Efectos proapoptóticos mejorados de los complejos dispersos en agua de quimioterápicos a base de 4-tiazolidinona con un nanoportador polimérico que contiene PEG

Estructura esquemática del PNC - poli (VEP -co- GMA) - injerto -PEG con la cadena principal sobre la base de un copolímero de peróxido insaturado de 2- tert -butilperoxi-2-metil-5-hexen-3-in (VEP, indicado por "k"), con cadenas laterales de metacrilato de glicidilo (GMA, indicado por "l") y polietilenglicol (PEG, indicado por "m" )

Para preparar las soluciones de PNC a base de agua, se disolvieron 0,09 g de PNC en 0,9 ml de DMSO. Esta solución de PNC se añadió a 8,0 ml de solución de NaCl al 0,9%. Luego, la solución se agitó durante 0,5 hy se sonicó durante 10 s. Las dispersiones en agua de los complejos se obtuvieron dejando caer la solución DMSO de 4-tiazolidinonas y PNC en el agua en el siguiente orden:se disolvieron 0.045 g de PNC en 0.15 mL de DMSO (Sigma-Aldrich, EE. UU.), Y 0.0015 g de Les -3288 (o Les-3833) se disolvió en 0,10 ml de DMSO. Las soluciones de PNC y 4-tiazolidinonas se mezclaron y se agregaron a 4,25 ml de solución acuosa de NaCl al 1% y se sonicaron durante 10 s.

Este PNC tensioactivo contiene las cadenas de PEG hidrófilas injertadas en la estructura hidrófoba (Fig. 2a). En soluciones acuosas, el PNC anfifílico forma estructuras similares a micelas que pueden solubilizar compuestos insolubles en agua (por ejemplo, fármacos) o estos compuestos pueden adsorberse sobre la superficie de las nanopartículas, aumentando así su biocompatibilidad. La técnica desarrollada para obtener dispersiones de agua altamente estables de los quimioterapéuticos a base de 4-tiazolidinona consiste en la nucleación de partículas de fármaco a nanoescala que ocurre cuando las soluciones diluidas en DMSO se transfieren a la solución salina precipitante que contiene el tensioactivo polimérico PNC que proporciona un recubrimiento polimérico para la superficie de nanopartículas. Como resultado, debido a la agregación y sedimentación, el complejo se estabilizó y se evitó la dispersión. Además, los complejos a nanoescala de derivados de 4-tiazolidinona están protegidos de posibles interacciones con el microambiente biológico circundante. Esta protección les permite permanecer más tiempo en el cuerpo sin perder estabilidad y acumularse en el tejido u órgano diana sin causar efectos secundarios negativos. Por lo tanto, dicha modificación proporciona una mayor estabilidad de agregación y sedimentación de las dispersiones en agua de las nanopartículas del compuesto anticanceroso.

Los tamaños de las micelas poliméricas de PNC y de los complejos de PNC con 4-tiazolidinonas heterocíclicas se midieron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Alemania) y DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, EE. UU.) Y por espectros de correlación de fotones utilizando tecnología de retrodispersión no invasiva (NIBS) a 25 ° C. Las muestras para las mediciones de DLS se prepararon como se describe anteriormente y, si fue necesario, se diluyeron con agua bidestilada, pH 6,5–7,0. Se realizaron de tres a cinco mediciones para cada muestra (cada medición consistió en 5 ciclos y el intervalo entre mediciones fue de 5 min). La Figura 3 muestra la distribución de tamaño de las estructuras micelares del PNC y las nanopartículas de los complejos de PNC con las 4-tiazolidinonas heterocíclicas (Les-3833 y Les-3288) analizadas por DLS. El tamaño y la morfología de las micelas de PNC, así como de las nanopartículas de 4-tiazolidinona recubiertas de PNC, se estudiaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEM-200А (JEOL, Japón) a un voltaje de aceleración de 200 kV [30, 31]. Las muestras se prepararon como se describió anteriormente y, si fue necesario, se diluyeron con agua bidestilada. Las muestras se prepararon pulverizando la solución ensayada sobre un sustrato mediante el dispersante ultrasónico UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ucrania), que facilita un recubrimiento uniforme sobre el sustrato. Se utilizó como sustrato una fina película de carbono amorfo depositada sobre una rejilla de cobre. Los tamaños y morfología de las micelas de PNC y los complejos con las 4-tiazolidinonas heterocíclicas (Les-3288 y Les-3833) estudiadas por los métodos de DLS y TEM se presentan en la Fig. 3.

Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) del PNC (izquierda) y complejo de PNC + Les-3833 (derecha)

Los estudios de DLS y microscopía electrónica de transmisión (TEM) demostraron que los tamaños de las micelas de PNC eran 50 ± 25 nm y las nanopartículas formadas por complejos de PNC con las 4-tiazolidinonas heterocíclicas Les-3833 y Les-3288 eran 140 ± 25 nm y 155 ± 30 nm, respectivamente . Las dispersiones de complejos de PNC con derivados de 4-tiazolidinona son muy estables y están protegidas de la agregación y sedimentación por la capa de PNC adsorbida en la superficie de la nanopartícula de tiazolidinona. Como se muestra en la Fig.4, los cambios en los tamaños de las nanopartículas dispersas en el sistema de agua son insignificantes en múltiples diluciones con agua, así como después de 6 meses de envejecimiento de los sistemas de agua de complejos de PNC con 4-tiazolidinonas.

Estudio DLS de diámetros hidrodinámicos de PNC y complejos ( a ) y dependencia de los tamaños medios de los complejos PNC-fármaco en la dilución de la dispersión ( b ):dispersiones en agua de PNC (1), complejos de Les-3833 + PNC (2) y Les-3288 + PNC (3), así como tamaños hidrodinámicos de Les-3833 + PNC (1-3) y Les- Dispersiones de 3288 + PNC (4–6) después del almacenamiento durante 2 días (1,4), 4 meses (2,5) y 6 meses (3,6) ( c )

Cultivo celular

Las células de glioma de rata de la línea C6 se obtuvieron de Cell Culture Collection en el Instituto de Biología Molecular y Genética, Academia Nacional de Ciencias de Ucrania (Kiev, Ucrania). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma, EE. UU.) Suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma, EE. UU.). Las células se cultivaron en un CO ₂ -incubadora a 37 ° C, 5% CO ₂ y 95% de humedad. La resiembra de células se llevó a cabo en una proporción de 1:5 una vez en 2-3 días.

Evaluación de la acción citotóxica de las sustancias estudiadas

Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una concentración de 100.000 células / ml en un pocillo. (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC, EE. UU.). Las sustancias en estudio se agregaron a concentraciones de 0,1, 0,5 y 1,0 μM después de un período de adaptación de 24 h que comenzó después de la siembra celular. El recuento de células se llevó a cabo a intervalos regulares en la cámara de recuento hemocitométrico utilizando colorante azul tripán (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, EE. UU.) A una concentración final del 0,01%, 2 min después de su adición a la suspensión celular. . Las células muertas tomaron este tinte debido al daño a su membrana plasmática.

Citometría de flujo

Para estudiar el ciclo celular y la apoptosis, las células C6 se trataron con Les-3288, Les-3833 y sus complejos con PNC, así como con PNC en forma libre, lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), sedimentadas por centrifugación. a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C y resuspendido en PBS frío (2 millones de células por 1 mL de PBS). Luego, las células se fijaron agregando alícuotas de 4 mL de etanol absoluto enfriado a -20 ° C con mezcla suave. Las muestras fijadas se mantuvieron a -20 ° C hasta su uso (no más de 1 semana). Para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), las muestras de células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C, el sobrenadante se descartó y el sedimento celular se resuspendió en 1 mL de PBS. Se agregaron cien microlitros de RNasa sin ADNasa (Sigma, EE. UU.) A esa suspensión y las muestras se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Luego, cada muestra se complementó con 100 μl de yoduro de propidio (PI) (Sigma, EE. UU., 1 mg / mL) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Finalmente, las muestras se transfirieron a tubos de plástico Falcon y la suspensión celular se controló con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, EE. UU.) Y el software Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, EE. UU.) Para medir los parámetros del ciclo celular y la apoptosis.

La medición de las células (apoptóticas) positivas a Anexina V se realizó usando análisis FACS. Se trataron células de glioma C6 de rata con concentraciones de 0,1 mg / ml, 0,5 mg / ml y 1 mg / ml de PNC, Les-3288, Les-3833 y sus conjugados poliméricos como se indica en las figuras. Al final del experimento, las células se separaron del fondo de la placa con solución de tripsina-EDTA, se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con anexina V-FITC usando el kit de detección de apoptosis (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células lavadas se incubaron durante 15 min en el tampón de unión de Anexina V (BD Pharmingen), que contenía 1/50 de volumen de solución de Anexina V conjugada con FITC. Luego, las muestras se diluyeron dos veces con un volumen apropiado del tampón de unión de Anexina V y se midieron inmediatamente en el canal FL1 / FL2 (FITC-PI) de un citómetro de flujo (Becton Dickinson, EE. UU.). Las células positivas individuales anexina V se clasificaron como apoptóticas.

Ensayo de cometa de ADN

El ensayo del cometa de ADN se llevó a cabo en condiciones alcalinas. Se mezclaron diez mil células en 75 μl de agarosa de bajo punto de fusión (0,5%) por muestra. Después de mezclar, la muestra se pipeteó en un portaobjetos que se había cubierto con agarosa de punto de fusión normal al 1,5% de antemano. Las muestras se incubaron a 4 ° C durante 18 h en solución de lisis (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris-base 10 mM, DMSO al 10%, Triton X-100 al 1%). Para permitir el desenrollamiento del ADN y la expresión del daño lábil a los álcalis, los portaobjetos se incubaron en una solución de álcali a temperatura ambiente durante 20 min (realizado en la oscuridad). Para la electroforesis (~ 74 V / cm durante 30 min), los portaobjetos se transfirieron a una cámara horizontal y se añadió tampón de electroforesis 1x (NaOH 0,3 M, EDTA 1 mM, pH> 13). Los portaobjetos se fijaron en metanol al 100% enfriado con hielo y se secaron. Los portaobjetos se tiñeron con 80 μl 1 x bromuro de etidio (EtBr) durante 5 min y luego se sumergieron en agua destilada fría para eliminar el exceso de tinción. Los cometas de ADN se visualizaron con un microscopio (Carl Zeiss, Alemania) y las imágenes se analizaron con el software "CASP" (software Casplab-1.2.3b2, CASPlab, Wroclaw, Polonia). Se contaron cien cometas por muestra. El daño del ADN se clasificó en cinco niveles de genotoxicidad según el tamaño de la cola del cometa:0 (0 a 5% de daño), 1 (5 a 25% de daño), 2 (25 a 45% de daño), 3 (45 a 70% de daño ) y 4 (más del 70% de daño) [32]. Se calculó el índice de daño (DI), como se describió anteriormente [33].

Ensayo de intercalación de ADN con tinte verde de metilo

Se investigó la capacidad de los compuestos Les-3288 y Les-3833 de intercalar en la molécula de ADN mediante el ensayo de verde de metilo [34]. Se incubó ADN de esperma de salmón (10 mg / mL) durante 1 ha 37 ° C con 15 μL de solución de verde de metilo (1 mg / mL en H ₂ O). Los compuestos se agregaron a 1 μg / mL y se incubaron a 37 ° C en la oscuridad durante 2 h. El volumen final total de las muestras fue de 1 mL. La absorción de verde de metilo se midió a 630 nm, después de la incubación de la muestra durante 2 ha 37 ° C, utilizando un microfotómetro multicanal BioTek 76 883 (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.). Se utilizó EtBr como control positivo.

Análisis de datos y estadísticas

Todos los experimentos se repitieron tres veces con tres paralelos en cada variante. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para la comparación de grupos. Los datos de la distribución de las células de glioma de rata C6 en diferentes fases del ciclo celular se analizaron mediante ANOVA de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey. Todos los datos se presentan como media ± DE. A p un valor de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Efecto citotóxico (prueba de exclusión con azul tripán) de derivados de 4-tiazolidinona usados ​​en forma libre y en complejo con el nanoportador polimérico

Los resultados de la prueba de exclusión con azul tripán demostraron que las formas a base de agua de los complejos Les-3288 y Les-3833 con el PNC tenían una mayor toxicidad hacia las células del glioma C6 (tratamiento de 24 hy 48 h) en comparación con la citotoxicidad observada al usar el forma libre de estos compuestos (Figs. 5 y 6). El efecto de citotoxicidad más alto se observó con dosis de 0,1 y 0,5 μM de compuestos de Les-3288 y Les-3833 en sus complejos con el PNC, mientras que con la dosis más alta (1,0 μM) de estos compuestos, se detectó una mejora de la complejación con el PNC. solo en el caso de Les-3288 durante 24 h (Figs. 5 y 6).

Número de células de glioma C6 de rata vivas medidas mediante la prueba de exclusión con azul tripán después del tratamiento durante 24 hy 48 h con diferentes concentraciones (0,1, 0,5 y 1,0 μM) de Les-3288 solo en comparación con la acción de su complejo con el nanoportador polimérico ( PNC) * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 ( diferencia en comparación con el control, 100%)

Número de células de glioma C6 de rata vivas medidas mediante la prueba de exclusión con azul tripán después del tratamiento durante 24 hy 48 h con diferentes concentraciones (0,1, 0,5 y 1,0 μM) de Les-3833 solo en comparación con la acción de su complejo con el nanoportador polimérico ( PNC) * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 (diferencia en comparación con el control, 100%)

La complejación de los compuestos Les-3833 y Les-3288 con nanoportadores poliméricos mejora su actividad pro-apoptótica in vitro hacia células de glioma C6 de rata

Se utilizaron dos enfoques alternativos para evaluar el efecto modulador del PNC sobre el potencial citotóxico de los derivados de 4-tiazolidinona seleccionados. En primer lugar, se realizó un análisis del ciclo celular para investigar el impacto de los complejos fármaco-PNC en el ciclo celular. Además, se utilizó doble tinción con Anexina V / PI para distinguir el tipo exacto de muerte celular inducida por estos nanocompuestos.

Los compuestos Les-3288 y Les-3833 en dosis bajas (0,1 μg / ml y 0,5 μg / ml) no produjeron ningún efecto visible sobre la progresión del ciclo celular o la inducción de la apoptosis, como se muestra en la Fig. 7 y la Tabla 1. Sin embargo, la complejación de ambos compuestos con el PNC aumentaron significativamente el número de células en pre-G ₁ fase (4 veces para Les-3288 y 6 veces para Les-3833), lo que indica un aumento importante de su potencial proapoptótico. Cabe destacar que la PNC en forma libre no tuvo ningún impacto sobre el ciclo celular o la inducción de la apoptosis; por lo tanto, la aparición observada de una gran población de células pre-G1 en tratamiento con los complejos de tiazolidinona-nanoportador no puede explicarse por un simple efecto sinérgico del PNC y los fármacos experimentales.

Impacto en la progresión del ciclo celular de los derivados de 4-tiazolidinona Les-3288 y Les-3833 en forma libre y en complejo con el nanoportador polimérico (PNC) en células de glioma de rata C6. Tinción con yoduro de propidio (PI), citometría de flujo. R2, pre-G1; R3, G1; R4, S; R5, fase G2. FL2-H, valores máximos de emisión del segundo canal (filtro 585/40) del citómetro de flujo

Para confirmar que el pico sub-G1 observado consiste en células apoptóticas, se analizaron los resultados del ensayo de tinción de Anexina V / PI. No observamos una externalización significativa de la fosfatidilserina (principal marcador de apoptosis temprana, detectada por anexina V conjugada con FITC) durante el tratamiento del glioma C6 con dosis bajas (0,1 y 0,5 μg / ml) y altas de Les-3288 (1,0 μg / ml) , lo que sugiere que este compuesto es un inductor débil de apoptosis. En cambio, encontramos un aumento en la población de células necróticas (del 1.2% en el control al 11.25% para Les-3288, 1.0 μg / mL), lo que puede indicar que Les-3288 causa al menos parcialmente la muerte celular necrótica. Sin embargo, la complejación de Les-3288 con el PNC cambió por completo el modo de acción de este fármaco. Hubo un aumento masivo en el número de células apoptóticas tempranas (Anexina V (+) / PI (-)) y apoptóticas tardías (Anexina V (+) / PI (+)), mientras que la cantidad total de células necróticas puramente se mantuvo en el nivel de células de control (no tratadas) (Fig. 8a). Por lo tanto, la unión de Les-3288 con el PNC no solo aumenta fuertemente su actividad proapoptótica hacia las células de glioma, sino que también disminuye su potencial mecanismo de muerte celular pro-necrótica. Estos hallazgos pueden ser de importancia clave para la práctica clínica porque no se recomienda el uso de fármacos pronecróticos debido a una inducción masiva de inflamación que es inconveniente para los pacientes.

Comparación de la actividad proapoptótica de Les-3288 ( a ) y Les-3833 ( b ) compuestos y sus complejos con el nanoportador polimérico (PNC) hacia células de glioma C6 de rata. Doble tinción con anexina V / PI, citometría de flujo. PI, yoduro de propidio

Sorprendentemente, no observamos el mismo efecto para el complejo Les-3833 + PNC. De hecho, la actividad proapoptótica del complejo Les-3833 + PNC fue menor en comparación con Les-3288 en forma libre en todas las concentraciones probadas (Fig. 8b). Una diferencia tan drástica entre ambos compuestos podría explicarse por la especificidad de su estructura química, y especulamos que en el caso de Les-3833, la estructura del polímero debería optimizarse para lograr mejores resultados.

Ensayo de daño del ADN en cometas en células de glioma C6 de rata causado por derivados de 4-tiazolidinona en forma libre y complejados con el PNC

El ensayo cometa alcalino permite la detección de roturas de ADN monocatenario en sitios de ADN lábiles alcalinos. Los resultados obtenidos se estimaron utilizando el valor medio del momento de la cola de oliva (OTM). Nuestros datos mostraron que el tratamiento de células de glioma de rata С6 con Les-3288, Les-3833 y PNC (concentración 0.5 μg / mL) durante 3 h (Figs.9 y 10) no causó un daño significativo en el ADN (OTM =0.7299 ± 0,1276, OTM =1,466 ± 0,3086, OTM =0,5846 ± 0,1078, respectivamente), en comparación con las células no tratadas en el control (OTM =0,4541 ± 0,07273). Sin embargo, el tratamiento celular con el complejo Les-3833 + PNC (OTM =2,3880 ± 0,2212) provocó un daño más significativo en el ADN que el tratamiento celular con la forma libre de Les-3833. No se observó tal aumento en el daño para la acción del complejo Les-3288 + PNC (Figs. 9 y 10).

El daño del ADN se evaluó utilizando el momento de la cola de oliva en células de glioma C6 de rata tratadas durante 3 h con compuestos antineoplásicos experimentales utilizados a una concentración de 0,5 μg / ml. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001. PNC, nanoportador polimérico; Dox, doxorrubicina (control positivo)

Presencia de ADN en la cola de cometa de células de glioma С6 de rata después del tratamiento durante 3 h con ( a ) control (células no tratadas), Les-3288 ( b ), Les-3288 + PNC ( c ), Les-3833 ( d ) Les-3833 + PNC ( e ), PNC ( f ) y doxorrubicina ( g ), utilizado a una concentración de 0,5 μg / ml

An increase of cell incubation time to 6 h (Figs. 11 and 12) caused greater DNA damage in all experimental groups:Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, and Dox (positive control). However, the effects of the Les-3288+PNC and Les-3833+PNC complexes appeared to be lower than the effects of the free forms of Les-3288 and Les-3833. It should be noted that the DNA-damaging effect of the complexes of both derivatives with the PNC was less than such effect from these derivatives used in free form.

DNA damage was evaluated using the Olive tail moment in rat glioma C6 cells treated for 6 h with experimental antineoplastic compounds used at a 0.5 μg/mL concentration. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

Presence of DNA in comet tail of rat glioma С6 cells after treatment for 6 h with (a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288 + PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ), and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

The results were evaluated using the mean value of the TailDNA%. The obtained data show that incubation of С6 rat glioblastoma cells with substance Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, and PNC (all at concentration of 0.5 μg/mL) during 3 h (Fig. 13) does not lead to significant DNA damage (TailDNA% of 4.157 ± 0.682; TailDNA% of 3.530 ± 1,012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectively) compared with control (TailDNA% =3.638 ± 0.406), but cell treatment with the Les-3833+PNC complex (TailDNA% =19.53 ± 1.48) causes more significant damage of DNA than the free form of Les-3833. An increase in the incubation time up to 6 h (Fig. 14) in all cases leads to greater damage to the DNA. Again, the level of TailDNA% detected from the action of complexes of both derivatives with the PNC was less than the level of that indicator for the action of these derivatives used in free form.

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 3 h at a concentration of 0.5 μg/mL. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 6 h at a concentration of 0.5 μg/mL. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

We also used an alternative, five-category classification system to classify DNA migration and calculated the DI. Table 2 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells for each level of genotoxicity during 3 h of treatment. In the control (untreated cells), higher percentages of cells in levels 0 (81.3%) and 1 (18.6%) were detected compared to these levels in Les-3288 and PNC-treated cells. Complexation of Les-3288 with the PNC did not lead to a big change in the distribution pattern of the DNA comets. In contrast, Les-3833-treated cells showed a lower percentage of cells in 0 level (38.6%) and a higher percentage of cells in level 1 (60.0%), while Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a significantly lower percentage of cells in level 0 (8.0%) and much higher percentages of cells with levels 1 (76.0%), 2 (13.3%), and 3 (2.6%). The integrative indicator of DNA damage (DI) in the case of application of both Les-3288 and its complex with the PNC did not differ significantly from that for control or using free PNC, while the DI from using both Les-3833 and its complex with the PNC was even higher than the DI from using Dox.

During this time interval, Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a higher percentage of cells with level 4 (5.3%) DNA damage than cells treated with Les-3288 and the other experimental compounds, but the percentages of cells in levels 2 and 3 were lower (16.0% and 12.0%, respectively) than those from treatment with other compounds (Table 2). Table 3 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells with DNA damage after 6 h of treatment. In general, a tendency for the appearance of DNA comets of higher classes was detected when complexes of Les-3833 and Les-3288 were used, compared with a spectrum of DNA comet classes induced by free forms of these agents (Table 3). However, the integrative indicator of DNA damage (DI) calculated for the action of complexes of Les-3833 and Les-3288 was found to be lower than such an indicator for the action of free forms of these agents. A possible explanation could be a very high DI level at 6 h action of studied agents that is even higher than such indicator found for the action of Dox (Table 3). Thus, we observed time dependence of DNA damage caused by complexes of Les-3833 and Les-3288:at 3 h of treatment, there was an increase of the DI in the case of action of Les-3833 complexes, compared to the action of the free form of Les-3833; however, at 6 h of treatment, there was a decrease in DNA damage for the action of complexes of both Les-3833 and Les-3288, compared to such damage observed for the action of the free forms of these agents. There was no significant time dependence for the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase in the DI was observed for the action of Dox (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23).

DNA Intercalation by 4-Thiazolidinone Derivatives—Les-3288 and Les-3833

Les-3288 and Les-3833 compounds demonstrated a certain capability for intercalating DNA molecules with approximately 15% and 10%, respectively, of replacement of methyl green dye. EtBr, a well-known DNA intercalating agent, was used as a positive control, and it was shown to replace the methyl green dye much more efficiently (70%) (Fig. 15). Thus, Les-3288 and Les-3833 are not capable of effectively intercalating in between two complementary base pairs in double-stranded DNA.

Replacement of methyl green dye intercalated into the DNA of salmon sperm by Les-3288 and Les-3833 compounds (1.0 μg/mL) and ethidium bromide (EtBr) used as a positive control

Discusión

There are two major problems that impede increasing the efficiency of treatment for cancer patients:(1) non-addressed actions of many anticancer drugs that lead to general toxicity and severe negative side effects due to damage of normal tissues and organs; (2) rapid (6–12 months) development of resistance of tumor cells to applied anticancer drugs that leads to a loss of efficacy of drug action. In addition, there is a third, technical problem of poor water solubility of many anticancer drugs. However, binding these drugs with specific carriers of the nanoscale size can help to solve the solubility problem.

In this study, we addressed the first and third of the above-mentioned problems by (a) selecting novel synthetic substances (4-thiazolidinone derivatives:Les-3288 and Les-3833) that possess both high anticancer activity and less general toxicity in tumor-bearing animals [7, 8, 23] and (b) applying a novel drug delivery platform that provides stable water-based forms of the complexes of the water-insoluble 4-thiazolidinone derivatives with a PEGylated polymer.

The 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—are heterocyclic compounds with molecular mass of 400–600 Da. These and other related derivatives were synthesized at Lviv National Medical University (Ukraine), and most of them have been tested under the Developmental Therapeutic Program at the National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) [35,36,37,38]. Based on these evaluations of their antineoplastic activity, the most promising substances were selected for further study of the mechanisms of their cytotoxic action and anticancer effects [25]. Les-3833 demonstrated high toxicity towards B16F10, WM793, and SK-Mel-28 melanoma cells, and against human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 cancer cells and leukemia cells (L1210, Jurkat, HL-60 lines) [23, 25, 39]. Les-3288 and Les-3833 showed high toxicity against mammalian glioma cells (C6, U251, U373 lines) [23, 24].

Earlier, we found that Les-3288 and Les-3833 were the most toxic among the other studied 4-thiazolidinone derivatives towards rat glioma C6 cells and human glioblastoma U251 cells [23, 24], although their application for cell treatment was very complicated due to their absolute insolubility in water. Only using DMSO with additional heating was effective for preparing a soluble form of the derivatives (see the “Materials and Methods” section). Thus, it was reasonable to search for a way of improving the delivery of these derivatives to target cells, and we used a synthetic PNC to accomplish this task. The complexation of the studied derivatives of 4-thiazolidinone with the applied PNC also enhanced the effectiveness of their antineoplastic action. The mechanisms of the pro-apoptotic action of these compounds were demonstrated using western blot and FACS analyses [23, 24]. It should be noted that in healthy experimental animals, Les-3288 and Les-3833 produce much fewer negative side effects such as cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7] than the widely used anticancer chemotherapeutic agent Dox.

In a previous study, we showed that Les-3288 did not induce ROS production during its pro-apoptotic action in vitro and effects in experimental laboratory animals [23], while the action of Les-3833 led to such production; however, it was less than that of Dox. ROS are considered to be the main effectors of negative side effects of anticancer drugs, particularly Dox [41, 42]. Thus, the Les-3288 and Les-3833 compounds could be prospective anticancer drugs because they possess antitumor activity, but do not demonstrate general toxicity at the level characteristic for effective anticancer medicines such as Dox.

A great impediment to promoting Les-3288 and Les-3833 as anticancer drugs is their poor water solubility. This problem also exists for other anticancer medicines, such as taxols [2, 4]. For paclitaxel, this problem was solved by using a special oil for preparing the medicinal formulation [2, 4, 43]. However, specific delivery platforms are considered to be more promising for creating “smart” drugs that possess effective action in the organism [3, 13]. Specific functional polymer surfactants with block, comb-like, and block/branched architectures, including PEG-containing ones, as well as derived water forms have been developed and proposed for application as carriers for the delivery of Dox [26, 27] and the metal chemotherapeutic agent KP-1019 [10] at the Department of Organic Chemistry of Lviv Polytechnic National University.

Since the 4-thiazolidinone derivatives are water-insoluble compounds, DMSO was used to prepare their water-soluble forms. To avoid the negative consequences of using a toxic solvent like DMSO, we complexed these derivatives with the above-noted PNC. Highly dispersed and stable nanoscale water dispersions of these substances were obtained and applied for treatment of rat glioma C6 cells.

The use of complexes of 4-thiazolidinone derivatives with the PNC led to reduced general toxicity of these compounds in experimental animals. Earlier, we found that when experimental antitumor agents (Les-3288, Les-3833, Les-3882) were applied in a complex with a synthetic polymeric carrier, their action was accompanied by much smaller changes in the biochemical parameters in blood serum that are characteristic for cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7], compared to those for Dox. Thus, complexation of these antitumor agents with the PNC and their application in the form of water-soluble stable delivery systems reduces their toxic effects in experimental animals, compared with the action of these substances in a free form [44]. Several systems for paclitaxel delivery have been proposed including polymeric nanoparticles, lipid-based formulations, polymer conjugates, inorganic nanoparticles, carbon nanotubes, nanocrystals, and cyclodextrin nanoparticles [43].

Thus, complexation of Les-3288 with the PNC significantly increased the pro-apoptotic activity of this experimental drug, thereby allowing us to advance it to pre-clinical studies on animal tumor models. Complexation of Les-3833 with the same type of nanocarrier was less efficient, and thus another type of polymer should be used.

The developed water-based forms of the complexes, as well as the free derivatives, were applied for treatment of rat glioma C6 cells. It was found that these water-based forms of the complexes of the PNC with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—enhanced the pro-apoptotic action of these compounds. In another study, we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and Les-3833 [23]. Thus, high antitumor activity of Les-3288 together with its low general toxicity when targeting the malignancy in NK/Ly lymphoma-bearing mice suggest great potential for this experimental anticancer compound. The presented data also predict the potential usefulness of Les-3288 and Les-3833 compounds complexed with the PNC for glioma treatment.

Cell division, differentiation, and death are principal physiological processes that regulate tissue homeostasis in multicellular organisms. A disruption of genomic integrity and impaired regulation of cell death may both lead to uncontrolled cell growth. A compromised cell death process can also promote genomic instability. It is becoming clear that dysregulation of the cell cycle and cell death processes plays a pivotal role in the development of major disorders such as cancer, cardiovascular disease, infection, inflammation, and neurodegenerative diseases [45].

We have found that some of the 4-thiazolidinone derivatives, namely, Les-3288 and Les-3833, were even more effective than Dox in the induction of apoptosis in rat C6 glioma and human U251 glioblastoma cells in vitro [23, 24]. It should be noted that brain tumors belong to malignancies that are the most resistant to applied chemotherapies, and survival rates in patients with these tumors are extremely low [44].

It has been shown that the complexation with this PNC enhanced the pro-apoptotic action of 4-thiazolidinone derivatives (Les-3288 and Les-3833) [44]. In another study [23], we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and partially opposite to that of Les-3833. These data could explain the lower general toxicity of Les-3288 compared with that of Dox [23, 24].

The results of FACS analysis are in agreement with the suggestion that an enhancement of the pro-apoptotic action of the studied 4-thiazolidinone derivatives is due to their complexation with a novel PNC. Such complexation of Les-3288 and Les-3833 increased the ratio of pre-G1 cells in the population of treated rat glioma C6 cells, decreased the ratio of G1 cells, and increased the action of G2/M cells. These data suggest an enhancement of both cytotoxic action (apoptosis) and cytostatic action (block in G2/M phase of cell cycle) of the studied derivatives complexed with the PNC. In general, the apoptosis mechanism of glioma cell killing by the Les-3288 + PNC complex and the Les-3833 + PNC complex was demonstrated by the results of FACS analysis of the appearance of Annexin V single-positive rat glioma C6 cells.

Involvement of the apoptosis mechanisms in the action of the studied 4-thiazolidinone derivatives was also confirmed by the results of the DNA comet assay. It was found that the complexation of Les-3833 with the PNC led to a decrease (compared to free Les-3833) in the ratio of rat glioma C6 cells in “0” DNA comets and sіmultaneous increase in the ratio of “1,” “2,” and “3” comets (3-h treatment of cells). At 6 h of treatment by the Les-3833+PNC complex, there was a large increase (compared to free Les-3833) in the ratio of “1” comets, an increase in the ratio of cells with the most expressed DNA damage (“4” comets), and a decrease in the ratios of “2” and “3” comets. It should be noted that the DNA damaging effects of Les-3288 and Les-3833 measured at 6 h was higher than such effects of complexes of these derivatives with the PNC (see Table 3). A possible explanation here could be a very high level of the DI at 6 h action of studied agents that is even higher than the level of that indicator found for the action of Dox (Table 3). There was no time dependence in the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23) in the DI was detected for the action of Dox.

Thus, a complexation of 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—with a PNC enhanced the cytotoxic effect of these compounds towards rat glioma C6 cells, and that effect was achieved through the apoptosis mechanisms including DNA damage observed as DNA comets in the electrophoresed cells.

We used the DNA intercalation test to investigate the direct targeting of DNA by the 4-thiazolidinone derivatives and revealed only weak replacement of methyl green dye (15% and 10% replacement for Les-3288 and Les-3833, respectively) that intercalated into the DNA of salmon sperm, compared to the replacement by EtBr, used as a positive control (70%).

Thus, conducting the cytotoxicity experiments in vitro with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—was more convenient due to using the water-based forms of the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—complexed with the novel PNC. Besides, we have demonstrated that the novel synthetic 4-thiazolidinone derivatives (Les-3833 and Les-3288) possessed treatment effects i n vivo towards NK/Ly lymphoma grafted to BALB/C mice, and those effects were comparable to such effects of Dox. At the same time, the action of these derivatives led to much fewer negative side effects measured as changes in the number of erythrocytes, neutrophils, and lymphocytes in the animals’ blood and the activity of aspartate and alanine aminotransferases in their blood serum, compared with the action of Dox.

Conclusiones

The complexation of Les-3288 and Les-3833 with the PEG-containing PNC enhanced their cytotoxic action towards rat glioma C6 cells. The cytotoxic action was realized by apoptotic mechanisms and confirmed by FACS analysis as the presence of the pre-G1 fraction in the rat glioma C6 cells and of Annexin V-single-positive cells. DNA comet analysis revealed single-strand brakes in the nuclear DNA of treated glioma C6 cells that probably was not caused by the intercalation of the studied compounds into the DNA molecule. The Les-3288 and Les-3833 stabilized by the amphiphilic PEG-containing PNC resulted in the water-based forms and provided enhancement of their antitumor effect in vitro in comparison with the free form of the drugs.

Abreviaturas

DMSO:

Dimethylsulfoxide

Dox:

Doxorrubicina

EtBr:

Ethidium bromide

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

PEG:

Polietilenglicol

PI:

Yoduro de propidio

PNC:

Polymeric nanocarrier

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in

Uso de diferentes iones para ajustar las estructuras de la pila de grafeno de hojas a cebollas durante la exfoliación del plasma, con aplicaciones de supercondensadores Pasivación de Si mejorada y eficiencia de células solares PERC mediante óxido de aluminio depositado en capa atómica con recocido posterior en dos pasos