibitorio también se observó a dosis de 2 mg/kg PCCC-CDs a 3 h y día 2 y 4 mg/kg PCCC-CDs a día 2, además de aumento de PLT. Aunque no hubo diferencia significativa entre grupos modelo y dosis media, se observó tendencia creciente en otros puntos temporales diferentes.

Observaciones histopatológicas

La lesión renal en grupo veneno se evaluó histológicamente. Como se muestra en Fig. 12a, en contraste con grupo tratado con NS, que mostró glomérulos y celularidad tubular normales, se observaron cambios marcados en parénquima renal de grupo tratado con veneno de D. acutus. Estos cambios incluyen hemorragia marcada, dilatación tubular renal y degeneración. Cotratamiento con PCCC-CDs previno daño renal inducido por veneno de D. acutus, y el examen histopatológico de la arquitectura de tejidos renales fue casi normal con hemostasia leve, dilatación tubular renal y degeneración.

Discusión

Como nanomaterial emergente, los CDs comienzan a ocupar un nicho importante como materiales innovadores para nanomedicinas de próxima generación. Comparados con puntos cuánticos basados en metales pesados tradicionales, los CDs son buenos candidatos para aplicación biomédica debido a sus características únicas que tienen ventajas potenciales considerables en desarrollo de nuevos medicamentos con toxicidad relativamente baja.

Las partículas de PCCC-CDs derivadas fueron cuasi-esféricas y bien dispersadas en agua, con abundantes grupos funcionales presentes en la superficie. Esta observación es consistente con hallazgos reportados previamente. Además, los CDs preparados mostraron baja toxicidad contra células L02 y 237 T, lo que indicó su idoneidad para aplicaciones biomédicas.

El estudio actual es el primero, a nuestro conocimiento, en demostrar las notables bioactividades de PCCC-CDs sobre AKI inducida por mordedura de serpiente D. acutus. D. acutus es ampliamente llamada "cinco pasos" o "cien pasos" en medicina popular china debido a la descripción folklórica de que personas o animales mordidos por D. acutus no podían caminar más de 100 pasos. Más del 90% de la población de D. acutus se encuentra en China, y la frecuencia de condiciones críticas e incluso muertes relacionadas con mordedura de esta serpiente es mayor que la de muchas otras serpientes venenosas. AKI es el efecto sistémico más grave y complicación común, que conduce a isquemia renal secundaria y fallo. Un conocimiento mejorado de información relevante sobre AKI inducida por envenenamiento de D. acutus contribuiría al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Sin embargo, en contraste con el conocimiento considerable disponible sobre nefrotoxicidad de veneno de serpiente en general, la información sobre AKI inducida por veneno de D. acutus es rara, lo que nos llevó a investigar esta medicina potencial que aún está en etapas tempranas de desarrollo.

En este estudio, establecimos un modelo de AKI inyectando intraperitoneal veneno de D. acutus en ratones para evaluar la patogénesis compleja y multifactorial de AKI inducida por veneno. Además, el modelo proporcionó una herramienta para investigar los efectos protectores de PCCC-CDs contra AKI inducida por veneno de D. acutus.

Experimentos actuales han mostrado desarrollo de AKI sustancial con cambios distintos en citoquinas inflamatorias e índices bioquímicos séricos y urinarios, así como evidencia histopatológica de lesión renal tras inyección intraperitoneal de veneno de serpiente. Estos hallazgos indicaron los posibles factores que pueden contribuir principalmente a la toxicidad del veneno: (1) citotoxicidad directa del veneno contra el riñón y (2) reacciones inflamatorias renales.

Específicamente, la insuficiencia renal se confirmó aproximadamente 24 h post inyección de veneno basada en oliguria asociada con proteinuria y biomarcadores séricos elevados (SCR y BUN). Afirmamos además la afectación renal en grupo tratado con veneno de D. acutus usando análisis bioquímico, que mostró niveles significativamente elevados de UTP y MALB comparados con grupo control. Estos hallazgos indicaron presencia de malfuncionamiento glomerular y reabsorción tubular en grupo tratado con veneno, lo cual fue apoyado por evidencia de cambio histopatológico. En contraste, se observó reducción significativa en niveles de UTP y MALB en grupo tratado con PCCC-CDs a dosis media. Además, indicadores bioquímicos séricos (SCR y BUN) son otros parámetros vitales para determinar elevación de disfunción renal en AKI y permanecen indicadores clínicos en su diagnóstico. Inyectar veneno de serpiente del día 1 al 5 aumentó dramáticamente niveles de SCR y BUN, mientras que tratamiento con PCCC-CDs revirtió estos efectos, resultando en recuperación más rápida que grupo control. Más importante, los cambios distintos en tejido renal, hemorragia marcada, dilatación tubular renal y degeneración indicaron además deterioro directo del riñón por veneno. Los efectos atenuantes de PCCC-CDs sobre cambios histopatológicos se demostraron en este estudio. Estos resultados sugirieron que PCCC-CDs inhibieron manifestaciones anormales inducidas por AKI de marcadores bioquímicos urinarios y séricos asociados con disfunción renal así como daño histológico renal. Además, estos efectos pueden ser atribuibles a la mejora de la nefrotoxicidad directa de veneno de D. acutus por PCCC-CDs. Los efectos protectores de PCCC-CDs fueron evidenciados por la inhibición de daño renal directo inducido por veneno de D. acutus.

Una respuesta inflamatoria intensa es característica común inducida por envenenamiento de animales venenosos como serpientes y orugas. Signos de inflamación sistémica con infiltración de células mononucleares, leucocitosis neutrofílica, degeneración y necrosis de células epiteliales tubulares también se han mostrado en deterioro renal inducido por inyección de veneno de serpiente. MCP-1 es una proteína de molécula pequeña que juega papel vital en reclutamiento y activación de leucocitos durante respuestas inflamatorias. Además, fagocitos mononucleares y linfocitos pueden contribuir a lesión aguda de células renales por diferentes mecanismos como secreción de mediadores proinflamatorios, que pueden inducir células renales residentes a expresar quimiocinas. La implicación de MCP-1, citoquinas inflamatorias (IL-1β) y citoquina antiinflamatoria (IL-10) en respuesta inflamatoria en patogénesis de AKI en ratones inyectados solo con veneno de D. acutus se demostró en presente estudio. Esta observación indicó que el mecanismo subyacente de AKI inducida por veneno de D. acutus puede asociarse con respuesta inflamatoria renal. La evidencia de que exposición a PCCC-CDs redujo significativamente niveles de IL-1β, IL-10 y MCP-1 sugiere que CDs pueden exhibir renoprotección inhibiendo reacciones inflamatorias renales.

Además, PLT juegan papel crucial en procesos hemostáticos e inflamatorios agudos y se asocian con diversas patologías inflamatorias. Son altamente sensibles y responden rápidamente a cambios biológicos cuando un organismo está herido o sangra, como primeras células en llegar al sitio de lesión aguda para interactuar con células endoteliales y leucocitos. PLT están involucradas en patogénesis de AKI y se consideran marcador pronóstico significativamente asociado con peor resultado de AKI. Este estudio proporcionó evidencia de que veneno de D. acutus disminuyó conspicuamente recuento de PLT, consistente con resultados de estudios reportando que trombocitopenia puede ser inducida por veneno de serpiente. Observamos que exposición a PCCC-CDs elevó significativamente recuentos de PLT, consistente con hallazgos de estudio previo.

Las anomalías de AKI inducida por veneno de D. acutus fueron, a nuestro conocimiento, demostradas por primera vez en el estudio actual e incluyeron principalmente disfunción renal asociada con proteinuria, oliguria, niveles elevados de BUN y SCR, daño patológico renal, respuestas inflamatorias y trombocitopenia.

Notablemente, PCCC-CDs demostraron actividad protectora contra AKI inducida por veneno de D. acutus inhibiendo las alteraciones asociadas, como se evidenció en este estudio por primera vez. Este estudio fue una evaluación preliminar de efectos beneficiosos de PCCC-CDs sobre AKI inducida por veneno de D. acutus, y futuras investigaciones del mecanismo subyacente serían foco de estudios futuros.

Conclusión

Los impresionantes efectos protectores de PCCC-CDs sobre AKI inducida por veneno de D. acutus han sido demostrados en este estudio, por primera vez, a nuestro conocimiento. Los efectos relacionados con AKI se manifestaron principalmente como disfunción renal, daño patológico renal, respuestas inflamatorias y trombocitopenia. Estos resultados indicaron que PCCC-CDs tienen perspectivas de aplicación potencial para uso como medicina complementaria para tratamiento de anomalías inducidas por AKI por veneno de D. acutus. Además, esto proporciona una estrategia novedosa para el estudio de ingredientes activos de formulaciones de medicina tradicional china, y amplía aún más las aplicaciones biomédicas de CDs.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo publicado.

Abreviaturas

AKI:

Lesión renal aguda

BUN:

Nitrógeno ureico en sangre

CDs:

Puntos de carbono

D. acutus:

Deinagkistrodon acutus

HE:

Hematoxilina y eosina

IL:

Interleucina

MALB:

Microalbuminuria

MCP-1:

Proteína quimiotáctica de monocitos 1

PCC:

Corteza de Phellodendron chinensis

PCCC-CDs:

Puntos de carbono de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata

PLT:

Recuento de plaquetas

SCR:

Creatinina sérica

UTP:

Proteína total urinaria