Biosensor longitudinal de capacitancia depositada con nanocompuestos de óxido de hierro y zeolita para interleucina-3 en la detección de sepsis

Materiales y métodos

Aparatos y reactivos

Las cenizas volantes se recibieron de una planta de energía térmica en la India. Se adquirieron hidróxido de sodio y ácido sulfúrico de Sigma Aldrich (Missouri, EE. UU.). Se recibió (3-aminopropil) -trimetoxisilano (APTMS) de Merck (Nueva Jersey, EE. UU.). El papel de filtro Whatman se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, EE. UU.). Los anticuerpos IL-3 y anti-IL-3 se recibieron de Santa Cruz Biotechnology (Texas, EE. UU.). Se utilizaron microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM; Hitachi, S-4300 SE, Japón) y microscopía electrónica de transmisión de emisión de campo (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Japón) para analizar el nanomaterial de zeolita-hierro mediante los métodos descritos anteriormente [ 32].

Síntesis de nanomaterial de zeolita-hierro

Los nanomateriales de zeolita-hierro se sintetizaron utilizando hierro, sílice y alúmina extraídos de cenizas volantes. Los siguientes tres pasos principales estuvieron involucrados en este procedimiento:(1) separación de partículas de hierro; (2) extracción de aluminosilicato de sodio; y (3) preparación de nanopartículas de zeolita-hierro mediante el método de síntesis sol-gel.

Separación del hierro de las cenizas volantes

Se mezcló una alícuota de 25 g de cenizas volantes con 500 µl de agua destilada y se agitó durante 30 min utilizando un agitador magnético. Se separaron las partículas de hierro pegadas al agitador magnético, y luego se mezcló 1 g de las partículas separadas con ácido sulfúrico al 25% y se agitó durante 1 ha 50ºC. Luego, la solución que contiene hierro y las partículas de hierro se separaron con papel de filtro Whatman y se utilizaron como base para el óxido de hierro para sintetizar el nanomaterial zeolita-hierro.

Extracción de aluminosilicato de sodio de cenizas volantes

El método de extracción alcalina se utilizó para extraer aluminosilicato de sodio de las cenizas volantes mediante el método de extracción alcalina [33]. Primero, se mezclaron 25 g de ceniza volante separada con hierro con 500 µl de hidróxido de sodio 2 M y se calentó a 100ºC con agitación durante 6 h. Después de enfriar la solución, se separó aluminosilicato de sodio (la solución en la mezcla) con papel de filtro Whatman. La solución filtrada se utilizó como base para sintetizar una zeolita.

Nanomaterial de zeolita-hierro sintetizado por el método Sol-Gel

El aluminosilicato de hierro y sodio extraído se utilizó como base para sintetizar nanomateriales de zeolita-hierro mediante el método sol-gel. En el primer paso, se colocó un vaso de precipitados que contenía 200 ml de aluminosilicato de sodio a pH 12 sobre la placa calefactora con agitación. Luego, la solución se tituló con solución de hierro a pH 1 agregando cantidades gota a gota de solución de hierro hasta alcanzar pH 7. A pH 7, se formó un gel blanco y este gel se agitó continuamente durante la noche para obtener nanopartículas de zeolita-hierro distribuidas uniformemente. . Al día siguiente, el gel se separó por centrifugación (10,000 × g durante 10 min) y luego se lavó con etanol al 25% y agua destilada. El producto final se secó a 100 ° C durante 1 h para obtener un polvo que consistía en nanomateriales de zeolita-hierro. La superficie del nanomaterial de zeolita-hierro se caracterizó por FETEM y FESEM. También se realizó un análisis de rayos X de dispersión de energía (EDX) para identificar los elementos en la zeolita-hierro.

Modificación de amina de zeolita-hierro y funcionalización de la superficie del electrodo de capacitancia

Se revistió con amina la superficie de la zeolita-hierro mediante el agente de acoplamiento de silano APTMS. Para ello, se mezcló 1 g de zeolita-hierro con 1% de KOH durante 10 min, y luego se eliminó el exceso de KOH con agua destilada. Posteriormente, la zeolita-hierro tratada con KOH se mezcló con APTMS al 1% y la mezcla se colocó en un agitador calentado durante la noche. Al día siguiente, el nanomaterial se lavó con etanol y se separó por centrifugación (10,000 × g durante 10 min). Este APTMS-zeolita-hierro se unió a la superficie del electrodo de capacitancia para identificar IL-3. Para esta inmovilización, se dejó caer APTMS-zeolita-hierro sobre el electrodo hidroxilado y se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 h. La unión entre el nanocompuesto de zeolita-óxido de hierro, APTMS y la superficie de detección se debió al acoplamiento de silano con los grupos de óxido generados. En general, el acoplamiento de silano se produce con múltiples brazos disponibles para los grupos de óxido, lo que produce enlaces entre el nanocompuesto de zeolita-óxido de hierro, APTMS y la superficie de detección. Debido a estos múltiples enlaces, se forma una disposición espacial en la superficie de detección. Después de lavar la superficie con etanol seguido de agua, se realizó un proceso de inmovilización de anticuerpos anti-IL-3 para interactuar con IL-3.

Determinación de IL-3 en la superficie del electrodo de capacitancia modificado con anti-IL-3

La superficie descrita anteriormente se formó mediante unión de amina, lo que permite la reacción con los grupos COOH disponibles cuando el anticuerpo se adhiere. Se identificó IL-3 en una superficie de electrodo de capacitancia inmovilizada anti-IL-3. Para ello, se diluyó IL-3 a 100 pg / ml en tampón PBS y se dejó caer sobre una superficie de electrodo modificada con anticuerpo. Después de la inmovilización del anticuerpo, la superficie restante no unida se bloqueó con PEG-COOH (1 mg / ml). Una reacción similar al anticuerpo-APTMS ocurre cuando se une PEG-COOH. El valor de capacitancia se registró antes y después de interactuar con IL-3. Se consideraron diferencias de valor para la unión de IL-3 con su anticuerpo. Además, para calcular el límite de detección, la IL-3 se tituló de 3 a 50 pg / ml y se dejó caer de forma independiente sobre las superficies modificadas con anticuerpos. El otro procedimiento experimental se realizó como se describió anteriormente. La diferencia en el valor de capacitancia para cada concentración de IL-3 se calculó y trazó para calcular la detección de IL-3 por el R ² valor. Cuando la IL-3 se adhiere a la superficie inmovilizada del anticuerpo, habrá una interacción genuina.

Biofouling y determinación selectiva de IL-3 en la superficie del electrodo de capacitancia modificada con zeolita-hierro

Se llevó a cabo un experimento de bioincrustación en tres condiciones de biomoléculas diferentes, incluida la presencia de un anticuerpo no inmunitario o una proteína de control y la ausencia de anticuerpo IL-3. En el primer caso, en lugar de anticuerpo IL-3, se utilizó un anticuerpo no inmunológico; en el segundo experimento, en lugar de IL-3, se usó una proteína de control; y el último experimento se realizó sin anticuerpo IL-3. Los valores de capacitancia se compararon para la interacción específica del anticuerpo IL-3 con IL-3. Se llevó a cabo un experimento selectivo añadiendo IL-3 en una dilución 1:100 de suero humano y añadiéndola gota a gota sobre una superficie de electrodo modificado con anti-IL-3. Los cambios en la capacitancia se registraron para cada concentración de IL-3 para identificar la identificación selectiva de IL-3. La reproducibilidad se confirmó repitiendo los experimentos tres veces (por triplicado) con dispositivos similares hechos a partir de la misma fabricación por lotes. También se determinaron el almacenamiento de por vida y la estabilidad de la superficie inmovilizada con la sonda.

Resultados y discusión

La sepsis es la afección en la que se liberan muchas sustancias químicas en el sistema inmunológico y desencadena una inflamación generalizada con el daño final de los órganos. La Figura 1a muestra una ilustración esquemática de la identificación de IL-3 en una superficie de electrodo de capacitancia modificado con anti-IL-3 para determinar la condición asociada con la sepsis. Se utilizó zeolita-hierro modificada con APTMS para unir el anticuerpo de captura a la superficie del electrodo sensor. Se inmovilizó APTMS en la superficie de la zeolita-hierro en la superficie del electrodo a través de la interacción entre la amina en el nanomaterial y los grupos OH en la superficie del electrodo. La Figura 1b confirma la integridad del electrodo de superficie en el sensor de capacitancia, capturado con un microscopio de alta potencia. El anticuerpo se unió a la superficie a través de COOH y la amina de la zeolita-hierro. La zeolita-hierro ayuda a fijar una mayor cantidad de APTMS en el electrodo sensor, lo que ayuda a capturar más anticuerpos en la superficie del electrodo de capacitancia. Varios estudios han indicado que la inmovilización de la sonda de captura en la superficie de detección juega un papel crucial en la reducción del límite de detección de la molécula diana. En esta investigación, el nanomaterial de zeolita-hierro se utilizó para unir el anticuerpo anti-IL-3 a la superficie del electrodo sensor. Una mayor inmovilización del anticuerpo anti-IL-3 con la orientación adecuada ayuda a alcanzar los límites de detección más bajos de IL-3.

un Ilustración esquemática de la identificación de IL-3 en una superficie de detección de capacitancia modificada con anti-IL-3. Se usó zeolita-hierro modificada con APTMS para unir el anticuerpo de captura y luego interactuó con IL-3. Se utilizó PEG-COOH como agente bloqueante. b Análisis morfológico de la superficie de detección de capacitancia mediante microscopía de alta potencia. c Análisis morfológico de zeolita-hierro por FESEM. Los nanomateriales se formaron con una distribución uniforme y en la dimensión longitudinal. d Análisis EDX. Se encontró la presencia de los elementos principales Si, Al, Fe y O. La figura insertada fue obtenida por FESEM con bajo aumento

Análisis morfológico de nanomaterial de zeolita-hierro por FESEM y FETEM

La Figura 1c, d (recuadro) muestra la imagen morfológica del nanomaterial de zeolita-hierro obtenido de FESEM a diferentes aumentos y el análisis elemental EDX. El nanomaterial de zeolita-hierro obtenido era liso y uniformemente distribuido, con una nanoestructura longitudinal densamente apilada. El tamaño de esta nanoestructura era ~ 30 nm, y la imagen obtenida muestra que el nanocompuesto estaba dispuesto con formas uniformes y bien distribuido a la distancia adecuada. La imagen FETEM también demostró una forma similar a la obtenida por FESEM para los nanocompuestos de zeolita-hierro formados (Fig. 2a, b). El resultado de EDX confirmó la presencia de Fe, Al, Si y O en el nanocompuesto de zeolita-hierro sintetizado (Fig. 2c, d). Se encontró que los porcentajes atómicos elementales principales de Si, Al, Fe y O eran 3,46, 0,78, 2,13 y 24,39%, respectivamente. Este resultado de FESEM y EDX confirma la formación de nanomateriales de zeolita-hierro.

Imágenes FETEM de zeolita-hierro en a Escala de 50 nm y b Escala de 200 nm. El nanomaterial se formó con una distribución uniforme. c Análisis EDX que confirma la presencia de los elementos principales Si, Al, Fe, C y O

Preparación del electrodo sensor para la determinación de IL-3

La inmovilización del anticuerpo anti-IL-3 en el biosensor de capacitancia se confirmó alterando el nivel de capacitancia después de cada inmovilización biomolecular. La Figura 3a muestra los cambios de capacitancia durante el proceso de unión del anticuerpo a la superficie modificada con zeolita-hierro. Como se muestra en la Fig. 3a, la superficie del electrodo de capacitancia unido a KOH muestra un valor de capacitancia de 1,74 × 10 ⁰⁹ nF, y después de la adición gota a gota de APTMS-zeolita-hierro, se aumentó a 2,02 × 10 ⁰⁹ nF. Este aumento de capacitancia confirmó la unión de los nanomateriales al electrodo sensor. Además, al agregar el anticuerpo anti-IL-3, el valor de capacitancia aumentó drásticamente a 3.42 × 10 ⁰⁹ nF. Este incremento mayor se observó debido a la mayor cantidad de inmovilización de anticuerpos en la zeolita-hierro modificada con APTMS. Además, los nanomateriales mostraron una disposición adecuada con un mayor número de APTMS en la superficie del electrodo sensor, lo que finalmente atrajo más anticuerpos. Finalmente, se agregó PEG-COOH con fines de bloqueo, y se encontró que la capacitancia aumentaba a 3.64 × 10 ⁰⁹ nF. El sensor funciona en función de los cambios en la carga superficial y, en última instancia, los cambios en la capacitancia. Los cambios de carga superficial varían con las uniones / interacciones moleculares. Cada molécula lleva cargas diferentes e influye en la capacitancia del sensor. Por lo tanto, se consideró la diferencia en la capacitancia para las mediciones. Se observaron mayores cambios en la capacitancia debido a la mayor ocupación de anticuerpos IL-3 en la superficie del electrodo sensor (Fig. 3b). PEG-COOH ayuda a reducir la unión inespecífica de IL-3 en la superficie del electrodo sensor y elimina los resultados falsos positivos. Varios estudios han demostrado que los polímeros basados ​​en PEG en las superficies de detección mejoran la biocompatibilidad, reducen la relación señal-ruido y proporcionan una orientación adecuada de las biomoléculas inmovilizadas en las superficies de detección, lo que conduce a un límite de detección más bajo del sensor [34,35, 36,37]. Dado que la superficie de APTMS atrae otras biomoléculas electrostáticamente, se utilizó PEG-COOH para cubrir el exceso de superficie de APTMS en el nanomaterial de zeolita-hierro, lo que ayuda a reducir la bioincrustación. Esta superficie modificada anti-IL-3 se utilizó para identificar IL-3.

un Proceso de unión del anticuerpo a la superficie modificada con zeolita-hierro. los valores de capacitancia aumentaron después de cada inmovilización molecular. b Diferencia de capacitancia. La inmovilización del anticuerpo anti-IL-3 mostró un cambio mayor en el valor de capacitancia. Los valores se promediaron utilizando tres lecturas por triplicado. [Zeolita-IO — Zeolita-óxido de hierro]

Determinación y cuantificación de IL-3 en la superficie del anticuerpo anti-IL-3

La IL-3 se cuantificó en una superficie de detección de electrodo de capacitancia modificado con anti-IL-3. Inicialmente, se probó una concentración más alta de IL-3 (100 pg / mL) en la superficie modificada con anticuerpos, y el valor de capacitancia aumentó de 3,74 × 10 ¹⁰ nF a 13 × 10 ¹⁰ nF. Este aumento confirma la interacción de IL-3 con el anticuerpo anti-IL-3 (Fig. 4a). Se realizó un experimento similar con concentraciones de IL-3 de 3 a 50 pg / mL. Como se muestra en la Fig. 4b, los valores de capacitancia aumentaron a 4.56 × 10 ¹⁰ nF, 5,84 × 10 ¹⁰ nF, 6,64 × 10 ¹⁰ nF, 8,39 × 10 ¹⁰ nF y 12 × 10 ¹⁰ nF. Se observó que con concentraciones crecientes de Il-3, los valores de capacitancia aumentaban gradualmente (Fig. 5a). La diferencia en los valores de capacitancia se calculó y representó en una hoja de Excel, y la detección de IL-3 se calculó como 3 pg / mL con un valor R2 de 0.9673 (Fig. 5b). Se encontró una respuesta lineal dependiente de la dosis con diferentes concentraciones de IL-3 (3-100 pg / mL) al interactuar con anti-IL-3. Sin embargo, cuando se tituló en concentraciones adicionales, las muestras se saturaron.

Determinación de IL-3 en la superficie modificada con anti-IL-3. un Identificación de 100 pg / mL de IL-3. Se observaron cambios claros en la capacitancia después de la adición gota a gota de IL-3. La figura insertada muestra el esquema. b Titulación de diferentes concentraciones de IL-3 sobre anticuerpo anti-IL-3. Con todas las concentraciones de IL-3, se observaron cambios de capacitancia

un Valor de capacitancia para cada concentración de IL-3. El aumento de la concentración de IL-3 produjo un aumento gradual en el valor de capacitancia. b Diferencia en el valor de capacitancia para cada concentración de IL-3. Los valores se trazaron en una hoja de Excel y el límite de detección de IL-3 se calculó como 3 pg / mL. Los valores se promediaron utilizando tres lecturas por triplicado

Biofouling / Nonfouling en el electrodo de capacitancia APTES-zeolita-hierro modificado

La bioincrustación es el mayor problema en cualquier tipo de biosensor, lo que conduce a una identificación falsa positiva del objetivo en la superficie de detección. Los agentes de bloqueo como BSA, etanolamina y polímeros a base de PEG son moléculas comunes que reducen la bioincrustación en las superficies de detección. Aquí, se usó PEG-COOH como agente bloqueante, y el efecto de bioincrustación se confirmó en tres experimentos de control diferentes, a saber, sin anticuerpo IL-3, con un anticuerpo no inmune y con una proteína de control (IL-8). Como se muestra en la Fig. 6a, los tres experimentos de control no lograron mejorar el valor de capacitancia, lo que indica la identificación específica de IL-3 sin bioincrustación.

un Detección específica de IL-3. Las moléculas de control no mostraron un aumento en el valor de capacitancia, lo que indica la detección específica de IL-3. b Spiking de IL-3 en suero humano. La adición de suero humano aumentó la capacitancia al aumentar las concentraciones de IL-3. Este resultado confirma la detección selectiva de IL-3. Los valores se promediaron utilizando tres lecturas por triplicado

Aumento de IL-3 en suero humano y estabilidad

Se agregaron diferentes concentraciones de IL-3 en suero humano y se sometieron al mismo procedimiento experimental para identificar IL-3 en situaciones de la vida real. Como se muestra en la Fig. 6b, la IL-3 enriquecida en suero humano produjo claramente valores de capacitancia aumentados con concentraciones mejoradas de IL-3. Este resultado confirma la identificación selectiva de IL-3 por el electrodo de capacitancia modificado anti-IL-3.

Teniendo en cuenta la reproducibilidad, la superficie de detección se comporta bien, con valores de error mínimos. La vida útil del nanomaterial adherido a la superficie de detección fabricado se puede prolongar durante tres meses con un almacenamiento adecuado en un desecador. Sin embargo, después de colocar la sonda, la superficie se mantuvo estable durante 2 semanas y tendió a perder el 19% de la estabilidad, y la pérdida de estabilidad se volvió pronunciada a partir de la 3ª semana. Para probar el alto rendimiento del sensor de corriente, se ha realizado un estudio comparativo con los sensores disponibles actualmente, y los resultados indican que es comparable y se comporta mejor en varios casos (Tabla 1).

Conclusión

La sepsis es potencialmente mortal, implica una reacción inmune abrumadora, es extremadamente peligrosa y afecta a todo el cuerpo. Este estudio demostró la identificación de un biomarcador de sepsis (IL-3) en un electrodo de capacitancia. Se extrajo un nanomaterial de zeolita-hierro de un electrodo de capacitancia modificado con mosca de carbón para aumentar el flujo de corriente al unirse las biomoléculas al electrodo sensor. Se llevó a cabo una modificación con amina para unir el anticuerpo anti-IL-3 a la zeolita-hierro. La detección de IL-3 se realizó en un electrodo modificado con anticuerpo y alcanzó el límite de detección de IL-3 a 3 pg / mL. Los experimentos de control adicionales no pudieron mostrar un aumento en el valor de capacitancia, lo que confirmó la detección específica de IL-3, y los experimentos selectivos con IL-3 enriquecida en suero humano mostraron un claro aumento en la capacitancia. Este método experimental cuantifica los niveles de IL-3 y ayuda a diagnosticar los ataques de sepsis.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin restricciones.

Abreviaturas

IL-3:

Interleucina-3

pág:

Picograma

mL:

Mililitro

µL:

Microlitro

M:

Molar

FESEM:

Microscopio electrónico de transmisión por emisión de campo

FETEM:

Microscopio electrónico de barrido por emisión de campo

EDX:

Rayos X de energía dispersiva

IRA:

Activador de respuesta innato

COOH:

Carboxílico

ADN:

Ácido nucleico desoxirribosa

ARN:

Ácido nucleico ribosa

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

APTMS:

(3-aminopropil) -trimetoxisilano

KOH:

Hidróxido de potasio

PEG:

Polietilenglicol

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