La carga superficial gobierna la complejación de nanopartículas de pululano con albúmina sérica humana y la liberación controlada de fármacos

Resumen

El diseño de nanopartículas depende de cómo la química superficial gobierna la adsorción de proteínas en el torrente sanguíneo. Sintetizamos tres polímeros basados en pululano: pululano modificado con colesterol (CHP), pululano animado modificado con CH (CHAP) y pululano carboxilado modificado con CH (CHSP), y formamos nanopartículas mediante diálisis. La dispersión dinámica de luz reveló que el tamaño de partícula varía con el número de grupos cargados: CHP (73.1 nm, −0.698 mV), CHAP (116.9 nm, +12.9 mV) y CHSP (156.9 nm, −15.4 mV). La calorimetría de titulación isotérmica mostró perfiles termodinámicos distintos para la unión a HSA: constantes de unión (K_b) de 1.41 × 10⁴, 27.7 × 10⁴ y 412 × 10⁴ M⁻¹ para CHSP, CHP y CHAP, respectivamente, reflejando la influencia de la carga superficial. Análisis de fluorescencia y dicroísmo circular confirmaron que HSA sufre reducción de hélice α al complejarse, con CHP induciendo el mayor cambio conformacional. Estudios de liberación de fármaco in vitro con mitoxantrona demostraron que la adsorción de HSA ralentiza marcadamente la liberación: tras 48 h, CHSP–HSA liberó 35.8 %, CHP–HSA 33.9 % y CHAP–HSA 32.5 %, frente a 53.7 %, 58.5 % y 63.2 % de sus contrapartes de nanopartículas libres. Estos resultados subrayan que el tamaño de nanopartícula, la carga superficial y la formación de corona proteica dictan críticamente la cinética de liberación y, por extensión, la eficacia terapéutica.

Antecedentes

La nano-entrega de fármacos dirigida se ha convertido en piedra angular de la oncología moderna, ofreciendo liberación sostenida y toxicidad sistémica reducida. Para que una nanopartícula (NP) alcance el tejido tumoral, debe navegar la circulación sanguínea, atravesar el endotelio vascular, penetrar la matriz extracelular y entrar en las células cancerosas. La adsorción de proteínas —particularmente de proteínas plasmáticas de alta abundancia como la albúmina sérica humana (HSA)— forma una “corona proteica” que puede alterar la biodistribución de la NP, la captación celular y la liberación del fármaco. La composición de la corona está impulsada por la concentración de proteínas, la afinidad de la NP y las propiedades superficiales, incluyendo carga, hidrofobicidad y tamaño.

El pululano, un polisacárido neutro, puede modificarse químicamente para introducir grupos hidrofóbicos de colesterol, produciendo polímeros anfifílicos que se autoensamblan en NPs núcleo-cáscara. Trabajos previos han mostrado que el pululano modificado con colesterol (CHP) puede encapsular fármacos anticancerígenos y que HSA se une a CHP mediante interacciones hidrofóbicas. Basándonos en esto, diseñamos dos variantes adicionales: pululano animado modificado con CH (CHAP) con grupos amino y pululano carboxilado modificado con CH (CHSP) con grupos carboxilo. Estas modificaciones permiten explorar sistemáticamente cómo la carga superficial influye en la adsorción de proteínas y la liberación de fármacos.

Métodos

Materiales

HSA (Sigma-Aldrich), N,N-imidazol, etilendiamina, anhídrido succínico y otros reactivos fueron de grado analítico.

Síntesis de CHP, CHSP y CHAP

CHP se preparó esterificando pululano con succinato de colesterol (CHS) en DMSO, seguido de purificación. CHAP se obtuvo reaccionando CHP con N,N-diimidazol y etilendiamina; CHSP se sintetizó mediante acoplamiento con anhídrido succínico. La confirmación estructural se realizó por FTIR y ¹H-RMN, obteniendo grados de sustitución de colesterol de 4.5 % (CHP), 7.8 % (CHSP) y 14.1 % (CHAP).

Preparación y Caracterización de NPs

Las nanopartículas se formaron por diálisis de los polímeros en DMSO contra agua, seguida de filtración (0.45 µm). Tamaño y potencial zeta se midieron por dispersión dinámica de luz (DLS). NPs de CHP, CHAP y CHSP mostraron diámetros medios de 73.1 nm, 116.9 nm y 156.9 nm, con potenciales zeta de −0.698 mV, +12.9 mV y −15.4 mV, respectivamente.

Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC)

La ITC cuantificó la termodinámica de la unión de HSA a cada tipo de NP a 25 °C. Se observó unión exotérmica para CHP y CHSP, mientras que CHAP exhibió una fase exotérmica inicial seguida de unión endotérmica, reflejando la interacción de fuerzas hidrofóbicas y electrostáticas.

Espectroscopía de Fluorescencia

La fluorescencia de HSA (excitación 280 nm, emisión 290–450 nm) se monitorizó tras mezclar con cada tipo de NP. El análisis de quenching usando una ecuación de Stern-Volmer modificada arrojó constantes de unión de 2.02, 2.99 y 4.72 × 10⁵ M⁻¹ para CHSP, CHP y CHAP, respectivamente, indicando la interacción más fuerte para CHAP de carga positiva.

Análisis de Dicroísmo Circular

Los espectros CD (200–250 nm) evaluaron cambios en la estructura secundaria de HSA tras la unión a NPs. El contenido de hélice α disminuyó del 55 % (HSA libre) al 48–52 % para los complejos, con la reducción más pronunciada para CHP–HSA.

Liberación de Fármaco In Vitro

Mitoxantrona (MTO) se encapsuló en cada NP vía diálisis. Los perfiles de liberación se midieron en PBS a 37 °C, con y sin HSA (0.1 mg/mL). El fármaco libre liberó 99.8 % en 4 h. Para NPs solas, las tasas de liberación a 48 h fueron 53.7 % (CHP), 58.5 % (CHAP) y 63.2 % (CHSP). La presencia de HSA redujo estas tasas a 33.9 % (CHP–HSA), 32.5 % (CHAP–HSA) y 35.8 % (CHSP–HSA).

Resultados

Caracterización de Polímeros CHP, CHSP y CHAP

Los espectros FTIR confirmaron la funcionalización exitosa: picos de carbonilo éster a 1731 cm⁻¹ para CHP, picos de amida a 1648 cm⁻¹ para CHAP y picos de carboxilo a 1710 cm⁻¹ para CHSP. El análisis RMN cuantificó los grados de sustitución.

Propiedades de NPs de CHP, CHSP y CHAP

El tamaño y la carga superficial influyeron directamente en el autoensamblaje de NPs: CHSP cargado negativamente y CHAP cargado positivamente formaron partículas mayores (156.9 nm y 116.9 nm) comparado con CHP neutro (73.1 nm). Los potenciales zeta reflejaron los grupos funcionales incorporados (−15.4 mV, +12.9 mV, −0.698 mV). La presencia de grupos cargados interrumpió el empaquetamiento del núcleo, generando estructuras más sueltas y grandes.

Análisis Termodinámico

Los datos ITC revelaron unión exotérmica para CHP (ΔH = 42.8 kJ mol⁻¹) y CHSP (ΔH = 80.4 kJ mol⁻¹), y un perfil mixto exo-endo para CHAP (ΔH = 22.4 kJ mol⁻¹). Los cambios de entropía sugirieron unión más fácil de HSA a CHP y CHAP (ΔS = 0.251 y 2.775 kJ mol⁻¹ K⁻¹) que a CHSP (ΔS = 0.201 kJ mol⁻¹ K⁻¹).

Espectroscopía de Fluorescencia

El quenching de fluorescencia confirmó una fase rápida de adsorción seguida de formación de complejo más lenta. Las constantes de unión derivadas del análisis Stern-Volmer coincidieron con los resultados ITC, subrayando el papel dominante de la electrostática para CHAP y la hidrofobicidad para CHP.

Análisis de Espectros CD

Las mediciones CD mostraron pérdida progresiva de hélice α al complejarse: CHP–HSA cayó a 48.0 %, CHAP–HSA a 48.6 % y CHSP–HSA a 52.0 %. La reducción más rápida de helicidad ocurrió para CHP, consistente con su núcleo compacto y densamente empaquetado.

Liberación de Fármaco

La adsorción de HSA ralentizó consistentemente la liberación de fármaco en todos los tipos de NP. La jerarquía de tasas de liberación (48 h) coincidió con la secuencia de tamaño y carga superficial: CHSP > CHAP > CHP para NPs libres, y CHSP–HSA > CHP–HSA > CHAP–HSA para complejos unidos a proteína. Estos hallazgos destacan cómo la corona proteica modula las vías de difusión y degradación.

Discusión

Nuestros datos confirman que la carga superficial es factor decisivo en la formación de corona de HSA y la subsiguiente liberación de fármaco. El CHAP cargado positivamente formó el complejo NP–HSA más fuerte, atribuible a la atracción electrostática combinada y anclaje hidrofóbico. En contraste, el CHSP cargado negativamente exhibió la unión más débil, limitada por repulsión de carga y una cáscara más porosa que ralentizó la migración de la proteína al núcleo. El CHP neutro ocupó una posición intermedia, mostrando la mayor cobertura de HSA debido a su núcleo hidrofóbico compacto.

Estas interacciones influyen en el destino in vivo de NPs cargadas con fármaco. Una corona proteica densa puede impedir la traversia endotelial, alterar la distribución orgánica y reducir la captación celular. Ajustando la carga superficial, podemos modular la composición de la corona y así afinar la farmacocinética y las ventanas terapéuticas.

Conclusiones

Diseñamos exitosamente tres nanopartículas basadas en pululano con cargas superficiales distintas. Tamaño, carga e hidrofobicidad gobernaron colectivamente la adsorción de HSA, la fuerza de unión y la cinética de liberación de fármaco. El CHAP cargado positivamente exhibió la unión proteica más fuerte y la liberación de fármaco más lenta, mientras que el CHP neutro mostró la mayor cobertura proteica pero la liberación más rápida entre NPs libres. Estos insights proporcionan un modelo para diseñar nanovehículos con perfiles de corona proteica adaptados para optimizar la entrega dirigida y la liberación controlada.

Abreviaturas

EDX

Espectroscopía de rayos X dispersiva en energía

SEM

Microscopio electrónico de barrido

TEM

Microscopía electrónica de transmisión

XRD

Difracción de rayos X