Formación del complejo de nanopartículas-HSA a base de pululano y liberación de fármacos influenciada por la carga superficial

Resumen

La composición de nanomateriales de las nanopartículas y su adsorción de proteínas en la sangre es de gran importancia en el diseño de nanopartículas cargadas de fármacos. Para explorar la interacción entre los diferentes componentes de la superficie de las nanopartículas (NP) y las proteínas, sintetizamos tres tipos de polímeros de pululano NP:pululano colestérico modificado hidrofóbicamente (CH) (CHP), pululano animado modificado con CH (CHAP) y pululano modificado con CH. pululano carboxilado (CHSP). Los NP de pululano se prepararon mediante el método de diálisis. Se utilizó la dispersión de luz dinámica para determinar la carga y el tamaño de los tres NP. El tamaño de las NP se alteró por el número de grupos de carga cuando los polímeros contienen el mismo grado de sustitución del colesterol. Los potenciales zeta fueron + 12,9, - 15,4 y - 0,698 mV para CHAP, CHSP y CHP, respectivamente, y las dimensiones fueron 116,9, 156,9 y 73,1 nm, respectivamente. Se utilizó calorimetría de titulación isotérmica para determinar los cambios termodinámicos de NP con diferente carga superficial, y se investigó el efecto de la albúmina de suero humano (HSA) sobre la titulación. Los cambios de entalpía y entropía demostraron una interacción entre NP y HSA; la constante de enlace ( K _b ) para CHSP, CHP y CHAP fue 1,41, 27,7 y 412 × 10 ⁴ M ⁻¹ , respectivamente, con la carga positiva para CHAP-HSA, sin cargo para CHP-HSA, y carga negativa para el complejo CHSP-HSA. Se utilizó espectroscopia de fluorescencia y dicroísmo circular para determinar el cambio de estructura de la proteína después de la complejación entre NP y HSA. La complejación de NP y HSA es un proceso complicado compuesto por la reducción del contenido de la hélice α de la proteína y la extensión de la cadena de péptidos; Los NP de CHP tuvieron la mayor reducción en el contenido de hélice α de HSA. Las tasas de liberación del fármaco de todos los compuestos de NP y HSA fueron significativamente más bajas que las del fármaco libre y las NP cargadas con fármaco después de 48 h. Las tasas más altas y más bajas se observaron en CHSP-HSA y CHP-HSA, respectivamente. La liberación del fármaco se vio significativamente influenciada por la adsorción de HSA en las NP, y el tamaño y la carga superficial de las NP desempeñaron un papel importante en este proceso.

Antecedentes

El sistema de administración de nanofármacos, como las nanopartículas (NP) cargadas con fármacos antitumorales de pequeña molécula, tiene propiedades de liberación de fármacos sostenidas y controladas, así como un efecto de focalización. La terapia dirigida con NP se ha convertido en un enfoque en el tratamiento de tumores, porque pueden reducir significativamente los efectos secundarios de los medicamentos y mejorar la eficacia de los mismos [1, 2, 3].

Los NP cargados con fármaco deben atravesar tres vías para llegar al sitio objetivo, es decir, la circulación sanguínea, la vía de tejido a célula y el movimiento intracelular [4, 5, 6]. También necesitan superar la barrera vascular para alcanzar el tejido objetivo, luego la barrera de la membrana celular para alcanzar la célula objetivo [7, 8]. La adsorción y el intercambio de proteínas están involucrados en todas las vías de las NP. Finalmente, los NP adsorbidos por proteínas llegan a las células diana y liberan los fármacos [1, 9].

Las proteínas de alta abundancia, como la albúmina de suero humano (HSA), las lipoproteínas y la globulina, generalmente se adsorben en la superficie de las NP cargadas con fármaco, cambiando así el comportamiento de liberación in vivo y los sitios de orientación de las NP [10]. El número y tipo de proteínas adsorbidas están estrechamente relacionados con la concentración de proteínas en el plasma y la afinidad de las NP [11]. Cuanto mayor sea la concentración de proteínas plasmáticas, mayor será la adsorción superficial del NP [12]. Una proteína con alta afinidad puede reemplazar a la que tiene una afinidad débil [13]. Por tanto, la superficie del NP está ocupada por la proteína con alta concentración y fuerte afinidad, formando una corona de nanoproteínas [14]. Las coronas de nanoproteínas son indispensables para la función in vivo de las NP [15]. Por ejemplo, si la superficie se modifica con polisorbato, los NP pueden administrar el fármaco a través de la barrera hematoencefálica al tejido cerebral [16]; Los nanomateriales de polisacáridos modificados hidrófobos pueden interactuar con la HSA en el cuerpo, mejorando así el control de la liberación del fármaco [17].

La captación de NP por las células se ve afectada por una variedad de factores, como las propiedades físicas y químicas de las NP, la concentración de nanofármacos, la adsorción de proteínas y la adhesión celular [18]. Los tipos y cantidades de adsorción de proteínas afectan la función de los NP, incluido el control de la liberación del fármaco y la focalización. Además, las propiedades físicas y químicas de las NP, como el tamaño de las partículas, la carga y la hidrofobicidad de la superficie, afectan la adsorción de proteínas [19]. La naturaleza del NP decide su destino durante el proceso in vivo [20]. Los materiales macromoleculares anfifílicos, como los polímeros polisacáridos modificados hidrofóbicamente, pueden autoensamblarse en partículas de tamaño nanométrico. El tamaño del NP juega un papel importante en sus funciones de control de liberación de fármacos y dirección [21]. El grupo hidrofóbico en el polímero es una fuerza impulsora para la formación de la estructura nuclear del NP. Cuanto mayor sea el grado de sustitución del grupo hidrófobo, menor será el NP [22]. Los materiales poliméricos con grupos carboxilo, grupos amino y sus derivados están involucrados en el autoensamblaje de las NP, por lo que afectan el tamaño de las NP y proporcionan una carga superficial para que se adhieran fácilmente a la proteína con carga opuesta [23]. Las NP con diferentes cargas superficiales tienen diferentes capacidades para la adsorción de proteínas y diferentes funciones biológicas [24]. Por lo tanto, necesitamos explorar la interacción entre los diferentes componentes de la superficie de las NP y las proteínas.

HSA es la proteína más abundante en sangre. Es esencial para el transporte, distribución y metabolismo de sustancias extrañas y endógenas. Muchos fármacos de molécula pequeña entran en el organismo y forman adsorbentes de fármacos HSA en el transporte sanguíneo, lo que modifica los efectos farmacológicos de los fármacos [25]. Los NP cargados de fármaco se combinan con HSA después de ingresar al cuerpo; Debido a la compleja estructura de las NP, las características de adsorción difieren de las combinaciones de HSA de moléculas pequeñas [26]. Por ejemplo, la adsorción de fármacos de molécula pequeña a moléculas de HSA es rápida; sin embargo, la adsorción de HSA a NP es lenta y compleja [27].

Las nanopartículas de CHP como portadores de fármacos se habían estudiado durante mucho tiempo, lo que había mostrado excelentes nanomateriales para la administración de fármacos [28, 29]. En un experimento anterior, estudiamos la interacción entre HSA y NP de pululano con diferentes grados de sustitución de colesterol, pululano (CHP) modificado hidrofóbicamente (CH) colestérico, y encontramos principalmente dos procesos:HSA se adhiere rápidamente a la superficie del NP y luego se inserta lentamente en el núcleo hidrofóbico de las NP [30]. Las interacciones hidrofóbicas jugaron un papel importante en la formación de complejos CHP-HSA [31]. La hidrofobicidad y la estructura capa-núcleo de las partículas fueron las principales responsables de los cambios en la conformación de la albúmina durante la interacción NP y HSA [30].

En este estudio, fabricamos tres NP, CHP, pululano animado modificado con CH (CHAP) y pululano carboxilado modificado con CH (CHSP). Su estructura y propiedades se caracterizaron con infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) y RMN, y sus tamaños y potenciales se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS). Se utilizaron calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y espectroscopia de fluorescencia para investigar las características de interacción de los complejos NP-HSA y los efectos de los tres tipos de NP en la estructura de HSA. Revelamos los efectos sobre la liberación de fármacos con las propiedades de los complejos NP-HSA, que es vital para la aplicación futura del sistema de administración de fármacos.

Métodos

Materiales

La HSA se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). N , N -El imidazol era de biotecnología en solución madre de Shanghai (Shanghai). El reactivo químico Tianjin Star (Tianjin) proporcionó etilendiamina, anhídrido succínico. Todos los demás reactivos químicos eran de calidad analítica y eran de Changsha Huicheng Co. (Changsha, China).

Síntesis de CHP, CHSP y CHAP

Síntesis de CHP

El succinato de colesterol (CHS) se sintetizó como se describió anteriormente [32]. Se disolvió una cantidad de 2 g de polisacárido de pululano en 10 ml de solución deshidratada de dimetilsulfóxido (DMSO). A continuación, se disolvieron 1,06 g de CHS, 0,505 g de EDC • HCl y 0,268 g de DMAP en una cantidad apropiada de solución de DMSO. Los dos grupos de reactivos anteriores se mezclaron y activaron a temperatura ambiente durante 1 h, luego se incubaron en un baño de aceite calentado a 50 ° C durante 48 h. Una vez detenida la reacción y enfriada a temperatura ambiente, se añadió una cantidad apropiada de etanol anhidro y el sólido blanco se precipitó mediante agitación y se obtuvo mediante filtraciones por succión repetidas. Los productos se lavaron con una cantidad apropiada de etanol anhidro, éter etílico y tetrahidrofurano y luego se secaron en un secador a 50 ° C para convertirse en un sólido blanco (Fig. 1).

Síntesis de polímeros CHP, CHSP y CHAP

Síntesis de CHAP

Una cantidad de 1,80 g de cogeneración y 1,00 g de N , N -diimidazol se disolvieron en 100 ml de DMSO. Después de calentar y agitar en un baño de aceite a 50ºC durante 4 h, se añadieron 3,60 g de etilendiamina seguido de calentamiento adicional y agitación durante 24 h. Cuando el líquido de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se dializó en una bolsa de diálisis de interceptación 4000 con agua bidestilada durante 1 día y luego se liofilizó para obtener un sólido de color amarillo claro que era el producto de pululano animado hidrofóbicamente modificado.

Síntesis de CHSP

Se disolvió una cantidad de 1,80 g de CHP en 100 ml de DMSO deshidratado, luego se disolvieron 0,5 g de anhídrido succínico y 0,05 g de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en 10 ml de DMSO activado durante 1 h; después de calentar y agitar en un baño de aceite a 50ºC durante 20 h, se detuvo la reacción. Cuando el líquido de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se colocó en una cantidad apropiada de etanol anhidro y se agitó para precipitar un sólido blanco. El sólido blanco se lavó varias veces con una cantidad apropiada de etanol anhidro, éter dietílico y tetrahidrofurano y se secó en un secador a 50 ° C. El producto obtenido fue polisacárido de pululano carboxilado hidrofóbicamente modificado.

Espectroscopía FTIR y RMN

Los espectros FTIR para CHP, CHSP y CHAP se obtuvieron como sedimentos de KBr para espectroscopía FTIR (Nicolet NEXUS 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las estructuras químicas de CHP, CHSP y CHAP fueron confirmadas por 500 MHz ¹ H-NMR, con DMSO-d6 como disolvente. El grado de sustitución del colesterol en los polímeros de CHP se determinó mediante el enlace glicosídico alfa-1,4 y alfa-1,6 y el área del pico de metileno.

Preparación y caracterización de NP

Los NP de CHP, CHSP y CHAP se prepararon mediante el método de diálisis [33]. Brevemente, se disolvieron CHP, CHSP y CHAP en 10 ml de DMSO. Para formar NP, la solución de mezcla se inyectó en una bolsa de diálisis durante 24 h para eliminar el DMSO. La solución de CHP, CHSP y CHAP NP se cribó con un filtro de membrana (tamaño de poro 0,45 m, Millipore, Boston, MA, EE. UU.) Para eliminar los agregados más grandes de CHP, CHSP y CHAP NP. La distribución de tamaño y el potencial zeta de las partículas obtenidas se determinaron mediante DLS (Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) a 11,4 V / cm, 13,0 mA.

ITC

Se goteó una cierta concentración de solución de HSA sobre las soluciones de CHP, CHSP y CHAP NP, y el cambio de calor se midió mediante ITC (VP-ITC, Microcal, Northampton, MA, EE. UU.). Se inyectó una cantidad de HSA 0,9 mM en células de titulación CHP, CHSP y CHAP NP 0,01 mM, para titulación 20 veces. La primera gota fue de 2 μL y el tiempo de reacción fue de 180 s; las gotas restantes fueron de 10 μL por gota y el tiempo de reacción fue de 210 s, y la temperatura se fijó en 25 ° C. Los parámetros termodinámicos y las curvas de conexión se obtuvieron con 28 veces de titulación.

Espectroscopia de fluorescencia

Los NP de HSA y CHP se mezclaron en una proporción de moléculas de HSA a CHP de 3.6:1 para preparar mezclas de CHP-HSA, CHSP-HSA y CHAP-HSA. Las mezclas obtenidas se colocaron en tubos EP de 2 mL y se agitaron a 20 rpm a 25 ° C durante 24 h. Los espectros de fluorescencia y la intensidad de fluorescencia (FI) de HSA libre y HSA unida a NP se registraron mediante espectrofotometría de fluorescencia (Shimadzu RF-4500, Japón). El cromóforo de triptófano en la molécula de HSA se excitó a 280 nm y los espectros de emisión se registraron a 290 a 450 nm. Los anchos de rendija de excitación y emisión fueron de 5 y 12 nm.

Se mezclaron siete soluciones de NP a diferentes concentraciones con una solución de HSA. Las soluciones mezcladas se transfirieron a tubos EP de 2 ml para una reacción de 9 h. Las muestras obtenidas se recolectaron para medir los espectros de fluorescencia a una longitud de onda de 290 a 450 nm. Los espectros de fluorescencia de la solución de HSA pura se utilizaron como referencia para determinar las constantes de unión según el análisis de Stern-Volmer. Los datos de extinción de fluorescencia se analizaron utilizando la ecuación mejorada de Stern-Volmer [34]:

$$ {F} _0 / \ left ({F} _0-F \ right) =1 / {f} _ {\ mathrm {a}} + 1 / \ left ({f} _ {\ mathrm {a}} {K} _ {\ mathrm {q}} \ izquierda [Q \ derecha] \ derecha) $$

donde K _q es la constante de extinción de Stern-Volmer, F ₀ y F son intensidades de fluorescencia a 342 nm en ausencia y presencia de extintor, y [ Q ] es la concentración de extintor.

Análisis de dicroísmo circular

Los complejos CHP-HSA se prepararon de dos formas diferentes. El primero (complejo I) se preparó simplemente mezclando soluciones de HSA y CHP. El segundo (complejo II) se mantuvo en tubos EP de 2 mL, los cuales se colocaron en mesa de agitación a 20 rpm durante 12 ha 25 ° C. Los espectros de dicroísmo circular (CD) para HSA libre y NP añadidas a la proteína se registraron a una longitud de onda de 200 a 250 nm utilizando un espectrómetro de CD (JASCO J-810, Japón) a 37 ° C con una cubeta de 0,1 cm. La concentración de HSA fue de 1.0 mg / mL en todas las muestras. El contenido relativo de α-hélice en HSA se calculó de la siguiente manera [35]:

$$ \ left [{\ theta} _ {208} \ right] =\ frac {\ theta M} {10 CL {N} _ {\ mathrm {r}}} $$

donde θ ₂₀₈ es la elipticidad media del residuo (grados cm ⁻² dmol ⁻¹ ) a 208 millas náuticas, θ es la elipticidad, M es el peso molecular de HSA, C es la concentración de HSA (mg / mL), L es la longitud de la cubeta (cm) y N _r es la cantidad de aminoácidos en la molécula de HSA.

Liberación del fármaco in vitro

Los NP cargados con mitoxantrona (MTO) se prepararon mediante un método de diálisis [36]. La curva estándar para mitoxantrona se obtuvo mediante espectrofotometría UV. La carga de fármaco y la eficacia de encapsulación se calcularon como se describe [33]. La liberación de MTO se estudió in vitro mediante diálisis en solución salina tamponada con fosfato. Brevemente, la solución de NP cargadas con MTO (2 mg / ml) se colocó en un tubo de diálisis visking y se dializó contra el medio de liberación a 37ºC en un agitador de baño de aire a 50 rpm. En momentos predefinidos, se recogió el medio de liberación y se añadió el medio de liberación nuevo. La cantidad liberada de MTO se determinó mediante espectrofotometría UV (UV-384 plus, Molecular Devices, EE. UU.) A 608 nm. El porcentaje de liberación acumulado ( Q %) se calculó como se describió anteriormente [37]. Se añadió una cierta cantidad de solución de HSA (0,1 mg / ml) al tubo de diálisis para determinar la liberación de fármaco de tres tipos de NP.

Resultados

Caracterización de polímeros CHP, CHSP y CHAP

Espectros FTIR

La Figura 2 muestra los espectros FTIR para CHP, CHSP y CHAP. Los datos para los espectros de CHP fueron 1731 cm ⁻¹ (–C =O pico de vibración de estiramiento) y 1161 cm ⁻¹ (–C =O pico de vibración de estiramiento). Este resultado demuestra la formación de enlaces éster en el pululano, lo que indica que el CHP se sintetizó con éxito.

Espectros FTIR de CHP (a), CHAP (b) y CHSP (c)

En comparación con los espectros de CHP, los datos de los espectros de CHAP fueron 1648 cm ⁻¹ (–C =O pico de absorción de vibraciones), 1734 cm ⁻¹ (–C =O pico de absorción de vibraciones), 1539 cm ⁻¹ (Pico de vibración de flexión –N – H) y 3742 cm ⁻¹ (–NH ₂ estiramiento pico de vibración). Según estos picos característicos, había enlaces amida en CHP y CHAP se sintetizó con éxito mediante la reacción de esterificación.

En comparación con los espectros de CHP, los datos de los espectros de CHSP fueron 1710 cm ⁻¹ (–C =O pico de vibración de estiramiento), 1158 cm ⁻¹ (–C =O pico de vibración de estiramiento), 1560 cm ⁻¹ (pico de vibración de acoplamiento doble –C =O) y 1421 cm ⁻¹ (–O – H pico de vibración de flexión). Esto muestra que había grupos carboxilo en CHP y parte de ellos se convirtieron en sales.

¹ H RMN

La Figura 3 muestra el ¹ Espectros de H RMN para CHP, CHSP y CHAP. Un total de 0 a 2,40 ppm pertenecían a la señal de hidrógeno del colesterol, lo que demostró la síntesis exitosa de CHP. Los picos característicos de DMSO-d 6 y metileno (–CH ₂ CH ₂ -) mostró señales a 2,49 y 2,53 ppm, respectivamente. En comparación con CHP, CHAP mostró señales de 8 a 9 ppm, que pertenecían al grupo amino y demostró que la etilendiamina se injertó en CHP. El grado de sustitución de colesterol por 100 unidades de glucosa en CHP podría calcularse mediante la relación entre los protones de metileno y los protones de azúcar con la siguiente ecuación [38]:

$$ \ mathrm {DS} =\ frac {A _ {\ parcial 2.53}} {4 \ izquierda ({A} _ {\ parcial 4.74} + {A} _ {\ parcial 5.01} \ derecha)} $$

¹ Espectros HNMR para CHP (a), CHSP (b) y CHAP (c) NP

donde A _δ2.53 es el área del espectro bajo el pico de absorción característico del metileno (hidrógeno) y A _δ4.74 y A _δ5.01 son el área del espectro bajo los picos de absorción característicos de los enlaces glicosídicos alfa-1,6 y alfa-1,4, respectivamente.

Desde el ¹ En los espectros de RMN H en CHP, el grado de sustitución del succinato de colesterol (CHS) fue del 4,50%. Para los NP de CHSP, los grupos metileno (–CH ₂ CH ₂ -) incluyó dos aspectos:anhídrido succínico y CHS. El grado de sustitución fue del 12,34% para los grupos metileno (–CH ₂ CH ₂ -) y 7,84% para grupos carboxilo. Para CHAP NP, los grupos metileno (–CH ₂ CH ₂ -) incluyó dos aspectos:etilendiamina y CHS. El grado de sustitución fue del 18,6% para los grupos metileno (–CH ₂ CH ₂ -) y 14,1% para los grupos amino.

Propiedades de CHP, CHSP y CHAP NP

Los polímeros anfifílicos pueden autoensamblarse mediante diálisis para formar NP núcleo-capa con una cubierta hidrófila y un núcleo hidrófobo, que se pueden cargar con fármacos contra el cáncer para formar NP cargadas con fármaco. Las propiedades del NP como la carga superficial y el tamaño jugaron una influencia vital en la eficacia del tratamiento como portador de fármacos [39, 40]. La distribución de tamaño y el potencial zeta de los NP de CHP, CHSP y CHAP medidos por DLS se presentan en la Fig. 4. El tamaño medio de los NP fue de 73,1, 116,9 y 156,9 nm para CHP, CHAP y CHSP, respectivamente. El potencial zeta fue - 0,698, + 12,9 y - 15,4 mV, respectivamente (Tabla 1).

Potencial Zeta ( a ) y distribución de tamaño ( b ) de centrales nucleares de cogeneración ( ), CHAP NP ( ) y NP de CHSP ( )

Para los NP de pululano con el mismo grupo hidrófobo, el tamaño fue mayor para los CHSP cargados negativamente y los CHAP cargados positivamente que los NP de CHP neutrales. Por lo tanto, el grupo cargado interfiere con el comportamiento de autoensamblaje de las NP, formando NP de mayor tamaño con una estructura suelta en solución acuosa. Los potenciales zeta de CHP NP, CHAP y CHSP NP fueron - 0,698 mV, + 12,9 mV y - 15,4 mV, respectivamente. Por lo tanto, los grupos amino y carboxilo en el polímero podrían crear NP con diferentes cargas superficiales y, por lo tanto, cambiar las propiedades de la superficie.

Análisis termodinámico

El análisis termodinámico se realizó utilizando ITC con titulación de HSA a soluciones CHP, CHSP y CHAP NP. Como titulación HSA a una solución de pululano NP con diferentes cargas, determinamos los cambios de calor, ajustando las propiedades de conexión de tres tipos de materiales, conexión y número de conexión de moléculas. El espectro original del termómetro de valoración isotérmico refleja el cambio de calor. El pico hacia arriba indica una reacción de liberación de calor, y el pico hacia abajo indica una reacción de absorción de calor [41, 42]. Cuando se valoraron los NP de CHP, CHAP y CHSP con HSA, el calor liberado de la combinación disminuyó gradualmente con el tiempo (Fig. 5). En total, se valoraron 26 gotas de solución HSA en solución CHP NP y los picos del espectro fueron hacia arriba, lo que indica la naturaleza exotérmica de la reacción. Se observó el mismo fenómeno cuando la solución de HSA se tituló en la solución de NP de CHSP. Sin embargo, cuando la solución de HSA se tituló en la solución de CHAP NP, los picos del espectro de las primeras cuatro gotas fueron hacia arriba, mientras que a partir de la quinta gota, los picos se volvieron hacia abajo, lo que indica una reacción endotérmica. La absorción de HSA de las NP de CHP y CHSP fue exotérmica, por lo que la reacción fue espontánea. La absorción de HSA de CHAP NP fue parcialmente endotérmica y parcialmente exotérmica, lo que puede estar relacionado con la carga positiva de CHAP.

Datos de calorimetría de titulación isotérmica para titulación HSA en a CHP, b CHSP y c CHAP NP a 25 ° C. La concentración de NP en la célula (250 μL) fue de 12 μM y la concentración de proteína en la jeringa fue de 230 μM. Los gráficos superiores muestran datos sin procesar y los gráficos inferiores muestran calores integrados

El valor de entalpía refleja el calor liberado por la combinación de HSA y NP. Los cambios de entalpía de CHP, CHSP y CHAP NP por HSA fueron 42,827, 80,3712 y 22,3951 KJ / mol, respectivamente (Tabla 2). Combinada con el cambio de entalpía, la reacción exotérmica, la estructura química de las NP anfifílicas y la carga negativa de HSA, la interacción hidrófoba puede impulsar principalmente la interacción de HSA con las NP de CHP y CHSP. Es de destacar que en la titulación HSA de CHAP, el calor incluyó un valor negativo. Las moléculas de HSA contienen un bolsillo hidrofóbico que se puede combinar con el centro hidrofóbico del NP [43], por lo que la interacción desencadenada por las primeras cuatro gotas de HSA y CHAP es impulsada principalmente por fuerzas hidrofóbicas. Aunque HSA tiene carga negativa y CHAP tiene carga positiva, a partir de la quinta gota, también hay una fuerza de carga entre HSA y CHAP debido a la naturaleza endotérmica de la reacción.

El valor del cambio de entropía puede reflejar la dificultad de la reacción entre HSA y NP. Las entropías de los NP de HSA y CHP, CHSP y CHAP fueron 0,251, 2,775 y 0,201 KJ / mol K, respectivamente (Tabla 2), por lo que los NP de CHP y CHAP son más fáciles de unir a HSA, mientras que los NP de CHSP son más difíciles de unir. vincular a HSA.

La cobertura de HSA y CHP, CHSP y CHAP NP fue de 1,17, 0,404 y 0,845, respectivamente. La concentración de NP se calcula en función de la concentración del polímero en lugar del número de partículas. No sabemos cuántas partículas de polímero contienen un solo NP, por lo que no podemos determinar exactamente cuánto de cada NP es adsorbido por HSA, pero según el valor de cobertura, podemos concluir que los NP de CHP tienen la mayor adsorción de HSA.

En experimentos anteriores, mostramos que el valor de afinidad, K _A , refleja la fuerza de la fuerza de unión entre NP y HSA [32]. Cuanto más fuerte es la hidrofobicidad de las NP de CHP, más fuerte es la afinidad [44]. La constante de unión de HSA y CHP fue 27,7 × 10 ⁴ M ⁻¹ , la de HSA y CHSP fue 1,41 × 10 ⁴ M ⁻¹ y la de HSA y CHAP fue 412 × 10 ⁴ M ⁻¹ . Entonces, la combinación de HSA y CHAP con carga positiva fue la más fuerte, seguida de CHP con carga neutra y CHSP con carga negativa. La combinación más fuerte de HSA y CHAP puede atribuirse a la fuerza hidrofóbica, una atracción mutua de la fuerza de carga y probablemente una carga mutuamente excluyente entre HSA y CHSP.

Espectroscopia de fluorescencia

Con espectros de fluorescencia, estudiamos la interacción entre HSA y las tres NP con diferentes cargas superficiales. HSA contiene 585 residuos de aminoácidos, con sólo un residuo de Trp en 214 (Trp214), y su espectro de fluorescencia domina en la región UV. Cuando otras moléculas interactúan con HSA, el espectro de fluorescencia de Trp puede cambiar, dependiendo de la interacción entre HSA y otras moléculas. Cuando los tres NP se mezclaron con HSA, el pico de emisión máximo del espectro de fluorescencia de HSA no experimentó un cambio químico; sólo la intensidad se debilitó hasta cierto punto (Fig. 6A). El pico máximo de emisión de HSA se observó cuando HSA se combinó con CHAP NP.

A Espectros de fluorescencia para HSA (1,5 × 10 ^{- 5} mol / L) sin (a) y con (b) CHSP, (c) CHP y (d) CHAP NP con la misma concentración (4,2 × 10 ^{- 6} prostituta). B Intensidad de emisión de HSA con CHSP, CHP y CHAP NP a 343 nm a lo largo del tiempo

Un estudio experimental demostró que la combinación de HSA y NP de pululano mostraba un proceso complejado [45]. Agregamos los tres NP en solución de HSA y encontramos que la intensidad de fluorescencia de los tres complejos NP-HSA disminuyó gradualmente (Fig. 6B). El equilibrio se alcanzó para HSA-CHSP a 556,3 nm después de 12 h, para CHP-HSA a 534,3 nm después de 10 h, y para CHAP-HSA a 512,3 nm después de 8 h. El tiempo necesario en el que se equilibra la intensidad de fluorescencia de los diferentes complejos NP-HSA está relacionado con la carga transportada por el NP. El mayor tiempo necesario para alcanzar el equilibrio se observó en CHSP-HSA con carga negativa, seguido de CHP-HSA sin carga.

La rápida reducción de la intensidad de fluorescencia inicial de los tres complejos NP-HSA (que se muestran en la Fig. 6A) se debe a la rápida adsorción de NP y HSA. La intensidad de fluorescencia subsiguiente muestra una disminución lenta hasta el estado constante debido a que la interacción de NP con HSA es un proceso lento de combinación. La intensidad de fluorescencia constante refleja el estado de saturación de la complejación. La interacción entre las tres NP con carga diferente y la HSA se sometió a un proceso de recombinación rápido temprano y a un proceso de recombinación lento posterior. La combinación de HSA cargada negativamente con CHSP cargada negativamente requirió más tiempo para lograr una saturación compleja en comparación con la CHP sin carga. La combinación de HSA cargada negativamente con CHAP cargado positivamente requirió el menor tiempo para alcanzar la saturación compleja.

La Figura 7A-C muestra los espectros de HSA combinados con diferentes concentraciones de CHSP, CHP y CHAP NP para formar complejos NP-HSA. Con el aumento de la concentración de NP, el pico de absorción máximo del complejo NP-HSA disminuyó, lo que muestra una correlación inversa.

Espectros de fluorescencia de HSA (1,5 × 10 ^{- 5} mol / L) con CHSP ( A ), Cogeneración ( B ) y CHAP ( C ) a diferentes concentraciones (a) 0, (b) 2,07 × 10 ⁻⁷ , (c) 3,31 × 10 ⁻⁷ , (d) 4,14 × 10 ⁻⁷ , (e) 8.28 × 10 ⁻⁷ , (f) 20,7 × 10 ⁻⁷ , (g) 33,1 × 10 ⁻⁷ y (h) 41,4 × 10 ⁻⁷ prostituta. D Parcelas ( n =7) para F ₀ / ( F ₀ - F) vs 1 / [ Q ], Q es la concentración de CHSP (- ◆ -), CHP (- ■ -) y CHAP (- ▲ -), respectivamente

El CHAP-HSA cargado positivamente mostró el menor tiempo para alcanzar el equilibrio.

Usamos una ecuación de Stern-Volmer modificada para analizar los datos de extinción de fluorescencia:

$$ {F} _0 / \ left ({F} _0-F \ right) =1 / {f} _ {\ mathrm {a}} + 1 / \ left ({f} _ {\ mathrm {a}} {K} _ {\ mathrm {q}} \ izquierda [Q \ derecha] \ derecha) $$

donde f _a es la fracción de contacto de la sustancia fluorescente con el extintor, K _q es la constante de extinción de Stern-Volmer, F ₀ es la intensidad de fluorescencia a 342 nm sin el extintor, F is the fluorescence intensity at 342 nm with the quencher, and [Q ] is the concentration of quencher.

From the functional image of F ₀ /(F ₀ − F ) pair 1/[Q ], we can obtain the values of f _a and K _q from the slope and the intercept (Fig. 7D). Assuming that the observed fluorescence intensity changes mainly due to the interaction between NPs and HSA, the quenching constant can be seen as a binding constant for the formation of complexes. The binding constants for HSA and CHSP, CHP, and CHAP molecules were 2.02, 2.99, 4.72 × 10⁵ M⁻¹ , respectivamente. In the previous study, we discussed the interaction between HSA and CHP NPs with different hydrophobicity substitutions [30]. The hydrophobic interaction between HSA molecules and CHP cholesterol played an important role in the formation of CHP–HSA. The greater the hydrophobic substitution of CHP, the greater the binding constant of CHP and HSA.

In the present study, we found that the value of the binding constant (K _b ) is related to the electrical properties of the NP. A surface with a positive charge, such as CHAP, has the largest K _b , and a surface without a charge, such as CHP, has the second largest K _b . The K _b for CHSP, with a negative charge, was the lowest. Therefore, in addition to the hydrophobic interaction between NPs and HSA, the electrostatic interaction between them also plays an essential part in the formation of NP–HSA complexes.

In addition, the f _a values for CHSP, CHP, and CHAP NPs were 0.269, 0.288, 0.38, respectively, so part of the Trp residue was involved in this reaction. Furthermore, the amount of HSA was too much at a given NP/HSA concentration, so free HSA molecules presented in the reaction system.

CD Spectrum Analysis

Figure 8A shows the CD spectra (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. There are two negative bands at 208 and 222 nm of the UV region in HSA spectra, which are the characteristic peaks of the α -helical structure. The α -helical content of free HSA was 55%. At the beginning of the complex, with the recombination of HSA and CHSP, CHAP, and CHP NPs, the α -helical content of HSA was reduced to 52.0%, 48.57%, and 48.0%, respectively.

A CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. B CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. C Ellipticity at 208 nm for HSA interacting with CHSP (–▲–), CHAP (–●–) and CHP (–■–) over time

Figure 8C shows that the ellipticity changes of the three samples at 208 nm over time. The ellipticity of HSA combined with CHAP and CHP NPs increased from 0 to 12 h and leveled off at 12 h, but that of HSA with CHSP NPs increased faster, i.e., the ellipticity increased from 0 to 9 h and leveled off at 9 h. Therefore, the ellipticity of the three samples gradually increased over time and the α-helical content gradually decreased; when the ellipticity maintained constant, the recombination of the sample and HSA was completed.

Figure 8C illustrates that the fastest surface absorption rate was presented on the combination of CHSP and HSA. The size, charge, and hydrophobicity of NPs can influence the migration rate of HSA to the center of NPs. The surface of CHP is not charged, the surface of CHSP is negatively charged, and the surface of CHAP is positively charged. Owing to the presence of the negative-charge mutual exclusion between CHSP and HSA, the resistance of HSA migrating to the CHSP NP center becomes larger. The traction of NPs on HSA is driven by the hydrophobic interaction forces. The traction of the three NPs on HSA is identical, so the lowest velocity of HSA migrating to the center of NPs was observed on the combination of HSA and CHSP NPs. Because the particle size is in the order of CHSP> CHAP> CHP, the particle density displays a reverse order, i.e., CHSP

The ITC results show that the amount of HSA migrating toward the center of CHSP NPs is the smallest but with the fastest speed compared with other types of NPs. Table 3 shows that the α-helix content of HSA migrating toward the center of CHP NPs was the lowest. The more the secondary structure of HSA was damaged, the faster the HSA migrated toward the center. The fastest speed was observed on HSA migrating to the center of CHSP NPs (Fig. 8C).

Figure 8B shows CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. After the complexation is completed, the α -helical content of HSA recombined with CHSP, CHAP, and CHP was reduced to 46.27%, 44.55%, and 42.91%, respectively (Table 3). With the increase in interaction time, the secondary structure of HSA was changed and the α -helical content was reduced during the process of complexation with NPs.

Drug Release

We measured the drug release rate of MTO with the three kinds of drug-loaded NPs and drug-loaded NP–HSA complexes. The drug release for free MTO was about 99.8% at 4 h (Fig. 9). The release rate in 48 h for CHP, CHAP, and CHSP NPs was 53.68%, 58.54%, and 63.24%, respectively. The drug release from all NPs was fast in the first 8 h, which was a burst release process, and the drug release remained stable after 12 h, which was a sustained release process. In vitro drug release from NPs is not affected by gastrointestinal pH and enzymes, and the dissolution of nanomaterials results in little drug release. The release is mainly determined by dissolution and diffusion [46]. The 48-h drug release rate was in the order of CHSP> CHAP> CHP, corresponding to the size of NPs. The fastest release rate was found on CHSP, which was negatively charged with the largest size. The second fast drug release rate was found on which was positively charged with the size smaller than CHSP. CHP was electrically neutral, and its drug release rate was minimal. Hence, the polymer surface groups involved in the formation of NPs affect the size of NPs and ultimately the drug release of NPs.

Mitoxantrone (MTO) release of pullulan NPs in phosphate-buffered saline (PBS) at 37 °C in vitro (□:free mitoxantrone, ○:CHP, △:CHAP, ▽:CHSP, ◁:CHAP–HSA,◇:CHP–HSA, ▷:CHSP–HSA)

The drug release rate from the combinations of HSA and CHAP, CHP, and CHSP in 48 h was 32.45%, 33.86%, and 35.76%, respectively. After the combination of NPs and HSA, the drug release in 48 h was significantly decreased as compared with HSA-free NPs, which was mainly attributed to the resistive effect and adsorption effect of HSA. At 48 h, the drug release of the compounds was in the order of CHSP–HSA> CHP–HSA> CHAP–HSA, while the drug release of HSA-free NPs was in the order of CHSP> CHAP> CHP. Although NP–HSA compounds showed significantly slow drug release, the total release of CHP-HSA decreased by 21.23% in 48 h, whereas the total release of CHAP-HSA decreased by 25.68% and that of CHSP-HSA by 28.48%. The drug release of the NPs is related to the size of the NPs and the polymer hydrophobic groups on NP surface. The adsorption of HSA can lead to significant slowdown in drug release, which is related to the hydrophobicity of NPs and also to the surface charge of NPs [46]. The adsorption of HSA is closely related to the size of the NPs and the degree of substitution of the hydrophobic groups of the polymer during the self-assembly process. Nevertheless, the drug release of the NPs is ultimately determined by the properties of the NP itself.

Discussion

As shown in Fig. 10, the formation of the NP–HSA complex is driven by a hydrophobic force between cholesterol groups of the particle core and the aromatic amino acid of the hydrophobic domain of HSA. After mixing, HSA interacts with the surface cholesterol unit and is rapidly adsorbed to the NP surface. Then, the adsorbed HSA on the NP surface is processed because of the hydrophobic forces derived from the cholesteric unit in the particle core. When overcoming the steric hindrance of polysaccharide chains in the NP shell, the adsorbed HSA gradually migrates to the core. After the hydrophobic interaction and resistance of the hydrophilic polysaccharide chain are balanced, the HSA molecule enters the particle core to become hydrophobically bound to cholesterol groups to form the NP–HSA complex.

Adsorption of HSA to NPs

For CHAP and CHSP NPs, the recombination of HSA is a complex process also subjected to the charge interaction with HSA under the traction of the hydrophobic driving force. The binding constants of the three kinds of NPs with the same hydrophobic substitution and different surface charge were in the order of CHAP> CHP> CHSP. The electrical properties also play a major part in the formation of NP–HSA. In this process, the formation of the CHSP–HSA complex was blocked by the structure of the NP shell and the repulsive force between the negative charges, which led to their loose connection. During the rapid adsorption and slow recombination, the degree of spiraling of HSA is lower for CHSP NPs than CHP NPs and CHAP NPs. Therefore, the surface charge of NPs not only changes the nature of the particles themselves but also affects the protein complex.

In the current study, we investigated the effect of NP surface charge on the interaction between NPs and proteins (Fig. 10). Three different charges of pullulan NPs with HSA adsorption still showed rapid adsorption and slow recombination. The number of HSA molecules with positively charged CHAP complex was the most, including rapid adsorption of NP–HSA by hydrophobic forces, HSA molecule migration to the center, and the HSA molecules adsorbed on the surface of NPs by charge action. CHP- and CHSP-adsorbed HSA molecules were mainly distributed in the hydrophobic center of NPs, with CHSP adsorbing fewer HSA molecules. The adsorbed number of HSA molecules is related to the hydrophobicity of NPs. The greater the degree of substitution of hydrophobicity, the more HSA is adsorbed [41]. The cholesterol substitutions of the three NPs were the same, and the number of HSA molecules adsorbed by positively charged NPs was the highest, so the adsorption of NPs and HSA was related to the hydrophobicity and surface charge of the NPs.

The surface adsorption capacity between NPs and HSA is also related to the hydrophobicity and charge of NPs. The binding force between HSA and NPs is determined by the hydrophobicity, surface charge, size, and structure of NPs. The α-helicity was decreased most at the beginning of adsorption and the complete CHP–HSA complex. CHP NP has the smallest size and highest density. The CHP NPs migrated toward the center by the hydrophobic traction; the sugar chain of the CHP NP shell was larger to inhibit the migration toward the center. The extension of the peptide chain of HSA is larger, with the α -helix decreased the most. Although CHAP NPs have hydrophobic and charge forces, they possess relatively large size, loose structure, small resistance in the periphery, small extension of the peptide chain, and small content of the α -helix. Some HSAs remained on the surface of NPs through the charge force of adsorbing, and the α -helical content is also smaller in this part of the HSA. The α -helix content of CHAP decreased less than that of CHP, mainly due to the peptide chain extension-induced central pulling force which led to α-helix content decline. During the process of the CHSP and HSA complexation, the role of the central pulling force has a reverse direction of the charge force, thereby resulting in weakening the center of the migration force. CHSP NPs are larger than CHAP NPs, and the structure of CHAP NPs is loose. Because the adsorbed number of HSA on CHAP is higher than that on CHSP, the decrease of α -helicity in CHSP is less than that in CHAP NPs. Therefore, the interaction between NPs and HSA and the decrease in α -helicity are all related to the size, density, hydrophobicity of substitution, surface charge of the NPs, and number of HSA connections.

After the NPs enter into the blood, protein adsorption affects the functions of NPs, such as the slow and controlled drug release, the travel from the blood circulation passing through the vascular barrier, targeting tissue, and entering cells. NPs interact with the HSA in the body and affect the in vivo behavior of NPs. The number of adsorbed proteins is closely related to the properties of the NPs. HSA adsorbs NPs, which affects the distribution in organs and removal of NPs, thereby altering the concentration of the drug in the body and the efficacy of the drug.

Finally, the properties of NPs, such as size, hydrophobicity, and surface charge, affect the drug release of NPs in vivo. We can design specific materials to perform specific functions with specific protein adsorption.

Conclusions

In this study, three kinds of nano-drug carriers were constructed, CHP, CHSP, and CHAP. The size, charge, drug loading properties of NPs, interaction between NPs and HSA, and drug release were all closely related to charge amount and charge type of nanomaterials. With the same degree of substitution of hydrophobicity, CHAP NPs with larger amino substitutions were the largest, CHSP NPs the second largest, and CHP NPs the smallest. The size and surface charge of the NPs were essential to the coverage of HSA, the binding constant, and the slow drug release. The positively charged CHAP binding constant was the strongest, showing the fastest drug release, and CHP NPs had the highest coverage. The combination of HSA further retarded the drug release of NPs. CHAP NPs adsorbed HSA had the slowest drug release rate.