Complejos PEG-Polímero de Quimioterapéuticos 4-Tiazolidinona Dispersos en Agua Mejoran Actividad Pro-Apoptótica Contra Células Glioma Rata C6

Resumen

Objetivo

Estudiar si la formulación acuosa del complejo de derivados 4-tiazolidinona con un nanotransportador polimérico que contiene PEG mejora su acción pro-apoptótica hacia células glioma rata C6.

Métodos

Mecanismos efectos antineoplásicos derivados 4-tiazolidinona investigados in vitro con células glioma rata C6. Natividad celular, patrón ciclo celular, expresión Annexin V evaluados y daño ADN estimado análisis cometa ADN. Nueva formulación base agua derivados 4-tiazolidinona complejados con nanotransportador polimérico utilizada mejorar acción pro-apoptótica hacia células C6.

Resultados

Derivados 4-tiazolidinona estudiados usan mecanismos apoptosis para matar células glioma rata C6, confirmado por análisis FACS células en etapa pre-G1, aparición células C6 Annexin V positivas, y aumento número cometas ADN clases superiores. Complejación compuestos estudiados con nanotransportador polimérico conteniendo PEG aumentó significativamente efectos pro-apoptóticos en células glioma rata C6 medidos todos métodos mencionados.

Conclusión

Complejación derivados 4-tiazolidinona con nanotransportador polimérico conteniendo PEG proveyó solubilidad agua y mejoró efectos pro-apoptóticos en células glioma rata C6.

Introducción

Quimioterapia principal modalidad tratamiento muchos tumores, fármacos quimioterapéuticos elegidos última opción, especialmente cuando cáncer ya diseminado. Sin embargo, efectos secundarios negativos severos reducen eficacia clínica muchos fármacos anticancerosos actuales. Por tanto, necesidad continua y crucial desarrollar fármacos anticancerosos alternativos o sinérgicos con efectos secundarios reducidos o mínimos.

Baja solubilidad agua fármacos anticancerosos ha sido problema prevalente y serio que obstaculiza desarrollo y aplicación clínica, muchos agentes quimioterapéuticos altamente activos y prometedores excluidos por baja solubilidad agua. Surfactantes y co-solventes usados altas concentraciones solubilizar agentes anticancerosos insolubles agua; sin embargo, estas sustancias también pueden producir efectos adversos, limitando uso muchos fármacos anticancerosos.

Gran desafío desarrollo fármacos farmacéuticos eliminar o al menos reducir efectos secundarios negativos fármacos altamente activos, especialmente agentes antitumorales demostrando toxicidad general cuerpo que restringe significativamente su uso. Forma efectiva superar este problema usar nanotransportador multifuncional fármaco que permita agentes antitumorales tóxicos unirse sitio entrega células objetivo órganos o tejidos específicos. Pequeño tamaño, estructura específica controlada, gran área superficial, forma nanopartículas proveen varias ventajas comparados otros materiales. Usando nanopartículas, posible optimizar eficiencia, minimizar efectos secundarios negativos, mejorar terapia cáncer. Así, fármacos fallaron anteriormente debido alta toxicidad general ahora segunda oportunidad uso clínico, debido inclusión sistema entrega con biodisponibilidad mejorada y liberación controlada. Tales complejos fármaco-transportador penetran más fácilmente barreras naturales como barrera hematoencefálica o membranas células individuales. Gran área superficial nanopartículas permite formar complejos biomoléculas vector específicas asisten entrega fármaco órgano objetivo, conducen reducción significativa o incluso eliminación completa efectos secundarios negativos, permiten aumento dosis mínima efectiva durante sola administración medicamento, mejoran efectividad acción fármaco, dan nuevo impulso desarrollo farmacoterapia personalizada. Adicionalmente, nanopartículas pueden encapsular moléculas mejoran solubilidad, estabilidad, absorción ciertos fármacos. Sistemas entrega fármacos pueden proporcionar circulación prolongada fármaco sangre, capacidad fármaco acumular durante proceso fisiopatológico, capacidad transferir eficazmente molécula sustancia activa células y orgánulos células. Nanopartículas deben ser estables, mantener estructura química cierto período tiempo, y al mismo tiempo, capaces bio-degradación.

Evaluar nuevos fármacos anticancerosos, importante medir actividad citotóxica y potencia usando varias líneas células cancerígenas humanas objetivo, y modelos tumorales experimentales in vivo. Quimioterapia a menudo falla por deficiencia proceso apoptosis que juega papel pivotal muerte celular inducida fármaco consecutiva o resultante cambio tumorigénesis.

Dado muchas células malignas pueden evadir muerte apoptótica, enfoque racional debe usarse diseño desarrollo nuevos fármacos anticancerosos. Metas principales crear nuevos fármacos anticancerosos: (1) encontrar formas superar mutaciones células cancerígenas individuales impactan mecanismos independientes acción fármaco; (2) diseñar regímenes quimioterapia capaces simultáneamente objetivo vías independientes. Mejor comprensión relación genética cáncer y sensibilidad tratamiento clave desarrollar nuevos fármacos anticancerosos efectivos.

Estudios previos demostramos derivados sintéticos 4-tiazolidinona (Les-3288, Les-3833, Les-3882) probablemente usan mecanismos acción diferentes otros agentes anticancerosos para matar células glioma rata C6 y glioblastoma humano U251 in vitro, contrariamente doxorrubicina (Dox). Les-3288 no afectó significativamente nivel especies reactivas oxígeno (ROS) células tratadas. Debe enfatizarse estos potentes agentes antitumorales mostraron menor toxicidad general cuerpo animales experimentales, demostrado parámetros bioquímicos acción tóxica células tumorales y animales, comparados Dox. Así, unión fármaco antitumoral con nanotransportador polimérico (PNC) y aplicación forma sistema entrega agua estable puede reducir efectos tóxicos órganos animales, comparado acción sustancias forma libre.

Objetivo este trabajo estudiar inducción apoptosis células glioma linea C6 in vitro e in vivo formulaciones base agua complejos derivados 4-tiazolidinona con PNC conteniendo PEG, comparar inducción apoptosis usando derivados forma libre.

Materiales y Métodos

Fármacos Anticancerosos

Derivados heterocíclicos 4-tiazolidinona (compuestos Les-3288 y Les-3833, Fig.1) sintetizados Departamento Farmacéutica, Química Orgánica y Bioorgánica Universidad Médica Nacional Danylo Halytsky Lviv, Ucrania, como descrito previamente.

Nanotransportador Polimérico

PNC entrega fármaco sintetizado Departamento Química Orgánica Universidad Politécnica Nacional Lviv, Ucrania, usando metodología descrita anteriormente. Síntesis poli(VEP-co-GMA)-graft-PEG realizada etapas subsiguientes. Poli(VEP-co-GMA) sintetizado copolimerización radical 5-terc-butilperoxi-5-metil-l-hexeno-3-ino (VEP, 0.41 g, 0.5 mol) (monómero peróxido sintetizado método descrito) y metacrilato glicidilo (GMA, 7.72 g, 12.2 mol) (Sigma-Aldrich, USA) en acetato etilo (7.9 mL) (Merck, Darmstadt, Alemania) usando azoisobutilronitrilo (AIBN, 0.129 g, 0.05 mol) (Merck, Darmstadt, Alemania) iniciador radical. Polimerización realizada 343K hasta conversión máxima 65% alcanzada. Poli(VEP-co-GMA) usado esqueleto unión cadenas laterales PEG vía reacciones adición poli(etilenglicol) éter metilo (mPEG) grupos epóxido laterales. Trifluoruro boro eterato (0.027 mL, 0.031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) añadido solución copolímero (1.0 g) dioxano (20 mL; Merck, Darmstadt, Alemania) 313 K agitado 3 h. mPEG (2.5 mg, 3.35 mmol) (Sigma-Aldrich, USA) disuelto dioxano (15 mL) solución mezclada solución polímero esqueleto agitado 6 h 313 K. mPEG no reaccionado removido bolsas diálisis corte peso molecular (MWCO) 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, USA). Resultante polímero tipo peine poli(VEP-co-GMA)-graft-PEG secado temperatura ambiente vacío hasta peso constante. Estructuras y algunas características PNC presentadas Fig. 2 y descritas previamente.

Para preparar soluciones base agua PNC, 0.09 g PNC disuelto 0.9 mL DMSO. Esta solución PNC añadida 8.0 mL solución NaCl 0.9%. Luego, solución agitada 0.5 h y sonicada 10 s. Dispersiones agua complejos obtenidas goteando solución DMSO 4-tiazolidinonas y PNC en agua orden siguiente: 0.045 g PNC disuelto 0.15 mL DMSO (Sigma-Aldrich, USA), y 0.0015 g Les-3288 (o Les-3833) disuelto 0.10 mL DMSO. Soluciones PNC y 4-tiazolidinonas mezcladas y añadidas 4.25 mL solución NaCl 1% acuosa y sonicada 10 s.

Este PNC activo superficie contiene cadenas PEG hidrofílicas injertadas esqueleto hidrofóbico (Fig. 2a). En soluciones acuosas, PNC anfifílico forma estructuras tipo micela que pueden solubilizar compuestos insolubles agua (ej. fármacos) o estos compuestos pueden adsorbirse superficie nanopartículas, aumentando biocompatibilidad. Técnica desarrollada obtener dispersiones agua altamente estables quimioterapéuticos base 4-tiazolidinona consiste nucleación partículas fármaco nanoescala ocurre cuando soluciones diluidas DMSO transferidas solución precipitante salina conteniendo surfactante polimérico PNC que proporciona recubrimiento polímero superficie nanopartícula. Como resultado, debido agregación y sedimentación, complejo estabilizó y dispersión previno. Adicionalmente, complejos nanoescala derivados 4-tiazolidinona protegidos posibles interacciones microambiente biológico circundante. Esta protección permite permanecen más tiempo cuerpo sin perder estabilidad y acumular tejido u órgano objetivo sin causar efectos secundarios negativos. Así, tal modificación proporciona estabilidad agregación y sedimentación mejorada dispersiones agua nanopartículas compuesto anticanceroso.

Tamaños micelas polímero PNC y complejos PNC con heterocíclicos 4-tiazolidinonas medidos dispersión luz dinámica (DLS) usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Alemania) y DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) y espectros correlación fotones usando retrodispersión no invasiva (NIBS) tecnología 25°C. Muestras mediciones DLS preparadas como descrito, y si necesario, diluidas agua bi-destilada, pH 6.5–7.0. Tres-cinco mediciones cada muestra (cada medición consistió 5 ciclos rango entre mediciones 5 min). Figura 3 muestra distribución tamaño estructuras micelares PNC y nanopartículas complejos PNC con heterocíclicos 4-tiazolidinonas (Les-3833 y Les-3288) analizadas DLS. Tamaño y morfología micelas PNC así como nanopartículas 4-tiazolidinona recubiertas PNC estudiadas microscopio transmisión electrónica JEM-200A (JEOL, Japón) voltaje aceleración 200 kV. Muestras preparadas como descrito, y si necesario, diluidas agua bi-destilada. Muestras preparadas rociando solución probada sustrato mediante dispersor ultrasónico UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ucrania), facilita recubrimiento uniforme sustrato. Película carbono amorfo delgada depositada malla cobre usada sustrato. Tamaños y morfología micelas PNC y complejos con heterocíclicos 4-tiazolidinonas (Les-3288 y Les-3833) estudiados métodos DLS y TEM presentados Fig. 3.

Estudios DLS y microscopía transmisión electrónica (TEM) demostraron tamaños micelas PNC 50 ± 25 nm y nanopartículas formadas complejos PNC con heterocíclicos 4-tiazolidinonas Les-3833 y Les-3288 fueron 140 ± 25 nm y 155 ± 30 nm, respectivamente. Dispersiones complejos PNC con derivados 4-tiazolidinona altamente estables y protegidas agregación y sedimentación por capa PNC adsorbida superficie nanopartícula tiazolidinona. Como Fig. 4, cambios tamaños nanopartículas dispersas sistema agua insignificantes múltiples diluciones agua, así como tras 6 meses envejecimiento sistemas agua complejos PNC con 4-tiazolidinonas.

Cultivo Celular

Células glioma rata linea C6 obtenidas Colección Cultivo Celular Instituto Biología Molecular Genética, Academia Nacional Ciencias Ucrania (Kiev, Ucrania). Células cultivadas medio Dulbecco modificado Eagle (DMEM, Sigma, USA) suplementado 10% suero fetal bovino (Sigma, USA). Células crecidas incubadora CO₂ 37°C, 5% CO₂, 95% humedad. Re-siembra células realizada ratio 1:5 una cada 2–3 días.

Evaluación Acción Citotóxica Sustancias Estudiadas

Células sembradas placas 24 pocillos concentración 100,000 células/mL un pocillo. Sustancias estudio añadidas concentraciones 0.1, 0.5, 1.0 μM tras período adaptación 24 h inició tras siembra. Conteo celular realizado intervalos regulares cámara conteo hemocitométrico usando tinte Azul Tripano (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, USA) concentración final 0.01%, 2 min tras adición suspensión celular. Células muertas tomaron tinte debido daño membrana plasmática.

Citometría Flujo

Estudiar ciclo celular apoptosis, células C6 tratadas Les-3288, Les-3833 y complejos con PNC, así como PNC forma libre, lavadas fosfato salino tampón (PBS, pH 7.4), pelletizadas centrifugación 1000 rpm 5 min 4°C re-suspendidas PBS frío (2 millones células por 1 mL PBS). Luego, células fijadas añadiendo alícuotas 4 mL etanol absoluto enfriado −20°C agitación suave. Muestras fijadas mantenidas −20°C hasta uso (no más 1 semana). Análisis citometría flujo activada fluorescencia (FACS), muestras celulares centrifugadas 1000 rpm 5 min 4°C, sobrenadante descartado pellet celular re-suspendido 1 mL PBS. Cien microlitros RNasa libre DNasa (Sigma, USA) añadido suspensión, incubadas 37°C 30 min. Luego, cada muestra suplementada 100 μl yoduro propidio (PI) (Sigma, USA, 1 mg/mL), incubada temperatura ambiente 10 min. Finalmente, muestras transferidas tubos Falcon, suspensión celular monitoreada citómetro flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA) software Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) medir parámetros ciclo celular apoptosis.

Medición células Annexin V-positivas (apoptóticas) realizada análisis FACS. Células glioma rata C6 tratadas concentraciones 0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL PNC, Les-3288, Les-3833, y conjugados poliméricos como indicado bajo figuras. Final experimento, células desprendidas fondo plato solución Tripsina-EDTA, lavadas dos veces PBS, teñidas Annexin V-FITC usando Kit Detección Apoptosis (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), según instrucciones fabricante. Células lavadas incubadas 15 min tampón unión Annexin V (BD Pharmingen), conteniendo 1/50 volumen solución Annexin V conjugada FITC. Luego, muestras diluidas dos veces volumen apropiado tampón unión Annexin V e inmediatamente medidas canal FL1/FL2 (FITC-PI) citómetro flujo (Becton Dickinson, USA). Células Annexin V-positivas simples clasificadas apoptóticas.

Ensayo Cometa ADN

Ensayo cometa ADN realizado condiciones alcalinas. Diez mil células mezcladas 75 μl agarosa bajo punto fusión (0.5%) por muestra. Tras mezclar, muestra pipeteada portaobjetos cubierto previamente 1.5% agarosa normal punto fusión. Muestras incubadas 4°C durante 18 h solución lisis (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Permitir desenrollado ADN y expresión daño labil alcalino, portaobjetos incubados solución alcalina temperatura ambiente 20 min (realizado oscuridad). Electroforesis (~74 V/cm 30 min), portaobjetos transferidos cámara horizontal 1x tampón electroforesis (0.3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) añadido. Portaobjetos fijados metanol hielo-frío 100% y secados. Portaobjetos teñidos 80 μL 1× bromuro etidio (EtBr) 5 min y luego sumergidos agua destilada fría remover exceso tinte. Cometas ADN visualizados microscopio (Carl Zeiss, Alemania), imágenes analizadas software 'CASP' (Casplab-1.2.3b2 software, CASPlab, Wroclaw, Polonia). Cien cometas por muestra contados. Daño ADN categorizado cinco niveles genotoxicidad según tamaño cola cometa: 0 (0–5% daño), 1 (5–25%), 2 (25–45%), 3 (45–70%), 4 (más 70% daño). Índice daño (DI) calculado, como descrito previamente.

Ensayo Intercalación ADN Usando Tinte Verde Metilo

Compuestos Les-3288 y Les-3833 investigados capacidad intercalar molécula ADN usando ensayo verde metilo. ADN esperma salmón (10 mg/mL) incubado 1 h 37°C con 15 μL solución verde metilo (1 mg/mL H₂O). Compuestos añadidos 1 μg/mL incubados 37°C oscuridad 2 h. Volumen total final muestras 1 mL. Absorción verde metilo medida 630 nm, tras incubación muestras 2 h 37°C, usando microfotómetro multi-canal BioTek 76 883 (BioTek, Winooski, VT, USA). EtBr usado control positivo.

Análisis Datos y Estadística

Todos experimentos repetidos tres veces tres paralelos cada variante. Análisis varianza (ANOVA) usado comparación grupos. Datos distribución células glioma rata C6 diferentes fases ciclo celular analizados ANOVA unidireccional, seguido prueba post hoc Tukey comparación múltiple. Todos datos presentados media ± DE. Valor p < 0.05 considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Efecto Citotóxico (Test Exclusión Azul Tripano) Derivados 4-Tiazolidinona Usados Forma Libre y Complejo Nanotransportador Polimérico

Resultados test exclusión azul tripano demostraron formas base agua complejos Les-3288 y Les-3833 con PNC tenían toxicidad mejorada hacia glioma células C6 (tratamiento 24 h y 48 h) comparado citotoxicidad observada forma libre compuestos (Figs. 5 y 6). Mayor efecto citotóxico observado dosis 0.1 y 0.5 μM Les-3288 y Les-3833 complejos PNC, mientras dosis más alta (1.0 μM) mejora complejación PNC detectada solo caso Les-3288 24 h (Figs. 5 y 6).

Complejación Compuestos Les-3833 y Les-3288 Con Nanotransportador Polimérico Mejora Actividad Pro-Apoptótica In Vitro Hacia Células Glioma Rata C6

Dos enfoques alternativos usados evaluar efecto modulador PNC potencial citotóxico derivados 4-tiazolidinona seleccionados. Primero, análisis ciclo celular conducido investigar impacto complejos fármaco-PNC ciclo celular. Adicionalmente, tinción doble Annexin V/PI utilizada distinguir tipo exacto muerte celular inducida nanocompuestos.

Les-3288 y Les-3833 dosis bajas (0.1 μg/mL y 0.5 μg/mL) no produjeron efecto visible ni progresión ciclo celular ni inducción apoptosis, como Fig. 7 y Tabla 1. Sin embargo, complejación ambos compuestos con PNC aumentó significativamente número células fase pre-G₁ (4-veces Les-3288 y 6-veces Les-3833), indicando mayor impulso potencial pro-apoptótico. Debe enfatizarse PNC forma libre no impacto ciclo celular ni inducción apoptosis; así, aparición gran población células pre-G1 bajo tratamiento complejos tiazolidinona-nanotransportador no explicada simple efecto sinérgico PNC fármacos experimentales.

Confirmar pico sub-G1 observado consiste células apoptóticas, analizaron resultados tinción Annexin V/PI. No observamos externalización significativa fosfatidilserina (marcador principal apoptosis temprana, detectado Annexin V conjugado FITC) durante tratamiento glioma C6 bajas (0.1 y 0.5 μg/mL) y altas dosis Les-3288 (1.0 μg/mL), sugiriendo compuesto débil inductor apoptosis. En cambio, hallamos aumento población células necróticas (1.2% control a 11.25% Les-3288, 1.0 μg/mL), lo que puede indicar Les-3288 al menos parcialmente causa muerte celular necrótica. Sin embargo, complejación Les-3288 con PNC cambió completamente modo acción fármaco. Hubo aumento masivo números células apoptóticas tempranas (Annexin V(+)/PI(−)) y tardías (Annexin V(+)/PI(+)), mientras cantidad total células puramente necróticas permaneció nivel control (células no tratadas) (Fig. 8a). Así, unión Les-3288 con PNC no solo mejora fuertemente actividad pro-apoptótica hacia células glioma, sino también disminuye potencial mecanismo muerte celular pro-necrótico. Hallazgos pueden importancia clave práctica clínica porque fármacos pro-necróticos no recomendados uso debido inducción masiva inflamación inconveniente pacientes.

Sorprendentemente, no observamos mismo efecto complejo Les-3833+PNC. De hecho, actividad pro-apoptótica complejo Les-3833+PNC menor comparado Les-3288 forma libre todas concentraciones probadas (Fig. 8b). Tal diferencia drástica entre ambos compuestos podría explicarse especificidad estructura química, especulamos caso Les-3833 estructura polímero debería optimizarse lograr mejores resultados.

Ensayo Cometa Daño ADN Células Glioma Rata C6 Causado Derivados 4-Tiazolidinona Forma Libre Complejados PNC

Ensayo cometa alcalino permite detección roturas simple cadena ADN sitios labiles alcalino. Resultados estimados valor medio momento cola Olive (OTM). Nuestros datos mostraron tratamiento células glioma rata C6 Les-3288, Les-3833, PNC (concentración 0.5 μg/mL) 3 h (Figs. 9 y 10) no causaron daño ADN significativo (OTM = 0.7299 ± 0.1276, OTM = 1.466 ± 0.3086, OTM = 0.5846 ± 0.1078, respectivamente), comparado células no tratadas control (OTM = 0.4541 ± 0.07273). Sin embargo, tratamiento complejo Les-3833 + PNC (OTM = 2.3880 ± 0.2212) causó daño ADN más significativo que tratamiento forma libre Les-3833. Tal aumento daño no observado acción complejo Les-3288+PNC (Figs. 9 y 10).

Aumento tiempo incubación celular 6 h (Figs. 11 y 12) causó mayor daño ADN todos grupos experimentales: Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, Dox (control positivo). Sin embargo, efectos complejos Les-3288+PNC y Les-3833+PNC aparecieron menores efectos formas libres Les-3288 y Les-3833. Debe notarse efecto dañino ADN complejos ambos derivados PNC menor que efecto derivados forma libre.

Resultados evaluados valor medio TailDNA%. Datos obtenidos muestran incubación células glioblastoma rata C6 sustancias Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, PNC (todas concentración 0.5 μg/mL) durante 3 h (Fig. 13) no conducen daño ADN significativo (TailDNA% 4.157 ± 0.682; 3.530 ± 1.012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectivamente) comparado control (TailDNA% = 3.638 ± 0.406), pero tratamiento complejo Les-3833+PNC (TailDNA% = 19.53 ± 1.48) causa daño más significativo ADN forma libre Les-3833. Aumento tiempo incubación 6 h (Fig. 14) todos casos conduce mayor daño ADN. Nuevamente, nivel TailDNA% detectado acción complejos ambos derivados PNC menor nivel indicador acción derivados forma libre.

También usado sistema clasificación alternativo cinco categorías clasificar migración ADN calculado DI. Tabla 2 resume porcentajes células glioma rata C6 cada nivel genotoxicidad durante 3 h tratamiento. Control (células no tratadas), porcentajes mayores células niveles 0 (81.3%) y 1 (18.6%) detectados comparados estos niveles Les-3288 y PNC células tratadas. Complejación Les-3288 PNC no condujo gran cambio patrón distribución cometas ADN. En contraste, células tratadas Les-3833 mostraron menor porcentaje células nivel 0 (38.6%) mayor porcentaje nivel 1 (60.0%), mientras células tratadas Les-3833 + PNC demostraron porcentaje significativamente menor nivel 0 (8.0%) y porcentajes mucho mayores niveles 1 (76.0%), 2 (13.3%), 3 (2.6%). Indicador integral daño ADN (DI) caso aplicación tanto Les-3288 como complejo PNC no diferir significativamente control o PNC libre, mientras DI uso tanto Les-3833 como complejo PNC incluso mayor DI uso Dox.

Durante este intervalo, células tratadas Les-3833 + PNC demostraron mayor porcentaje células nivel 4 (5.3%) daño ADN que células tratadas Les-3288 otros compuestos experimentales, pero porcentajes células niveles 2 y 3 menores (16.0% y 12.0%, respectivamente) que tratamientos otros compuestos (Tabla 2). Tabla 3 resume porcentajes células glioma rata C6 daño ADN tras 6 h tratamiento. General, tendencia aparición cometas ADN clases superiores detectada cuando complejos Les-3833 y Les-3288 usados, comparado espectro clases cometas ADN inducidas formas libres estos agentes (Tabla 3). Sin embargo, indicador integral daño ADN (DI) calculado acción complejos Les-3833 y Les-3288 encontrado menor tal indicador acción formas libres estos agentes. Posible explicación nivel DI muy alto 6 h acción agentes estudiados incluso mayor nivel indicador acción Dox (Tabla 3). Así, observamos dependencia tiempo daño ADN causado complejos Les-3833 y Les-3288: 3 h tratamiento, aumento DI caso acción complejos Les-3833 comparado acción forma libre Les-3833; sin embargo, 6 h tratamiento, disminución daño ADN acción complejos ambos Les-3833 y Les-3288 comparado daño observado acción formas libres estos agentes. No dependencia tiempo significativa acción PNC, mientras aumento significativo dependiente tiempo (3 a 6 h) DI detectado acción Dox (41.2 ± 0.40 a 185.2 ± 0.23).

Intercalación ADN Derivados 4-Tiazolidinona — Les-3288 y Les-3833

Compuestos Les-3288 y Les-3833 demostraron cierta capacidad intercalar moléculas ADN con aproximadamente 15% y 10%, respectivamente, reemplazo tinte verde metilo. EtBr, conocido agente intercalante ADN, usado control positivo, mostró reemplazo tinte verde metilo mucho más eficientemente (70%) (Fig. 15). Así, Les-3288 y Les-3833 no capaces intercalar efectivamente entre dos pares bases complementarias ADN doble cadena.

Discusión

Dos problemas principales impiden aumentar eficiencia tratamiento pacientes cáncer: (1) acciones no dirigidas muchos fármacos anticancerosos conducen toxicidad general severos efectos secundarios negativos debido daño tejidos órganos normales; (2) desarrollo rápido (6–12 meses) resistencia células tumorales fármacos anticancerosos aplicados conduce pérdida eficacia acción fármaco. Adicionalmente, tercer problema técnico pobre solubilidad agua muchos fármacos anticancerosos. Sin embargo, unir fármacos transportadores específicos nanoescala puede ayudar resolver problema solubilidad.

Este estudio abordó primero y tercero problemas mencionados (a) seleccionando sustancias sintéticas novedosas (derivados 4-tiazolidinona: Les-3288 y Les-3833) poseen alta actividad anticancerosa y menor toxicidad general animales portadores tumor; (b) aplicando novedosa plataforma entrega fármaco proporciona formas estables base agua complejos derivados 4-tiazolidinona insolubles agua con polímero PEGilado.

Derivados 4-tiazolidinona —Les-3288 y Les-3833— compuestos heterocíclicos masa molecular 400–600 Da. Estos y otros derivados relacionados sintetizados Universidad Médica Nacional Lviv (Ucrania), la mayoría probados Programa Terapéutico Desarrollo Instituto Nacional Cáncer Bethesda, MA, (USA). Basado evaluaciones actividad antineoplásica, sustancias más prometedoras seleccionadas estudio mecanismos acción citotóxica efectos anticancerosos. Les-3833 demostró alta toxicidad líneas células melanoma B16F10, WM793, SK-Mel-28, y contra células cáncer pulmón humano A549, mama MCF-7, colon HCT116, ovario SKOV3 y leucemia (líneas L1210, Jurkat, HL-60). Les-3288 y Les-3833 mostraron alta toxicidad células glioma mamífero (líneas C6, U251, U373).

Anteriormente, hallamos Les-3288 y Les-3833 más tóxicos entre otros derivados 4-tiazolidinona estudiados hacia células glioma rata C6 y glioblastoma humano U251, aunque aplicación tratamiento celular muy complicada debido insolubilidad absoluta agua. Solo uso DMSO con calentamiento adicional efectivo preparar forma soluble derivados (ver sección "Materiales y Métodos"). Así, razonable buscar forma mejorar entrega derivados células objetivo, usamos PNC sintético lograr esta tarea. Complejación derivados estudiados 4-tiazolidinona con PNC aplicado también mejoró efectividad acción antineoplásica. Mecanismos acción pro-apoptótica estos compuestos demostrados western blot y análisis FACS. Debe notarse animales experimentales sanos, Les-3288 y Les-3833 producen muchos menos efectos secundarios negativos como cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, nefrotoxicidad que agente quimioterapéutico anticanceroso ampliamente usado Dox.

Estudio previo mostramos Les-3288 no indujo producción ROS durante acción pro-apoptótica in vitro efectos animales laboratorio, mientras acción Les-3833 llevó tal producción; sin embargo, menor Dox. ROS considerados principales efectores efectos secundarios negativos fármacos anticancerosos, particularmente Dox. Así, compuestos Les-3288 y Les-3832 podrían ser fármacos anticancerosos prospectivos porque poseen actividad antitumoral, pero no demuestran toxicidad general nivel característico fármacos anticancerosos efectivos como Dox.

Gran impedimento promover Les-3288 y Les-3833 como fármacos anticancerosos es pobre solubilidad agua. Este problema también existe otros medicamentos anticancerosos, como taxanos. Para paclitaxel, problema resuelto usando aceite especial preparar formulación medicinal. Sin embargo, plataformas entrega específicas consideradas más prometedoras crear fármacos "inteligentes" poseen acción efectiva organismo. Surfactantes polímeros funcionales específicos arquitecturas bloque, peine, bloque/ramificado, incluyendo contenedores PEG, así como formas agua derivadas desarrolladas propuestas aplicación transportadores entrega Dox y agente quimioterapéutico metal KP-1019 en Departamento Química Orgánica Universidad Politécnica Nacional Lviv.

Dado derivados 4-tiazolidinona compuestos insolubles agua, DMSO usado preparar formas solubles agua. Evitar consecuencias negativas uso solvente tóxico DMSO, complejamos derivados PNC arriba notado. Dispersiones nanoescala agua altamente estables estas sustancias obtenidas aplicadas tratamiento células glioma rata C6.

Uso complejos derivados 4-tiazolidinona PNC condujo toxicidad general reducida compuestos animales experimentales. Anteriormente, hallamos cuando agentes antitumorales experimentales (Les-3288, Les-3833, Les-3882) aplicados complejo transportador polimérico sintético, acción acompañada cambios mucho menores parámetros bioquímicos suero sangre característicos cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, nefrotoxicidad, comparados Dox. Así, complejación agentes antitumorales PNC aplicación forma sistemas entrega estables solubles agua reduce efectos tóxicos animales experimentales, comparado acción sustancias forma libre. Varios sistemas entrega paclitaxel propuestos incluyendo nanopartículas poliméricas, formulaciones lipídicas, conjugados polímero, nanopartículas inorgánicas, nanotubos carbono, nanocristales, nanopartículas ciclodextrina.

Así, complejación Les-3288 PNC aumentó significativamente actividad pro-apoptótica fármaco experimental, permitiéndonos avanzar estudios pre-clínicos modelos tumorales animales. Complejación Les-3833 mismo tipo nanotransportador menos eficiente, por lo tanto otro tipo polímero debería usarse.

Formas base agua desarrolladas complejos, así como derivados libres, aplicados tratamiento células glioma rata C6. Halló formas base agua complejos PNC derivados 4-tiazolidinona —Les-3288 y Les-3833— mejoraron acción pro-apoptótica estos compuestos. Otro estudio demostramos inducción apoptosis Les-3288 no acompañada inducción ROS, opuesto acción Dox y parcialmente opuesto Les-3833. Estos datos podrían explicar menor toxicidad general Les-3288 comparado Dox.

Resultados análisis FACS acuerdo sugerencia mejora acción pro-apoptótica derivados 4-tiazolidinona estudiados debida complejación novedoso PNC. Tal complejación Les-3288 y Les-3833 aumentó ratio células pre-G1 población células glioma rata C6 tratadas, disminuyó ratio células G1, aumentó acción células G2/M. Estos datos sugieren mejora tanto acción citotóxica (apoptosis) como citostática (bloqueo fase G2/M ciclo celular) derivados estudiados complejados PNC. En general, mecanismo apoptosis muerte células glioma por complejo Les-3288 + PNC y Les-3833 + PNC demostrado resultados análisis FACS aparición células Annexin V positivas simples glioma rata C6.

Involucramiento mecanismos apoptosis acción derivados 4-tiazolidinona estudiados también confirmado resultados ensayo cometa ADN. Hallado complejación Les-3833 PNC condujo disminución (comparado Les-3833 libre) ratio células glioma rata C6 cometas ADN "0" e simultáneo aumento ratio cometas "1," "2," "3" (tratamiento 3 h células). 6 h tratamiento complejo Les-3833+PNC, gran aumento (comparado Les-3833 libre) ratio cometas "1", aumento ratio células daño ADN más expresado ("4" cometas), disminución ratios "2" y "3". Debe notarse efectos dañinos ADN Les-3288 y Les-3833 medidos 6 h mayor tales efectos complejos derivados PNC (ver Tabla 3). Posible explicación nivel DI muy alto 6 h acción agentes estudiados incluso mayor nivel indicador acción Dox (Tabla 3). No dependencia tiempo acción PNC, mientras aumento significativo dependiente tiempo (3 a 6 h) DI detectado acción Dox.

Así, complejación derivados 4-tiazolidinona —Les-3288 y Les-3833— con PNC mejoró efecto citotóxico compuestos hacia células glioma rata C6, efecto logrado mecanismos apoptosis incluyendo daño ADN observado cometas ADN células electroforesadas.

Usamos prueba intercalación ADN investigar blanco directo ADN derivados 4-tiazolidinona y revelamos solo reemplazo débil tinte verde metilo (15% y 10% reemplazo Les-3288 y Les-3833, respectivamente) intercalado ADN esperma salmón, comparado reemplazo EtBr, usado control positivo (70%).

Así, realizar experimentos citotoxicidad in vitro derivados 4-tiazolidinona —Les-3288 y Les-3833— más conveniente debido uso formas base agua derivados 4-tiazolidinona —Les-3288 y Les-3833— complejados novedoso PNC. Además, demostramos derivados sintéticos novedosos 4-tiazolidinona (Les-3833 y Les-3288) poseen efectos tratamiento in vivo linfoma NK/Ly injertado ratones BALB/C, efectos comparables Dox. Al mismo tiempo, acción derivados condujo muchos menos efectos secundarios negativos medidos cambios número eritrocitos, neutrófilos, linfocitos sangre animales y actividad aspartato alanina aminotransferasas suero sangre, comparado acción Dox.

Conclusiones

Complejación Les-3288 y Les-3833 con PNC conteniendo PEG mejoró acción citotóxica hacia células glioma rata C6. Acción citotóxica realizada mecanismos apoptosis confirmados análisis FACS presencia fracción pre-G1 células glioma rata C6 y células Annexin V-positivas simples. Análisis cometa ADN reveló roturas simple cadena ADN nuclear células glioma tratadas que probablemente no causada intercalación compuestos estudiados molécula ADN. Les-3288 y Les-3833 estabilizados por PNC anfifílico conteniendo PEG resultaron formas base agua y proveyeron mejora efecto antitumoral in vitro comparado forma libre fármacos.

Abreviaturas

DMSO:

Dimetilsulfóxido

Dox:

Doxorrubicina

EtBr:

Bromuro etidio

FACS:

Citometría flujo activada fluorescencia

ROS:

Especies reactivas oxígeno

PBS:

Fosfato salino tampón

PEG:

Polietilenglicol

PI:

Yoduro propidio

PNC:

Nanotransportador polimérico

SEM:

Microscopía electrónica barrido

TEM:

Microscopía electrónica transmisión

VEP:

2-Tret-butilperoxi-2-metil-5-hexen-3-ino