Inmunoensayo de Fluorescencia Rápido y Sensible para CYFRA 21-1 Usando Nanocompuesto de Puntos Cuánticos de Carbono/Óxido de Zinc

Resumen

La detección rápida de cáncer de pulmón en etapas tempranas usando el antígeno fragmento de citoqueratina-19 (CYFRA 21-1) como marcador tumoral en suero humano juega un papel crucial en la supervivencia del paciente y una reacción quirúrgica rápida. Este estudio empleó puntos cuánticos de carbono (PQC) sintetizados de forma verde conjugados con nanocompuesto de óxido de zinc como solución de inmunodetección por fluorescencia altamente sensible para determinación rápida de antígeno CYFRA 21-1 en suero humano. El método consistió en aplicar método hidrotérmico para preparar PQC usando pericarpio de Citrus lemon. Los PQC formados se usaron en la reducción y estabilización de acetato de zinc para sintetizar nanocompuesto PQC-óxido de zinc. Para formar un sistema de inmunodetección tipo sándwich anticuerpo-antígeno-anticuerpo, un antígeno CYFRA 21-1 fue atrapado inmovilizando anticuerpo monoclonal no conjugado BM 19.21 en la superficie del nanocompuesto PQC-óxido de zinc y otro anticuerpo monoclonal KS 19.1 recubierto en superficie de pozo de microplaca. Este sistema presenta fluorescencia ajustable registrada a excitación y emisión λ_ex = 470 nm y λ_em = 520 nm. El sistema de inmunodetección por fluorescencia basado en nanocompuesto PQC-óxido de zinc mostró relación lineal de 0,01–100 ng mL⁻¹ con límite de detección de 0,008 ng mL⁻¹. El sistema propuesto proporciona un enfoque prometedor para diagnóstico rápido de cáncer de pulmón detectando CYFRA 21-1 en suero humano.

Introducción

El cáncer de pulmón es el tipo de cáncer más prevalente y agresivo con grandes retos en tratamiento médico. La recurrencia tumoral y metástasis son las principales causas de muerte en estos pacientes [1]. El marcador tumoral fragmento de citoqueratina 19 (CYFRA 21-1) es un fragmento presente en muchas células epiteliales normales y malignas [2]. Puede estimarse mediante inmunoensayo radiométrico tipo sándwich. Estudios tempranos mostraron que en etapas malignas de cáncer de pulmón, CYFRA 21-1 se libera a circulación sanguínea y se eleva en suero [3]. Por tanto, es posible mejorar la supervivencia mediante detección temprana y reacción quirúrgica rápida [4].

Pocas técnicas se han reportado para detección de CYFRA 21-1: inmunoensayo enzimático [5], inmunoensayo electroquimioluminiscente [6] e inmunoensayo radiométrico [7]. Una estrategia ventajosa para mejorar la sensibilidad de CYFRA 21-1 en suero sigue siendo una preocupación.

En años recientes, la nanotecnología ha logrado avances mayores y crecimiento explosivo en casi todos los campos [8]: sistemas de administración de fármacos [9], análisis farmacéutico [10], reacciones de actividad catalítica [11], aplicaciones medicinales [12], marcadores tumorales [13] e imagen tisular [14].

Actualmente, técnicas de detección basadas en fluorescencia (FL) atraen investigadores por su diseño simple y excelente sensibilidad. Diversos materiales sensores FL se han diseñado y sintetizado para monitorización biológica. Los sistemas FL para determinación biológica son altamente luminiscentes, dispersables en agua, químicamente estables y no tóxicos [15]. Existen diversas sondas de inmunodetección basadas en fluorescencia para detección de biomarcadores. El ensayo competitivo heterogéneo se realiza inmovilizando moléculas capturadoras en superficie e incubando con biomarcadores conjugados a fluoróforo. La competencia entre biomarcadores libres y conjugados por unión a moléculas capturadoras disminuye la intensidad de fluorescencia con la concentración del biomarcador [16]. El ensayo tipo sándwich heterogéneo se basa en incubación de moléculas capturadoras y solución de interés formando complejo con biomarcadores; la intensidad de fluorescencia aumenta con la concentración del biomarcador [17].

En el ensayo competitivo homogéneo, dos fluoróforos diferentes: moléculas capturadoras conjugadas con fluoróforo A y biomarcadores conjugados con fluoróforo B, y la solución aumenta la fluorescencia con la concentración del biomarcador [18]. Sin embargo, esas técnicas mostraron inconvenientes: tiempo experimental largo, falta de detección multiplexada, complejidad y a veces resultados relativamente falsos. Los avances en nanotecnología permitieron desarrollar nuevas sondas de inmunodetección por fluorescencia con características ópticas únicas [19]. Desde el primer uso de puntos cuánticos en detección de biomoléculas, han ganado gran interés por sus características ópticas: alta flexibilidad en selección de longitud de onda, excelentes etiquetas para detección multiplexada, biocompatibilidad y capacidad de dirección [20].

Los puntos cuánticos de carbono (PQC) han demostrado excelentes propiedades químicas, físicas, ópticas, magnéticas y eléctricas. Los PQC pueden sintetizarse mediante técnicas: hidrotérmica, electro-oxidación, ablación láser y microondas [21-24]. Por su baja toxicidad, se consideran candidatos poderosos en sondas fluorescentes. Además, tienen fuerte capacidad de manipulación mediante reacciones químicas controlables en diversas demandas: bioquímicas, fotoquímicas, biosensores, bioimagen, sistemas de administración de fármacos [25-27] e inmunoensayos [28]. Estudios tempranos sobre síntesis de PQC revelaron desventajas: fuentes de carbono caras, químicos tóxicos o procesos no selectivos [29]. Para restringir eso, investigadores empezaron a usar jugos de frutas como fuente de carbono novedosa y barata [30]. Como el uso de jugos no optimiza el uso de recursos, recientemente se obtuvieron PQC fluorescentes de cáscaras de frutas [31]. El uso de cáscaras proporciona ruta prometedora para síntesis verde y ecológica de PQC.

El óxido de zinc (ZnO) es uno de los óxidos metálicos más importantes, potencialmente activo, estable y de baja toxicidad, usado en dispositivos láser ultravioleta, campo biomédico, sensores y fotocatálisis [32-35]. Las nanopartículas de ZnO (NPZnO) muestran propiedades fotoluminiscentes cerca de UV y espectro visible. Esto se atribuye a emisión excitónica por recombinación directa de pares electrón-hueco [36] o emisión verde-amarilla a 520 nm por transición electrónica desde borde de banda de conducción a nivel trampa [37].

Generalmente, los puntos de carbono son nanopartículas cuasi-esféricas amorfas o nanocristalinas con carbono sp² y sp³, grupos basados en O/N y grupos químicos post-modificados. Además, los PQC pueden excitarse con longitudes de onda mayores y cambiar la eficacia de superficies combinadas de pares electrón-hueco y tratar el quenching en sistemas analizados, facilitando determinación cuantitativa de biomoléculas [38]. Pueden decorarse con óxidos metálicos como TiO₂ y ZnO para formar nanocompuesto ópticamente activo explotable en detección de biomarcadores en suero. El ZnO tiene banda ancha (3,37 eV), luminiscente en UV y regiones azul de luz visible por gran densidad de niveles de defecto en banda [39]. La formación de nanocompuesto PQC/ZnO aumenta absorción de luz visible por hibridación de ZnO con PQC, y el corrimiento azul en absorción de luminiscencia a 520 nm se atribuye a recombinación radiativa de vacancias de O ionizadas. Además del aumento de absorción de luz visible, mejor separación electrón-hueco y reducción del tiempo de transferencia electrónica interfacial pueden considerarse para mayor rendimiento óptico del PQC hibridado con NPZnO [40]. Asimismo, el aumento significativo de radicales –OH* generados por nanocompuesto PQC/ZnO en interfase acuosa causa elevación significativa en señales de fluorescencia del sistema analizado. Así, el nanocompuesto combinado PQC/ZnO mejora la modificación de propiedades optoelectrónicas y fotoluminiscentes de superficie ZnO y produce fuerte defecto superficial con fotoluminiscencia ajustable [41]. Además, PQC inmovilizados con anticuerpos de bioreconocimiento formando sistema FL-sensores anticuerpo-antígeno-anticuerpo proporcionan sonda viable con alta especificidad y sensibilidad al analito blanco [42].

Este estudio propone un nuevo sistema simple y ultrasensible de inmunoensayo por fluorescencia basado en PQC decorados con nanocompuesto ZnO para determinar marcador tumoral CYFRA 21-1 en suero humano. Pericarpio de Citrus lemon se usó como precursor de carbono para derivar PQC bajo condiciones hidrotérmicas. Además, sirvió como agente reductor y estabilizador para síntesis de nanocompuesto PQC conjugado ZnO. El nanocompuesto PQC/ZnO preparado se inmovilizó con anticuerpo monoclonal no conjugado BM 19.21 y los pozos de microplaca se recubrieron con otro anticuerpo monoclonal KS 19.1 para formar sistema de inmunodetección tipo sándwich.

Materiales y Métodos

Instrumentos

Los espectros espectrofotométricos de PQC y nanocompuesto PQC/ZnO se registraron con espectrofotómetro Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, Reino Unido). La morfología superficial y distribución de tamaño de partícula de PQC verde y nanocompuesto PQC/ZnO se evaluaron con microscopio electrónico de transmisión (MET) modelo JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Freising, Alemania) y microscopio electrónico de barrido (MEB) modelo JSM-7610F (JEOL, EE. UU.). Los espectros de fluorescencia y transformada de Fourier infrarroja (FT-IR) del sistema de inmunodetección se comprobaron con lector multimodo Biotek Synergy H1 (Biotek, Tokio, Japón) y espectrofotómetro FT-IR Perkin Elmer (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Japón), respectivamente. Espectros Raman, espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) y patrón de difracción de rayos X en polvo (XRD) se midieron con micro-Raman espectrómetro (CRAIC Technologies, CA, EE. UU.), sistema de espectroscopía de rayos X Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd., Manchester, Reino Unido) y difractómetro Siemens D-5000 (Siemens, Erfurt, Alemania), respectivamente.

Químicos y Reactivos

El instrumento SG-2000-10090 (Barsbuttel, Alemania) se usó para obtener agua desionizada usada en todos los experimentos. Anticuerpos monoclonales no conjugados CYFRA 21-1 (mAb) BM 19.21 y KS 19.1 para formar sistema de inmunodetección tipo sándwich se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Frutos de Citrus lemon se suministraron por mercados locales. Tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 se preparó con cloruro sódico, cloruro potásico, hidróxido sódico, fosfato monopotasico y fosfato disódico (BHD Ltd. Co. Poole, Reino Unido). Randox Laboratories (Irlanda del Norte-Reino Unido) proporcionó sueros normales comerciales. Muestras de sangre aleatorias se recolectaron de voluntarios sanos, obteniendo consentimiento informado previo. Sigma-Aldrich (Hamburgo, Alemania) suministró grado puro de clorhidrato de carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS). El comité de ética en investigación de Universidad Rey Saud, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) aprobó el estudio.

Preparación Verde Hidrotérmica de Puntos Cuánticos de Carbono (PQC)

El pericarpio de Citrus lemon se empleó para sintetizar PQC bajo condiciones hidrotérmicas. Aproximadamente 20 g de pericarpio y 200 mL de agua desionizada se transfirieron a matraz redondo y reflujo a 100 °C bajo agitación magnética continua por 6 h. Tras enfriar a temperatura ambiente, el extracto resultante se centrifugó a 3500 rpm y 20 mL de la solución superior extraída se autoclavó y calentó bajo condiciones hidrotérmicas entre 100-200 °C por intervalos de 6-120 h. Tras enfriar, el licor superior representa los PQC (Esquema 1).

Síntesis verde de PQC usando pericarpio de Citrus lemon a solución fluorescente de PQC y esferas de carbono.

Preparación de Nanocompuesto Puntos Cuánticos de Carbono-Óxido de Zinc

Para preparar nanocompuesto PQC/ZnO, se realizó reacción simple de reducción química usando PQC como agente reductor y estabilizador. El nanocompuesto se obtuvo añadiendo 20 mL de PQC a 50 mL de acetato de zinc 5,0 × 10⁻² mol L⁻¹ a 60 °C bajo agitación continua 10 min. Cuando el color cambió de amarillento a cremoso, la mezcla reposó 30 min para completar la reducción y se almacenó a 4 °C. Para asegurar estabilidad y comprobar aglomeración, se empleó espectrometría UV-Vis registrando absorbancia a 390 nm durante 20 días. Los resultados revelaron alta estabilidad y ningún cambio significativo en absorbancia.

Caracterización del Nanocompuesto PQC-Óxido de Zinc

Para confirmar la formación del nanocompuesto PQC/ZnO, se usaron técnicas microscópicas y espectroscópicas. La uniformidad y morfología superficial de PQC y nanocompuesto se estudiaron con MET de alta resolución (METAR) y MEB. Los espectros ópticos se estudiaron con UV-Vis, FT-IR, XPS y espectroscopía Raman. La estructura cristalina de PQC preparados se evaluó con patrón XRD.

Proceso de Inmovilización

Un anticuerpo monoclonal no conjugado BM 19.21 se inmovilizó en la superficie del nanocompuesto PQC/ZnO sintetizado mediante enlace amida peptídico simple entre grupos amina y carboxílicos activos. El proceso se realizó añadiendo 5,0 mL de cada NHS y EDC equimolares 3,0 × 10⁻³ mol L⁻¹ a 5,0 mL de solución de nanocompuesto PQC/ZnO bajo agitación continua 1 h. Aproximadamente 5 mg de anticuerpo monoclonal no conjugado BM 19.21 se disolvieron en 1,0 mL de PBS 0,01 mol L⁻¹ (pH 7,4) y se añadieron a la solución sensora. El anticuerpo se inmovilizó tras incubación a 37 °C por 12 h (Esquema 2). Espectrofotometría confirmó el éxito de la inmovilización.

Inmovilización de anticuerpo monoclonal BM 19.21 en superficie de nanocompuesto PQC/ZnO.

Principio General del Método de Inmunoensayo

Una reacción tipo sándwich anticuerpo-antígeno-anticuerpo se obtuvo usando otro anticuerpo monoclonal KS 19.1 recubriendo superficie de pozos de microplaca (Esquema 3). Bajo condiciones óptimas de inmunoensayo, la concentración de antígeno CYFRA 21-1 se determinó como función de aumento de intensidad de señal de fluorescencia.

Esquema ilustrado de reacción de inmunodetección tipo sándwich anticuerpo-antígeno-anticuerpo.

Procedimiento de Inmunodetección

La recolección de sueros humanos fue provista por voluntarios aleatorios. Se aseguró coagulación completa antes de centrifugación a temperatura ambiente y almacenamiento a 4 °C. La técnica de adición (spiking) se usó para preparar muestras estándar con antígeno CYFRA 21-1 en rango 0,01–500 ng mL⁻¹. Aprox. 50 μL de muestras adicionadas se dispensaron en pozos y mezclaron con 50 μL de anticuerpo monoclonal KS 19.1 recién diluido usando PBS pH 7,4 por 30 min y luego incubaron sin tapar la placa 1 h a 37 °C. El contenido de los pozos se sacudió bruscamente y se enjuagaron tres veces con agua desionizada (300 μL por pozo). Aprox. 50 μL de solución de nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21 se añadieron a cada pozo, mezclaron suavemente e incubaron 30 min a 37 °C. Las muestras preparadas se sometieron a análisis de fluorescencia con lector de microplaca para registrar intensidades.

Resultados y Discusión

Evaluación Morfológica de Puntos Cuánticos de Carbono y su Nanocompuesto

Se usó microscopio electrónico de transmisión (MET) para caracterizar morfología superficial y distribución de PQC en muestras. Para examen bajo MET, aprox. 4 μL de suspensión de PQC preparada se depositó en rejilla de carbono del MET. En imagen METAR (Fig. 1a), los puntos negros uniformes con espaciado de red (0,36 nm) indicaron formación de PQC. Se grafico distribución de tamaño de partícula: tamaño promedio 1,5 ± 0,5 a 5,0 ± 0,5 nm (Fig. 1b). El tamaño obtenido prueba que los PQC formados son nanomateriales de tamaño cuántico. Además, se realizó dispersión dinámica de luz (DDL), hallando tamaño promedio ~20 ± 0,2 nm. Se observó diferencia entre ambas mediciones. Estudios previos revelaron que METAR no muestra estructura de red cristalina de PQC formados a mayores aumentos por su naturaleza amorfa [43]. Similarmente, el precursor natural de carbono es pericarpio de Citrus lemon y los PQC derivados también exhiben naturaleza amorfa. Por tanto, la diferencia en mediciones de tamaño puede atribuirse a aglomeración de PQC formados, naturaleza amorfa de puntos de carbono formados, mecanismo involucrado en cada experimento y dinámica de hidratación de partículas.

a Imagen METAR de PQC con diámetro 5 nm y b gráfico de distribución de tamaño de PQC basado en MET.

El nanocompuesto PQC/ZnO preparado se investigó con MET y MEB. En imagen MET (Fig. 2a), la presencia de partículas hexagonales adheridas a PQC indicó formación de nanocompuesto PQC/ZnO. En MEB, la muestra se recubrió con oro para evitar absorción de electrones y acumulación de carga. Voltaje acelerado aplicado 15 kV a aumento ×30.000 (Fig. 2b).

a y b representan imágenes de microscopio electrónico de transmisión y barrido de nanocompuesto PQC/ZnO.

Se estudiaron espectros UV-Vis y fluorescencia de PQC, mostrando dos picos significativos a 224 y 280 nm atribuidos a transiciones p~p* y n~P* de C=C y C=O, respectivamente. El espectro de fluorescencia de PQC mostró dos señales en máximo λ_ex = 360 nm y λ_em = 453 nm (Fig. 3a, b). Además, se estudió espectro UV-Vis de nanocompuesto PQC/ZnO. Se observó pico de absorción significativo a 370 nm con corrimiento azul-verde (Fig. 4a). Se estudiaron propiedades de fotoluminiscencia (FL) de nanocompuesto PQC/ZnO. El tamaño y defectos superficiales de PQC afectan sus propiedades de luminiscencia. Como función de longitud de onda de excitación, la emisión FL de PQC varió [38]. También NPZnO exhibieron emisión relacionada a defectos en región de absorción visible azul-verde [41]. Por tanto, NPZnO decoradas con PQC produjeron excelente nanocompuesto para emisión FL. Como se muestra en Fig. 4b, el espectro FL de PQC/ZnO exhibió corrimiento azul con pico significativo a 520 nm tras excitación a 470 nm. El corrimiento observado se atribuye al solapamiento entre bandas de energía de PQC y NPZnO. El corrimiento azul mostrado estaba en nivel de emisión de defecto 2,1 eV.

Espectros espectroscópicos de PQC (a) espectro UV-Vis a 224 y 280 nm y (b) espectro de fluorescencia de PQC a λ_ex = 360 y λ_em = 452 nm.

Espectros espectroscópicos de PQC/NPZnO a espectro UV-Vis con pico de absorción a 370 nm y b espectro de fotoluminiscencia de PQC/NPZnO a λ_ex = 470 y λ_em = 520 nm.

Para confirmar formación de nanocompuesto PQC/ZnO y nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO con anticuerpo monoclonal no conjugado BM 19.21, se realizó estudio comparativo FT-IR. El espectro FT-IR de PQC reveló picos distintos correspondientes a grupos funcionales: picos de estiramiento vibracional a 3462 cm⁻¹ y 2932 cm⁻¹ para grupos C–OH y C–H, respectivamente. Tres bandas de absorción vibracional a 1749 cm⁻¹, 1375 cm⁻¹ y 1246 cm⁻¹ correspondientes a C=O, C–N y C–O–C, respectivamente (Fig. 5a). Un nuevo pico a 436 cm⁻¹ correspondiente a banda de estiramiento de Zn–O se observó. Las propiedades reductoras y estabilizadoras de PQC provinieron de grupos –OH y COOH en su superficie. Estos grupos actúan como donantes de electrones y tienen fuerte afinidad hacia formación de nanocompuesto PQC/ZnO. Por tanto, PQC redujeron y estabilizaron el nanocompuesto formado (Fig. 5b). Como se muestra en Fig. 5c, se formaron dos nuevos picos a 3254 cm⁻¹ y 1675 cm⁻¹, atribuidos a estiramiento vibracional de N–H y C=O, confirmando inmovilización de PQC/ZnO-BM 19.21 vía enlaces peptídicos.

Espectros FT-IR de a PQC, b nanocompuesto PQC/ZnO, y c nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21.

Se examinaron espectros de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) de PQC sintetizados verde. El espectro obtenido (Fig. 6a) mostró grupos funcionales a 288 y 286 eV para C=O y COOH, respectivamente. Dos picos significativos de energía de enlace a 1044,4 y 1021,5 eV para Zn 2p_1/2 y Zn 2p_3/2 (Fig. 6b). Además, espectro XPS de alta resolución de nanocompuesto PQC/ZnO confirmó picos de energía de enlace a 560, 385, 350, 246 y 200 eV para O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p y Zn 3d (Fig. 6c). Todos los datos prueban presencia de ZnO en superficie de PQC formando nanocompuesto PQC/ZnO.

Espectros XPS de a PQC, b ZnO, y c nanocompuesto PQC/ZnO.

Se realizó estudio comparativo entre patrones XRD de PQC y nanocompuesto PQC/ZnO. Se notó pico ancho a 20° (2θ) para puntos de carbono en patrón XRD de PQC (Fig. 7a). Sin embargo, picos agudos diferentes se reconocieron a 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° y 80° (2θ) para Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) y (202), respectivamente. Los picos observados reflejaron distribución de ZnO en superficie de PQC formando nanocompuesto PQC/ZnO (Fig. 7b).

Patrón de difracción de rayos X de a PQC y b nanocompuesto PQC/ZnO.

Se estudiaron espectros Raman de PQC preparados, PQC/ZnO y nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21. Las señales Raman se usan comúnmente para estudiar estructura cristalina y sus defectos. Fig. 8a mostró dos bandas D y G típicas a 1300 y 1520 cm⁻¹ para nanopartículas de carbono. Como se reporta, banda D representa defectos sp³, banda G es vibración planar de carbonos sp² enlazados [44]. Ratio I_D/I_G calculado para PQC preparados fue 1,02 ± 0,03. Nuevos picos agudos a 440 y 520 cm⁻¹ para NPZnO y picos típicos de PQC a 1364 y 1595 cm⁻¹. Ratio I_D/I_G fue 1,2 ± 0,01 indicando formación de nanocompuesto PQC/ZnO (Fig. 8b). Espectro Raman de nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21 mostró numerosos picos reconocibles como signos confirmatorios de estructuras secundaria y terciaria. Picos en región 1007–1128 cm⁻¹ asignados a estructura secundaria mayor del anticuerpo monoclonal. Picos Raman en región 550–682 cm⁻¹ asignados a conformaciones disulfuro, mientras 867–797 cm⁻¹ a estado de enlace de hidrógeno de residuos tirosina. Desplazamiento significativo de pico Raman a 1630 cm⁻¹ atribuido a presencia de estructura terciaria del anticuerpo inmovilizado [45] (Fig. 8c). Ratio I_D/I_G aumentó a 1,4 ± 0,04 revelando mejor estructura cristalina por formación de nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21.

Desplazamiento espectros Raman de a PQC, b nanocompuesto PQC/ZnO, y c nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21.

Optimización de Condiciones de Inmunodetección por Fluorescencia

La selección y optimización de condiciones de inmunodetección por fluorescencia se realizó estudiando diversos parámetros. Generalmente, cantidad de nanocompuesto inmovilizado, pH y concentración de tampón usado, tiempo de incubación entre analito blanco en muestras de suero y reactivos de inmunodetección deben investigarse y optimizarse. Para seleccionar cantidad adecuada de nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21, se probaron cantidades 10–100 μL. La intensidad de fluorescencia máxima se observó añadiendo 50 μL de nanocompuesto inmovilizado (Fig. 9a). Se prepararon y probaron cuatro soluciones PBS pH 7,2–7,5 como función de intensidad de fluorescencia. Se observó ligero cambio en señal de fluorescencia al variar pH. A pH 7,2 y 7,3, la señal disminuyó por inestabilidad química del nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO. La señal aumentó a pH 7,4–7,5 por excelente interacción entre moléculas monoclonales en superficie del nanocompuesto (Fig. 9b). Se halló que 7,4 es pH más adecuado para mantener actividad del antígeno blanco que puede descomponerse al aumentar pH >7,5. Por tanto, pH 7,4 se seleccionó para estudios posteriores.

Optimización de determinación por fluorescencia de antígeno CYFRA 21-1 a λ_ex = 470 y λ_em = 520 nm. a Efecto de nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21 añadido, b efecto de PBS pH 7,3–7,5, c efecto de concentración de tampón usando PBS 0,01–0,05 mol L⁻¹, d efecto de tiempo de inmunorreacción 10–60 min.

La influencia de concentración de PBS en intensidad de fluorescencia se estimó usando rango 0,01–0,05 mol L⁻¹. La máxima intensidad se obtuvo con concentración 0,01 mol L⁻¹. A concentraciones mayores, el nanocompuesto inmovilizado PQC/ZnO-BM 19.21 se agregó y la inestabilidad de la solución inmunosensora causó disminución de intensidad (Fig. 9c). Para calcular tiempo de inmunorreacción, se repitió procedimiento analítico con tiempos 10–60 min. La máxima intensidad se observó manteniendo reacción entre antígeno probado y solución inmunosensora al menos 30 min (Fig. 9d).

Cuantificación Analítica

Bajo condiciones optimizadas, el método de inmunoensayo se realizó con 12 muestras de suero con antígeno CYFRA 21-1 en rango 0,01–500 ng mL¹. Los resultados se graficaron para construir curva de calibración lineal en rango 0,01–100 ng mL⁻¹ con límite de detección 0,008 ng mL⁻¹. La ecuación calculada: I_F = 7,933C + 181,24 (r² = 0,9992). Tras seis repeticiones, desviación estándar relativa (%RSD) fue 1,3%. Resultados aceptables revelaron alta sensibilidad del método de inmunodetección por fluorescencia para cuantificación de antígeno CYFRA 21-1 en suero.

Idoneidad del Sistema

La idoneidad del sistema se investigó mediante estudio comparativo entre el método de inmunodetección propuesto con PQC/ZnO-BM 19.21 inmovilizado y métodos previos. El sistema de fluorescencia propuesto proporcionó ventajas significativas: simplicidad, ecológico, fácil detección del analito blanco en suero. Resultados mostraron alta sensibilidad con amplio rango lineal 0,01–100 ng mL¹ y menor límite de detección 0,008 ng mL¹ (Tabla 1).

Exactitud, Precisión y Selectividad del Sistema de Inmunodetección Inmovilizado

Para asegurar exactitud del sistema de inmunodetección por fluorescencia con PQC/ZnO-BM 19.21 inmovilizado para determinación de antígeno CYFRA 21-1 en suero, se probaron 12 muestras. Los datos se compararon con técnica previa [6], basada en ensayo electroquimioluminiscente usando complejo tris(2,2'-bipiridil)rutenio(II) excitado por tripropilamina. Resultados aceptables se indican en Tabla 2. Ensayos intra-día e inter-día investigaron precisión. Se usó muestra de suero con 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1. Desviaciones estándar relativas medias fueron 1,1% y 1,3% para ensayos intra e inter-día, revelando alta precisión. Además, selectividad del método hacia determinación de CYFRA 21-1 se evaluó usando especies interferentes posibles: aminoácidos (cisteína, lisina, serina, tirosina, glicina), cationes (K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺) y otros biomarcadores (CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, CA 125). Prueba bajo condiciones óptimas con suero humano conteniendo 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1 en presencia de 10 ng mL⁻¹ especies coexistentes. Datos calculados como error porcentual relativo (Er%) no excedieron ±5% para cada especie interferente (Tabla 3). Valores de tolerancia calculados (F-F⁰/F⁰) estuvieron dentro límites de tolerancia (<5%). Por tanto, el sistema de inmunodetección por fluorescencia con PQC/ZnO-BM 19.21 inmovilizado mostró alta selectividad hacia determinación de CYFRA 21-1 en suero humano.

Análisis de Muestras Reales

En especímenes humanos reales, el sistema de inmunodetección por fluorescencia basado en solución inmovilizada PQC/ZnO-BM 19.21 se explotó para detectar y cuantificar recuperaciones porcentuales (%) del marcador tumoral antígeno CYFRA 21-1. Como se mencionó en procedimiento de inmunodetección, el sistema determinó antígeno CYFRA 21-1 hallando relación entre intensidad de fluorescencia y concentración en suero. Ciertas cantidades de antígeno blanco (0,5, 1,0 y 2,0 ng mL⁻¹) se añadieron a muestras estimadas, evaluando aumento de intensidades de señal. Tras seis determinaciones, se calcularon desviaciones estándar relativas porcentuales (%RSD). Recuperaciones porcentuales oscilaron 96,7 ± 0,7 a 100,0 ± 1,3%. %RSD calculado 0,2–1,4%. Muestras de suero analizadas con método previo [6] dieron recuperaciones 96,1 ± 1,6 a 100,0 ± 0,4% con %RSD 0,3–1,7%. Para asegurar idoneidad de la técnica de inmunodetección por fluorescencia con solución inmovilizada PQC/ZnO-BM 19.21, se realizó estudio estadístico comparativo usando prueba t de Student y prueba F [46] entre resultados presentes y los de métodos previos (Tabla 4). Valores t y F oscilaron 0,354–2,181 (2,228)* y 1,16–4,0 (5,05)* respecto a valores tabulados P = 0,05. Resultados revelaron buen acuerdo entre método propuesto y procedimientos publicados. Además, todas las cantidades detectadas de CYFRA 21-1 en suero estuvieron dentro límite normal indicando ningún cáncer de pulmón diagnosticado en sueros investigados.

Conclusión

El estudio se centró en preparación de PQC síntesis verde conjugados con nanocompuesto ZnO usando Citrus lemon como precursor. El nanocompuesto PQC/ZnO se empleó para formar nuevo sistema de inmunodetección por fluorescencia inmovilizando anticuerpo monoclonal BM 19.21 mediante enlaces peptídicos simples. El sistema de fluorescencia altamente sensible se usó para determinar marcador tumoral de cáncer de pulmón (CYFRA 21-1) en suero humano. Antígeno CYFRA 21-1 se determinó vía reacción tipo sándwich anticuerpo-antígeno-anticuerpo usando otro anticuerpo monoclonal KS 19.1 recubriendo pozos de microplaca. Las características únicas y alta sensibilidad del sistema facilitan determinación del marcador tumoral blanco con alta estabilidad y reproducibilidad. Se realizó estudio comparativo y resultados confirmaron idoneidad y alta sensibilidad del sistema de inmunodetección propuesto, acordes con técnica convencional previa.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Los únicos datos de resultado de este estudio se presentaron en el manuscrito.

Abreviaturas

%RSD:

Desviación estándar relativa porcentual

BM 19–21:

Anticuerpo monoclonal específico

PQC:

Puntos cuánticos de carbono

PQC/ZnO:

Puntos cuánticos de carbono/óxido de zinc

CYFRA-21-1:

Fragmento de citoqueratina-19

DDL:

Dispersión dinámica de luz

EDC:

Clorhidrato de carbodiimida

eV:

Electronvoltio

FT-IR:

Transformada de Fourier infrarroja

METAR:

Microscopio electrónico de transmisión de alta resolución

KS 19-1:

Anticuerpo monoclonal específico de citoqueratina 19

Soc. Ltda.:

Sociedad limitada

mAb:

Anticuerpo monoclonal

NHS:

N-hidroxisuccinimida

P:

Grado de confianza

PBS:

Tampón fosfato salino

MEB:

Microscopio electrónico de barrido

MET:

Microscopio electrónico de transmisión

Reino Unido:

Reino Unido

EE. UU.:

Estados Unidos de América

UV-Vis:

Ultravioleta-visible

XPS:

Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X

XRD:

Difracción de rayos X en polvo

ZnO:

Óxido de zinc

θ:

Grados theta

λ_max:

Longitud de onda