Sensor de óxido de titanio permite nanodetección temprana de cáncer de cabeza y cuello

Resumen

El cáncer de cabeza y cuello es una enfermedad heterogénea que se origina en las células escamosas que recubren la laringe (caja de la voz), boca, faringe (garganta), cavidad nasal y glándulas salivales. El diagnóstico en etapas avanzadas influye gravemente en la tasa de supervivencia del paciente, haciendo obligatoria la identificación en etapas tempranas con un biomarcador adecuado. El antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC-Ag) es un biomarcador tumoral sérico circulante, cuyos niveles elevados se encuentran en pacientes con cáncer de cabeza y cuello y se correlacionan altamente con el volumen tumoral. La presente investigación se realizó para detectar y cuantificar el nivel de SCC-Ag en un sensor de electrodo interdigitador (IDE) modificado con óxido de titanio (TiO₂) mediante anticuerpo anti-SCC-Ag. La detección de SCC-Ag se logró a nivel de 100 fM, mejorando a 10 fM cuando el anticuerpo se conjugó con nanoestrellas de oro (GNS), representando una mejora de 10 veces. Sorprendentemente, esta mejora en sensibilidad es 1000 veces superior a otros sustratos. Además, el análisis de especificidad con dos proteínas de control mostró que el anticuerpo solo reconoció SCC-Ag, indicando detección específica en la superficie sensora IDE-TiO₂.

Introducción

El cáncer de cabeza y cuello muestra crecimiento celular anormal en la zona de cabeza y cuello y es ampliamente reportado. Se origina en garganta, boca, mucosa, epitelio de cavidad oral, glándulas salivales y cavidad nasal; es el sexto cáncer más común en el mundo y afecta a más de 644.000 personas al año. La mayoría de pacientes se diagnostican en etapas avanzadas, afectando gravemente su supervivencia. La identificación en etapa temprana es obligatoria para mejorar la supervivencia y calidad de vida. Los marcadores tumorales serológicos se han usado para diagnosticar y manejar el seguimiento del tratamiento. Las células escamosas liberan predominantemente el antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC-Ag), cuya presencia está elevada en pacientes con cáncer y ha demostrado ser un marcador tumoral prometedor para cánceres relacionados con células escamosas como ginecológicos, pulmonares, esofágicos y anales. En cáncer de cabeza y cuello, niveles más altos de SCC-Ag se han asociado con metástasis, recurrencia y mortalidad. Investigadores han encontrado que el SCC-Ag sérico estaba en nivel de riesgo significativo para cánceres en hipofaringe, cavidad oral y laringe. Además, existía correlación entre el nivel de SCC-Ag y el volumen tumoral. Es prudente cuantificar el nivel de SCC-Ag para identificar la condición del cáncer y proporcionar tratamiento temprano. La investigación actual se centró en detectar SCC-Ag en su nivel más bajo usando nanopartículas en sensor de electrodo interdigitador (IDE) mediante anticuerpo anti-SCC-Ag.

El IDE es un biosensor electroquímico con características prometedoras como bajo costo, portabilidad y sensibilidad, lo que permite amplia gama de aplicaciones, particularmente en monitoreo ambiental y diagnóstico médico. Mejorar la propiedad eléctrica en la superficie sensora mejora la detección de biomoléculas. La aplicación de nanomateriales se ha usado ampliamente en biosensores para mejorar la detección biomolecular en superficies sensoras. Los nanomateriales son de tamaño menor, tienen mayor área superficial, buena conductividad térmica y eléctrica, son compatibles con biomoléculas y muestran tremenda capacidad para aplicarse en biosensores. Los nanomateriales se han aplicado de dos formas: funcionalización de superficie y conjugación del analito o blanco para mejorar la detección. El oro es uno de los nanomateriales mejor establecidos y se aplica en diversos sensores, incluyendo resonancia de plasmones superficiales, sensores de modo de guía de onda, sensores electroquímicos y colorimetría. Además, nanomateriales de plata, grafeno, cobre y titanio también se han aplicado en aplicaciones biomédicas. Como semiconductor ecológico y de bajo costo, el óxido de titanio (TiO₂) tiene banda prohibida ancha utilizada aquí para modificación de superficie en IDE para detectar SCC-Ag. Debido a sus altas propiedades eléctricas y ópticas, el TiO₂ se usa ampliamente para supercapacidad, fotocatálisis y conversiones fotoeléctricas. Además, su naturaleza hidrofílica y mayor área superficial son adecuadas para modificación de superficie y ayudan a detectar biomoléculas en niveles más bajos. En esta investigación, el TiO₂ se recubrió en la superficie sensora IDE para mejorar el flujo eléctrico durante la interacción de biomoléculas. Para mejorar la detección de SCC-Ag, un anticuerpo se conjugó con nanoestrella de oro (GNS anticuerpo) e inmovilizó en superficie recubierta con TiO₂. Dado que se ha demostrado que biomoléculas conjugadas con nanomateriales de oro exhiben mayor estabilidad y proporcionan biomoléculas inmovilizadas en superficie correctamente orientadas, tienen la capacidad de mejorar el límite de detección. Además, más biomoléculas pueden inmovilizarse en una sola partícula de oro, lo que permite atraer niveles elevados de la molécula blanco. En este trabajo, se usaron dos nanomateriales diferentes: TiO₂ (para modificación de superficie) y GNS (para conjugación de anticuerpo) para mejorar la detección de SCC-Ag en superficie sensora IDE. Se espera que la aplicación de GNS mejore el rendimiento del sensor actual por su mayor superficie para capturar mayor número de anticuerpos.

Materiales y Métodos

Reactivos y Biomoléculas

Antígeno SCC (glicoproteína con isoformas de 45 a 55 kDa) se adquirió de Randox Life Sciences (Malasia). Anticuerpo anti-SCC de Next Gene (Malasia). (3-Aminopropil)trietoxisilano (APTES), etanolamina, albúmina (proteína sanguínea principal a 45 mg/mL; 50-70% de proteína sanguínea con peso molecular 66,5 kDa), tampón fosfato salino (PBS; pH 7,4) e isopropóxido de titanio IV de Sigma Aldrich (EE. UU.). Serpina (inhibidor de proteasa serina comúnmente distribuido con peso molecular 40-50 kDa) de Sino Biological (China). Nanoestrella de oro sintetizada según Shan et al. Todos los reactivos y químicos se almacenaron según recomendación del fabricante.

Fabricación de Electrodos Interdigitadores

El diseño básico y fabricación de IDE se siguieron según reporte previo. Inicialmente, la oblea de silicio se limpió con soluciones de limpieza estándar, y el electrodo IDE de aluminio se depositó por método tradicional de grabado húmedo sobre la oblea. Luego, se depositó fotorresistente positivo en la superficie, seguido de oxidación térmica. La deposición de aluminio se realizó por técnica de fotolitografía. Tres pasos: paso 1 a 1200 rpm por 10 s, paso 2 a 3500 rpm por 20 s, seguido de 500 rpm por 10 s. Luego, luz ultravioleta (UV) se expuso en la superficie sensora para transferir el patrón IDE. Después, desarrollador RD-6 se usó por 15 s para el proceso de revelado. Se realizó fotorresistencia para eliminar regiones no expuestas. La muestra revelada se horneó a 100 °C para eliminar humedad innecesaria y mejorar la adhesión entre la capa SiO₂ y el aluminio. Finalmente, usando 23 s de grabador de aluminio, se eliminó el área no expuesta y se limpió con acetona. La superficie final se modificó con TiO₂ para detectar SCC-Ag. La superficie IDE fabricada se observó bajo microscopía de alta potencia y nanoprofiler 3D. Las imágenes se capturaron con el sistema asociado a ×50 aumentos.

Recubrimiento de TiO₂ en Superficie Sensora IDE

Sobre la superficie IDE fabricada, se recubrió solución de TiO₂ usando isopropóxido de titanio IV como precursor. Para ello, etanol se mezcló con isopropóxido de titanio IV y se agitó vigorosamente por 5 min. Luego, se añadió estabilizador (100 μL de ácido acético) bajo agitación y se calentó en placa caliente a 85 °C. La proporción molar se fijó en 9:1:0,1 (etanol a TIP a ácido acético). Tras 3 h de mezcla, se obtuvo solución clara. Tras 24 h de envejecimiento, la solución se depositó sobre sustratos de dióxido de silicio (SiO₂) usando centrifugadora a 2000 rpm. Tras recubrimiento, la superficie se secó 15 min a 175 °C y se recoció 1 h a 450 °C. La película delgada de TiO₂ alcanza espesor suficiente tras recubrir tres capas.

Preparación de GNS Conjugado con Anti-SCC-Ag

El anticuerpo SCC-Ag se inmovilizó en GNS usando el enlazador ácido 16-mercaptoundecanoico (16-MDA). Inicialmente, 5 mM de 16-MDA diluido se mezcló con 100 μL de GNS y se mantuvo a temperatura ambiente (TA) por 30 min. El 16-MDA unido a GNS se eliminó por centrifugación a 13.000×g, 5 min. El pellet de oro recolectado se activó con EDC (400 mM) y NHS (50 mM) en proporción 1:1 incubando 15 min a TA. El EDC y NHS no unidos se eliminaron por centrifugación a 13.000×g, 5 min. El pellet con GNS activado se recogió para conjugar el anticuerpo. Luego, 200 nM de anticuerpo SCC-Ag se mezcló con GNS activado EDC-NHS y se mantuvo a TA por 1 h. Finalmente, los anticuerpos no unidos se eliminaron por centrifugación a 13.000×g, 5 min. El anticuerpo conjugado con GNS se guardó a 4 °C para uso posterior, y la conjugación se confirmó por espectroscopía UV-Vis. El barrido se realizó entre 480 y 560 nm, encontrándose los máximos de pico.

Inmovilización de Anticuerpo GNS en Superficie TiO₂-IDE

La superficie IDE recubierta con TiO₂ se modificó a amina por APTES para inmovilizar anticuerpo GNS. APTES al 3% (diluido en 30% etanol) se depositó en superficie TiO₂ y se mantuvo 3 h a TA. La superficie se lavó tres veces con 30% etanol para eliminar APTES no unido. Para inmovilizar el anticuerpo, se siguió el paso de activación mencionado. El anticuerpo o anticuerpo GNS se depositó en las superficies y se esperó 1 h para completar la inmovilización. Finalmente, la superficie se lavó cinco veces con tampón PBS para eliminar completamente anticuerpos no unidos. Estas superficies modificadas con anticuerpo o anticuerpo GNS se usaron para detectar SCC-Ag y comparar. La superficie TiO₂ con anticuerpo GNS inmovilizado se analizó por microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía electrónica de transmisión de emisión de campo (FETEM) y analizador de rayos X dispersivos en energía (EDX). Observaciones AFM a escala 5 μm, mientras que SEM a escala 100 nm operado a 15 kV. La presencia de elementos se encontró por EDX.

Detección de Antígeno SCC en Superficies Anticuerpo/GNS Anticuerpo

Para detectar SCC-Ag, las superficies TiO₂-IDE modificadas con anticuerpo o anticuerpo GNS se bloquearon con 1 M etanolamina para enmascarar áreas libres de anticuerpo y se mantuvo 30 min a TA. Sobre la superficie bloqueada, 1 nM de SCC-Ag interactuó y se observaron respuestas de corriente antes y después de la adición de SCC-Ag. Para evaluar el límite de detección, SCC-Ag se titularon de 10 fM a 1 nM y se depositaron individualmente en superficies modificadas con anticuerpo o GNS anticuerpo, anotando respuestas de corriente. Los experimentos se realizaron en triplicado y se calcularon estadísticas. Se siguió barrido lineal de voltaje de 0 a 2 V a paso de 0,01 V para mediciones. El límite de detección (LOD) se consideró la concentración más baja de analito (desde la línea de calibración a bajas concentraciones) contra la señal de fondo (S/N = 3:1), es decir, LOD = desviación estándar de la línea base + 3σ.

Detección Selectiva de SCC-Ag

Para verificar la interacción selectiva de SCC-Ag con su anticuerpo, se realizaron experimentos de control con dos proteínas diferentes: serpina y albúmina. Una concentración de 1 nM de estas proteínas de control se depositó en superficies modificadas con anticuerpo o GNS anticuerpo, observando cambios en la corriente antes y después de la interacción. Estos niveles de corriente se compararon con la detección específica de SCC-Ag por su anticuerpo y GNS anticuerpo. Otros controles incluyen interacción de SCC-Ag con GNS solo y SCC-Ag con superficie TiO₂-IDE recubierta con GNS etiquetado con anticuerpo no inmune. Los experimentos se realizaron en triplicado y se calcularon estadísticas. Se siguió barrido lineal de voltaje de 0 a 2 V a paso de 0,01 V para mediciones.

Resultados y Discusión

El cáncer de cabeza y cuello se ha descrito como diferentes tumores que se desarrollan en o alrededor de la nariz, boca, laringe y senos paranasales. El diagnóstico y tratamiento temprano con biomarcador adecuado son obligatorios para mejorar la tasa de supervivencia. SCC-Ag se encontró como biomarcador sérico adecuado; aquí, se realizaron experimentos para detectar y cuantificar SCC-Ag en sensor de electrodo interdigitador (IDE) modificado con TiO₂ (IDE-TiO₂) por su anticuerpo. El TiO₂ se usa aquí para mejorar la respuesta de corriente durante la interacción de biomoléculas. Comparado con otros nanomateriales, el TiO₂ se considera atractivo en sensores electroquímicos por su comportamiento activo en la superficie a lo largo de electrodos y mejora de la actividad electrocatalítica. Además, da más estabilidad a la superficie, lo que produce repetibilidad de la respuesta del electrodo y mejora en el límite de detección al aumentar la corriente de pico. Para utilizar esta característica positiva, en esta investigación, el TiO₂ recubierto en la superficie IDE (IDE-TiO₂) mejora el flujo de corriente. Otro nanomaterial GNS se usó para inmovilizar anticuerpo anti-SCC-Ag en superficie IDE-TiO₂ y mejorar el límite de detección. Dado que se ha demostrado que superficie con biomoléculas conjugadas con oro inmovilizadas mejora la detección del blanco, aquí SCC-Ag se detectó y comparó con superficies IDE-TiO₂ modificadas con anticuerpo y GNS anticuerpo. Como se generaliza, con aumento del área superficial de la nanopartícula, habrá mejora en la fijación biomolecular. En este contexto, GNS tiene mayor superficie comparado con nanopartícula esférica de oro. Para implementar esta idea, el experimento actual se realizó usando GNS para mejorar la sensibilidad.

Caracterización de Superficie e Inmovilización de Anticuerpo GNS

La Figura 1 muestra la representación esquemática de la detección de SCC-Ag en superficie sensora IDE-TiO₂. Como se muestra en Fig. 1a, inicialmente la superficie sensora IDE se recubrió con TiO₂ y luego el anticuerpo se inmovilizó con o sin conjugación GNS. Estas superficies modificadas con anticuerpo se usaron para detectar el nivel de SCC-Ag. Antes de la detección, la conjugación de GNS con anticuerpo se confirmó por espectroscopía UV-Vis. Se determinaron los perfiles de barrido GNS con el rango de longitud de onda deseado antes y después de conjugación con anticuerpo. Se observó claramente que tras la inmovilización, el desplazamiento se movió de 535 a 545 nm (Fig. 1b). Este resultado confirma la conjugación de anticuerpos en la superficie de GNS. Por otro lado, la superficie sensora fabricada se observó morfológicamente. La Figura 2a muestra imagen de microscopía de alta potencia, mientras que Fig. 2b describe imagen de imagenador nanoprofiler 3D. Ambos perfiles muestran claramente regiones de electrodo y hueco, que forman los dedos. La disposición de huecos y dedos apareció uniforme e intacta.

a Representación esquemática para detección de SCC-Ag. Superficie IDE-TiO₂ modificada a amina por APTES seguida de inmovilización de anticuerpo o GNS anticuerpo. El grupo amina de APTES reacciona con grupo carboxilo en el anticuerpo. SCC-Ag detectado por interacción en región antigénica y comparado. b Mediciones espectroscopía UV-Vis con GNS. Barrido en región entre 480 y 560 nm, máximos de pico ~530 nm. GNS con y sin anticuerpo indicados por flechas

a Imagen microscopía alta potencia en superficie IDE. Imágenes capturadas a ×50. b Imagen nanoprofiler 3D en superficie IDE. Imágenes capturadas a ×50. Regiones de electrodo y hueco mostradas. Huecos indicados por estrellas. Disposición uniforme indica fabricación exitosa. c Imagen microscopía fuerza atómica. AFM muestra clara discriminación entre TiO₂ y GNS por manchas oscuras y brillantes, respectivamente. d Imagen microscopía electrónica transmisión emisión campo. e Análisis rayos X dispersivos energía. Elementos encontrados en superficie indicados

Comparación en Inmovilización Anticuerpo y GNS Anticuerpo en Superficies Sensora TiO₂-IDE

SCC-Ag se detectó en superficie TiO₂-IDE por superficies inmovilizadas con anticuerpo o GNS anticuerpo. La fijación de GNS en superficie TiO₂ se confirmó por observaciones AFM, SEM y análisis EDX (Fig. 2c). Bajo observación AFM, se notó clara discriminación entre TiO₂ y GNS por manchas oscuras y brillantes, respectivamente. Esto fue respaldado por análisis SEM y EDX, donde se observaron picos prominentes de oro y moderados de titanio. Estos resultados evidencian la presencia de GNS en superficie TiO₂. La Figura 3 muestra los procesos de inmovilización de anticuerpo y GNS anticuerpo en superficies sensora IDE-TiO₂ modificadas con amina. La superficie IDE modificada con TiO₂ muestra nivel de corriente 4,65E−12 (Fig. 3a). Tras añadir APTES, el nivel aumentó a 5,37E−11; este incremento indicó que la superficie se modificó a amina por APTES. Al inmovilizar el anticuerpo, el nivel cambió de 5,375E−11 a 1,05E−9. La diferencia fue 1,04E−9 (Fig. 3a). Esto ocurrió por interacción química del grupo amina del APTES y grupo COOH en el anticuerpo. Los cambios en corriente confirmaron la unión del anticuerpo en superficie modificada con APTES. Luego, la superficie restante se cubrió con 1 M etanolamina para reducir bioensuciamiento por unión no específica. Similarmente, GNS anticuerpo se inmovilizó en superficie TiO₂-IDE; al inmovilizar GNS anticuerpo en superficie modificada con APTES, el nivel de corriente aumentó de 4,41E−12 a 1,23E−9 (Fig. 3b). Se encontró claramente que cuando el anticuerpo se inmovilizó en superficie GNS, muestra mayor respuesta en superficie modificada con amina. Esto puede deberse a mayor número de anticuerpos unidos en superficie de un solo GNS y unión fuerte de este complejo en superficie modificada con amina. Esta unión ocurrió porque el grupo amino terminal en APTES desplaza grupos citrato en GNS y se fija químicamente en superficie IDE modificada con APTES. Se sabe que la detección de biomoléculas en superficies sensoras depende principalmente de dos factores: afinidad de unión de moléculas interactivas e inmovilización superficial adecuada de moléculas en la superficie sensora. La mayor inmovilización biomolecular en superficie sensora mejora drásticamente la detección de un blanco en su nivel más bajo. En esta investigación, GNS se usó para inmovilizar anticuerpo anti-SCC-Ag en superficie IDE-TiO₂ para mejorar la posibilidad de mayor unión de anticuerpo, lo que conduce a detección eficiente de SCC-Ag.

Procesos de inmovilización en superficies IDE-TiO₂. a Con anticuerpo. b Con GNS anticuerpo. Modificaciones iniciadas con 3% APTES, seguido de activación EDC y NHS para inmovilizar anticuerpo; 1 M etanolamina usado para bloquear región de anticuerpo no unido. Barrido lineal de voltaje 0 a 2 V a paso 0,01 V seguido para mediciones. Cambios adecuados en corriente tras cada inmovilización confirmaron unión de anticuerpo y GNS anticuerpo en superficies sensoras

Detección Comparativa de SCC-Ag en Superficie IDE-TiO₂ por Anticuerpo o GNS Anticuerpo

Dado que GNS anticuerpo muestra inmovilización eficiente en superficie IDE-TiO₂, la misma concentración de 1 nM SCC-Ag se detectó en ambas superficies y se compararon cambios en nivel de corriente. La Figura 4a muestra detección de 1 nM SCC-Ag en superficie modificada con anticuerpo. Antes de la detección, la superficie se cubrió con agente bloqueante etanolamina para evitar unión no específica. Etanolamina muestra cambio de corriente 4,65E−12. Tras añadir 1 nM SCC-Ag, el nivel aumentó a 1,33E−09. Estos cambios indican claramente unión de SCC-Ag a su anticuerpo. En caso de superficie GNS anticuerpo, etanolamina muestra nivel 1,33E−11; tras añadir 1 nM SCC-Ag, aumentó a 1,62E−09 (Fig. 4b). Los cambios de corriente con GNS anticuerpo fueron mayores comparados con solo anticuerpo para concentración similar de SCC-Ag. Esto puede deberse a mayor número de anticuerpos unidos en superficie IDE-TiO₂ a través de GNS.

Detección SCC-Ag con a anticuerpo y b GNS anticuerpo. Probado en superficies IDE-TiO₂ con pasos previos hasta 1 M etanolamina bloqueo. Barrido lineal 0 a 2 V a paso 0,01 V para mediciones. Tras interacción 1 nM SCC-Ag, niveles de corriente aumentaron en ambos casos; al mismo tiempo, muestra mayor cambio con GNS anticuerpo

Límite de Detección de SCC-Ag en Superficie IDE-TiO₂ por Anticuerpo o GNS Anticuerpo

Las superficies modificadas con anticuerpo o GNS anticuerpo muestran detección clara de SCC-Ag, y el límite de detección se estimó en ambas para comparación (Figura 5a, b). Para ello, concentraciones de 10 fM a 1 nM de SCC-Ag se diluyeron y depositaron individualmente en estas superficies, anotando cambios de corriente. La Figura 5a muestra diferentes concentraciones de SCC-Ag uniéndose en superficie modificada con anticuerpo. Tras etanolamina, 10 fM SCC-Ag interactuó y no se notó cambio de corriente. Al aumentar a 100 fM, hubo cambio menor de 4,65E−12 a 6,54E−11. Al aumentar concentraciones a 1 pM, 10 pM, 100 pM y 1 nM, los niveles de corriente aumentaron a 4,69E−10, 7,91E−10, 8,78E−10 y 1,33E−09, respectivamente. Estos resultados indican claramente que con aumento de concentraciones, la unión también aumenta. El límite de detección se calculó basado en 3σ, resultando 100 fM (Fig. 6a).

Interacciones dependientes de dosis con a anticuerpo y b GNS anticuerpo en superficies IDE-TiO₂. La superficie con pasos previos hasta 1 M etanolamina bloqueo. Barrido lineal 0 a 2 V a paso 0,01 V para mediciones. Concentraciones SCC-Ag de 10 fM a 10 nM interactuaron en ambas superficies, notándose cambios de corriente. Lavado realizado con cinco volúmenes de reacción en cada paso usando 10 mM PBS (pH 7,4). Con aumento de concentraciones SCC-Ag, niveles de corriente aumentaron gradualmente en ambos casos. GNS anticuerpo muestra cambios de corriente desde 10 fM, mientras cambios desde 100 fM con solo anticuerpo. En ambos casos, 1 nM SCC-Ag mostró saturación. Al aumentar concentración más, no se observaron cambios significativos en corriente

Comparación de cambios de corriente con diferentes concentraciones SCC-Ag en superficies modificadas con anticuerpo y GNS anticuerpo. a Gráfico regresión lineal para límite detección SCC-Ag. Con anticuerpo (línea roja) y con GNS anticuerpo (línea azul) mostrados. Límite detección 10 fM con GNS anticuerpo y 100 fM con solo anticuerpo. b Cambios corriente con interacción SCC-Ag y anticuerpo. Con todas las concentraciones, mayor nivel cambios encontrado en superficie GNS anticuerpo. Barrido lineal 0 a 2 V a paso 0,01 V para mediciones. Barra error indica valores promediados de triplicados (n=3) con desviaciones estándar en rango ±0,1 a 0,15 × 10⁻⁹ A. Límite detección (LOD) considerado concentración más baja analito (desde línea calibración bajas concentraciones) contra señal fondo (S/N = 3:1), es decir, LOD = desviación estándar línea base + 3σ

Las mismas concentraciones de SCC-Ag interactuaron independientemente en superficies modificadas con GNS anticuerpo. Cuando 10 fM SCC-Ag se depositó, cambió claramente la corriente de 1,33E−11 a 3,74E−11. Este resultado muestra que incluso 10 fM SCC-Ag puede interactuar claramente con superficie inmovilizada con GNS anticuerpo, lo cual no se detecta con solo anticuerpo. Al aumentar concentraciones a 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM y 1 nM, los niveles aumentaron a 4,69E−10, 9,23E−10, 1,41E−09, 1,48E−09 y 1,62E−09, respectivamente (Fig. 5b). Los cálculos estadísticos con desviaciones estándar están en rango ±0,1 a 0,15 × 10⁻⁹ A. Comparando la detección en ambas superficies, la superficie GNS anticuerpo muestra mayores cambios de corriente con todas las concentraciones SCC-Ag probadas (Fig. 6b). Basado en 3σ, el límite de detección fue 10 fM (Fig. 6a), 10 veces mejor (más bajo) comparado con solo superficie modificada con anticuerpo. Previamente, SCC-Ag se evaluó en diferentes nanomateriales como nanopartícula de estroncio y grafeno; sin embargo, estas superficies mostraron ~1000 veces menor sensibilidad comparado con el estudio actual.

Detección Selectiva de SCC-Ag en Superficies Modificadas con Anticuerpo/GNS Anticuerpo

La detección selectiva de SCC-Ag se comparó con dos proteínas de control: serpina y albúmina, abundantes en torrente sanguíneo. Serpina es inhibidor de proteasa con funciones fisiológicas y procesos biológicos, mientras albúmina representa 45 mg mL⁻¹ y contribuye 50-70% en suero sanguíneo. Como se muestra en la figura, concentración 1 nM de estas dos proteínas control y SCC-Ag se depositaron individualmente en superficies anticuerpo o GNS anticuerpo (Fig. 7a); se vio claramente que los cambios de corriente solo se notaron con SCC-Ag en ambos casos, indicando que el anticuerpo solo reconoce SCC-Ag. No hubo cambios significativos en corriente con interacción de proteínas control. Este experimento confirma que el montaje experimental actual puede detectar/diagnosticar específicamente SCC-Ag. Otros controles respaldan esto: interacciones de SCC-Ag con GNS solo y SCC-Ag con superficie TiO₂-IDE recubierta con GNS etiquetado con anticuerpo no inmune. No hubo cambios significativos en corriente comparado con interacción específica (Fig. 7b).

a Detección selectiva SCC-Ag en superficies modificadas con anticuerpo y GNS anticuerpo. Interacciones con C1-serpina y C2-albúmina realizadas. Superficie con pasos previos hasta 1 M etanolamina bloqueo. Valores promediados por triplicados. En ambos casos, anticuerpo solo reconoció SCC-Ag, indicando detección específica. b Mediciones control. Interacciones específicas comparadas con no específicas. Claras discriminaciones notadas. Barrido lineal 0 a 2 V a paso 0,01 V para mediciones. Barra error indica valores promediados de triplicados (n=3) con desviaciones estándar en rango ±0,1 a 0,15 × 10⁻⁹ A

Conclusión

El cáncer de cabeza y cuello es un cáncer común que afecta boca, garganta y glándulas salivales. Diagnosticarlo con biomarcador adecuado es obligatorio para dar tratamiento necesario y mejorar calidad de vida. SCC-Ag se ha encontrado como biomarcador importante; aquí, SCC-Ag se detectó en superficie sensora de electrodo interdigitador recubierta con óxido de titanio (IDE-TiO₂). Anticuerpo para SCC-Ag se inmovilizó en superficie IDE-TiO₂ y detectó SCC-Ag. El límite de detección fue 100 fM, y se logró incremento adicional conjugando anticuerpo con nanoestrella de oro (GNS anticuerpo). El límite mejoró 10 veces (a 10 fM), posiblemente por mayor número de anticuerpos unidos en superficie TiO₂ modificada con amina a través de GNS. Además, experimentos de control con dos proteínas diferentes no fueron reconocidos por anti-SCC-Ag, indicando detección selectiva de SCC-Ag. La superficie sensora IDE-TiO₂ demostrada ayuda a diagnosticar cáncer de cabeza y cuello, estrategia que puede seguirse para detección temprana.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin restricción.

Abreviaturas

16-MDA:

Ácido 16-mercaptoundecanoico

APTES:

(3-Aminopropil)trietoxisilano

GNS:

Nanoestrella de oro

IDE:

Electrodo interdigitador

PBS:

Tampón fosfato salino

TA:

Temperatura ambiente

SCC-Ag:

Antígeno de carcinoma de células escamosas

SiO₂:

Dióxido de silicio

TiO₂:

Óxido de titanio

UV:

Ultravioleta