Evaluación de la eficiencia de la absorción celular según múltiples inhibidores de nanopartículas Core-Shell de Fe3O4-Au:posibilidad de controlar la endocitosis específica en células de cáncer colorrectal

Resumen

Magnetita (Fe ₃ O ₄ ) -oro (Au) nanopartículas de núcleo-capa (NP) tienen propiedades ópticas y magnéticas únicas. Cuando se combinan con restos biológicos, estos NP pueden ofrecer nuevas estrategias para aplicaciones biomédicas, como la administración de fármacos y la focalización del cáncer. A continuación, presentamos un método eficaz para la captación celular controlable de sistemas NP de núcleo-capa magnéticos combinados con restos biológicos. Se ha confirmado bioquímicamente que la vimentina, que es la proteína estructural, afecta de forma potente a la fagocitosis. Además, la vimentina afecta la internalización de materiales exógenos en las células, incluso aunque esté sometida a múltiples inhibiciones de restos biológicos. En este estudio, demostramos el rendimiento de internalización celular de Fe ₃ O ₄ -Au NP core-shell con modificación de la superficie usando una combinación de restos biológicos. La fotofluorescencia de los NP marcados con vimentina no se vio afectada bajo múltiples pruebas de inhibición, lo que indica que los NP fueron mínimamente influenciados por nistatina, dynasore, citocalasina D e incluso el anticuerpo Muc1 (Ab). En consecuencia, este resultado indica que Muc1 Ab puede dirigirse a moléculas específicas y puede controlar la endocitosis específica. Además, mostramos la posibilidad de controlar endocitosis específica en células de cáncer colorrectal.

Introducción

Los nanomateriales han abierto nuevas vías para el diagnóstico clínico y la terapéutica. Especialmente, las nanopartículas (NP) son una de las herramientas más importantes y se han utilizado en aplicaciones como biosensores [1, 2], diagnósticos [3, 4] y sistemas de administración de fármacos dirigidos [5, 6]. Para aplicaciones biomédicas, los NP generalmente se componen de materiales orgánicos que rodean la superficie de los materiales centrales [7,8,9]. Los materiales del núcleo, que consisten en materiales magnéticos, materiales semiconductores u otros tipos de materiales, tienen propiedades fisicoquímicas útiles, y la superficie orgánica externa proporciona estabilidad química y funcionalidad a las NP. Para aplicaciones en sistemas de focalización biológica, no solo las propiedades fisicoquímicas sino también la superficie orgánica externa, que está biofuncionalizada para la focalización, son parámetros críticos. Ejemplos de restos de direccionamiento para funcionalización son anticuerpos o ligandos que son específicos para un objetivo. Dependiendo de los materiales biofuncionalizados en la superficie externa, se determinan los mecanismos de endocitosis de las NP. El mecanismo que permite que las NP entren en las células ha sido objeto de muchos trabajos de investigación recientes debido a su importancia en las aplicaciones de nanomedicina [10,11,12,13,14,15].

En particular, los NP magnéticos se han utilizado ampliamente en muchas aplicaciones específicas de orientación de sitios, incluida la clasificación celular [16, 17], la resonancia magnética [18], el aislamiento del ADN [19], la administración de fármacos [20], el tratamiento de la hipertermia [21] y el cáncer focalización [22]. Entre varios NP magnéticos, los nanocristales de magnetita se han utilizado más ampliamente en aplicaciones biomédicas debido a su biocompatibilidad y estabilidad química. Aunque se han dedicado muchos esfuerzos a las aplicaciones biomédicas que utilizan NP magnéticas, todavía existen algunos problemas críticos como la buena dispersabilidad en solución acuosa, la funcionalidad y la biocompatibilidad. Para superar estos problemas, muchos estudios se han centrado en la modificación de la superficie de las NP utilizando una variedad de grupos funcionales (por ejemplo, grupos carboxilo y amina) [23]. Sin embargo, la unión de los grupos funcionales a la superficie de las NP de magnetita es un proceso laborioso y que requiere mucho tiempo. Dado este hecho, las NP magnéticas recubiertas de Au de tipo núcleo-caparazón son atractivas porque la superficie de Au puede unirse fácilmente a biomoléculas y materiales orgánicos.

Especialmente, las propiedades magnéticas de los NP con núcleo magnético y capa de Au permiten la separación magnética, aumentan la resolución en las imágenes de resonancia magnética y se pueden aplicar a la terapia de hipertermia. Además, las propiedades superiores de unión química del oro son ventajosas para la construcción de sistemas de administración mediados por receptores para el cáncer específico [24, 25, 26].

Durante las últimas décadas, muchos investigadores han informado sobre sistemas de administración mediados por receptores para el cáncer dirigido [27,28,29].

El direccionamiento de células cancerosas mediado por receptores es una forma de direccionamiento activo. La elección del objetivo es la clave para un objetivo activo eficaz, y los objetivos deben sobreexpresarse en la membrana extracelular. La mayoría de los investigadores han utilizado anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cáncer, y el efecto terapéutico podría aumentar considerablemente cuando las terapias con anticuerpos monoclonales se combinan con la quimioterapia convencional [30]. A pesar del éxito de la terapia con anticuerpos monoclonales, los anticuerpos monoclonales presentan varias limitaciones en el direccionamiento del cáncer. Su gran tamaño (aproximadamente 150 kDa) es un obstáculo importante para la penetración del tumor [31, 32], y su baja estabilidad y baja solubilidad dificultan su uso generalizado [33]. La dirección no homogénea de su unión en el portador de destino también se considera un obstáculo para la unión inespecífica. Para producir anticuerpos con una penetración tumoral mejorada, se ha diseñado y probado una amplia gama de formatos de anticuerpos [34]. Aparte de los anticuerpos clásicos, existe un formato de anticuerpo único en especies de la familia Camelidae. Los llamados anticuerpos de cadena pesada (HCAb) se encuentran naturalmente en la sangre periférica y la leche de estas especies. Los fragmentos de unión a antígeno de tales HCAb están compuestos por un solo dominio, el dominio variable de cadena pesada (VH) del HCAb de camélido (VHH). El VHH, obtenido de forma recombinante después de la clonación y expresión en bacterias u hongos, se denomina nanocuerpo. Tiene un peso molecular de 11 a 15 kDa y es el anticuerpo más pequeño entre todos los mAb [35,36,37]. No solo su pequeño tamaño los hace potencialmente adecuados como sondas de orientación contra antígenos en ubicaciones aisladas, sino que también su extremo terminal fácilmente modificable es atractivo para su aplicación en la orientación del cáncer.

La entrega eficiente de NP con una adecuada focalización e internalización de células también son factores importantes en el sistema de entrega. Se ha informado que la vimentina tiene un papel importante como componente de la unión de patógenos y las vías de entrada intracelular. El silenciamiento de la expresión del gen de la vimentina inhibe la fagocitosis [38], mientras que la vimentina escindida es una señal que aumenta significativamente la fagocitosis [39]. Por lo tanto, neutralizar la resistencia a la fagocitosis celular causada por la vimentina en la superficie celular es importante para la administración eficiente de nanopartículas.

En este estudio, investigamos las vías de endocitosis del Fe ₃ etiquetado con nanocuerpos O ₄ -Ps NP core-shell de Au modificadas con espaciadores PEG (polietilenglicol) de diferentes longitudes. La vimentina, que se sabe que tiene un fuerte efecto sobre la fagocitosis mediante experimentos bioquímicos [39], se comparó como control y se confirmó que actúa eficazmente sobre la internalización celular de las NP. Además, la Muc1, que es una glicoproteína de la superficie celular y sobreexpresada en varios tipos de cáncer, como el de páncreas, mama, pulmón y estómago, se utiliza como biomarcador dirigido al cáncer. Confirmamos la internalización eficiente de Fe ₃ O ₄ NP core-shell de Au y los métodos de orientación controlable a las células cancerosas a través de la vía de endocitosis mediada por el receptor Muc1 en las células del colon.

Materiales y métodos

Materiales

Se obtuvo acetato de oro (III) (Au (OOCCH3) 3, 99,9%) de Alfa Aesar. Otros productos químicos, incluido el acetilacetonato de hierro (III) (Fe (acac) ₃ , 99,9%), 1,2-hexadecanodiol (C14H29CH (OH) CH2 (OH), 90%), poli (etilenglicol) -bloque-poli (propilenglicol) -bloque-poli (etilenglicol) (PEG-PPG- PEG) y octiléter (C8H17OC8H17, 99%) se adquirieron de Sigma-Aldrich y se usaron tal como se recibieron. El poli (etilenglicol) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K y 10K) del éster alfa-piridil-2-disulfuro-omega-carboxisuccinimidílico se adquirió de Nanocs. Se adquirieron de Sigma-Aldrich bicarbonato de sodio, WST-1, clorpromazina, nistatina, citocalasina D, dynasore, brefeldina A (BFA), monensina y azul de tripán. Cy3 y Cy7.5 se adquirieron de Lumiprobe. Anti-Muc1 Ab se adquirió de Abcam Inc. (Cambridge, MA). La solución salina tamponada con fosfato (PBS), el medio Eagle modificado de Dulbecco y el suero bovino fetal se adquirieron de Invitrogen Corp.

Síntesis de Fe ₃ O ₄ -Au Core-Shell NP

El Fe ₃ O ₄ -Las NP core-shell de Au se sintetizaron mediante un método de nanoemulsión. El proceso de síntesis de las NP núcleo-capa consta de dos pasos:(1) formación del Fe ₃ O ₄ NP de núcleo y (2) recubrimiento de la cáscara de Au en los NP magnéticos. En el primer paso, el Fe ₃ O ₄ Los NP se prepararon a partir de una solución mixta de Fe (acac) ₃ (0,1766 go 0,5 mmol), 1,2-hexadecandiol (0,6468 go 2,5 mmol) y copolímero de bloque (poli (óxido de etileno) -poli (óxido de propileno) -poli (óxido de etileno); PEO-PPO-PEO) ( 0,4 ~ 1,2 g) en octiléter. La solución mixta se calentó a 300 ° C para reducir el precursor de Fe. La formación de Fe ₃ O ₄ Los NP del núcleo se completaron enfriando la solución calentada. El segundo proceso se llevó a cabo de forma continua sin ningún proceso de purificación después de la formación del núcleo magnético. Se añadieron precursores de Au (0,2338 go 0,62 mmol) y 1,2-hexadecandiol (0,88 g, 3,4 mmol) a la emulsión que consta de Fe ₃ O ₄ NP, y luego la solución mezclada se calentó a 230 ° C. Después de enfriar a temperatura ambiente, la emulsión se precipitó mediante centrifugación y se separaron las NP de núcleo-capa.

Construcción del vector de expresión recombinante Anti-Muc1-VHH 5-24 K10

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó utilizando el cebador directo 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3 'y el cebador inverso 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'. El producto de la PCR se digirió con EcoRI y XhoI y se purificó en gel usando el kit de extracción rápida en gel QIA (QIAGEN, Valencia, CA, EE. UU.). El producto de PCR purificado se clonó en pET-23a digerido con EcoRI / XhoI (Novagen, Darmstadt, Alemania). Escherichia coli ( E. coli ) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwán) se transformó con la construcción resultante mediante choque térmico y se seleccionó en placas de agar LB que contenían 100 μg / ml de ampicilina (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos).

Expresión y purificación de proteína recombinante

Para expresar y purificar la proteína recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10, E. coli Las cepas BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwán) se transformaron con pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. A continuación, las bacterias se cultivaron en caldo LB que contenía ampicilina (100 µg / ml). La expresión de proteínas se indujo mediante isopropil β-d-tiogalactósido (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos) a una concentración final de 0,4 mM durante 5 ha 37ºC. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en tampón de lisis (NaH ₂ 50 mM PO ₄ , pH 8,0; NaCl 300 mM) seguido de sonicación en hielo durante 10 min. Los lisados sonicados se centrifugaron a 20.000 x g durante 20 min a 4ºC y se sometió a Ni-NTA His · Bind Resin (Peptron, Daejeon, Corea). Las proteínas marcadas con His que estaban unidas a la resina se eluyeron con tampón de elución (NaH ₂ 50 mM PO ₄ , pH 8,0; NaCl 300 mM; Imidazol 150 mM). La proteína purificada se separó en gel SDS-PAGE al 15%.

Modificación de Core-Shell Fe ₃ O ₄ -Au NP

Se disolvió OPSS-PEG-NHS en varias longitudes (2, 5 y 10 K) en bicarbonato de sodio 0,1 M para la activación de los grupos tiol. Se agregó OPSS-PEG-NHS activado a la solución de Fe ₃ de núcleo-capa sintetizada O ₄ -Au NPs y se agitó durante 12 ha 4 ° C. Los grupos tiol de OPSS-PEG-NHS activado se unieron covalentemente a la superficie de Au de las NP de núcleo-capa. Luego, se agregó una solución de nanocuerpos (0.25 mg / mL) al Fe ₃ PEGilado O ₄ -Au NP core-shell durante 12 ha 4 ° C. Los grupos amina de las diez colas de lisina (K) en el terminal se unieron covalentemente a los grupos NHS de OPSS-PEG-NHS a pH 8,3. Cy3 y Cy7.5 se etiquetaron en los grupos de amina residuales del nanocuerpo.

Curva de internalización

Las células CT26 se sembraron a 5 × 10 ³ células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo transparente y se incuban en 250 μL de medio de cultivo durante 24 ha 37 ° C en CO ₂ al 5% en la oscuridad. El medio se retiró y 250 μl de medio de cultivo fresco que contenía 50 μg / ml de Fe ₃ marcado con Cy3 O ₄ Se añadieron a cada pocillo NP-Au y NP marcadas con PEG-Cy3 o PEG-nanobody-Cy3. Las células se incubaron adicionalmente durante diferentes períodos (0, 10, 20, 30, 60, 120 y 360 min). A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar las NP libres y se midió la fluorescencia de cada pocillo con azul tripán como extintor de fluorescencia impermeable a la membrana mediante SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, EE. UU.). Cada experimento se llevó a cabo con cantidades iguales de NP (50 μg / mL) y se repitió tres veces [40].

Prueba de inhibición

Las células CT26 se sembraron a 5 × 10 ³ células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo transparente y se incuban en 250 μL de medio durante 24 ha 37 ° C en CO ₂ al 5% en la oscuridad. Se retiró el medio y se extrajeron 250 μL de medio de cultivo fresco que contenía 20 μg / mL de clorpromazina (CPZ), 50 μg / mL de nistatina, 20 μg / mL de citocalasina D, 25 μg / mL de dynasore, 20 μg / mL de BFA, 140 μg / Se agregaron ml de monensina o 5 μM de anti-Muc1 Ab y las células se incubaron durante 1 h.

El medio se retiró nuevamente y 250 μL de medio de cultivo que contenía 50 μg / mL de Fe ₃ marcado con Cy3 O ₄ -Se agregaron NPs Au, NP marcadas con PEG-Cy3, NP marcadas con nanocuerpo PEG-Cy3 o NP marcadas con vimentina-Cy3.

Después de 1 ha 37 ° C y 5% de CO ₂ , las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar las NP libres, y la fluorescencia se midió con azul tripán como extintor de fluorescencia impermeable a la membrana mediante SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, EE. UU.). Cada experimento se llevó a cabo con cantidades iguales de NP (50 μg / mL) y se repitió cuatro veces.

Resultados y discusión

Las NP de núcleo-capa se sintetizaron mediante un método publicado [16, 17]. Las observaciones de microscopía electrónica de transmisión (TEM) en la Fig. 1a, b muestran que el Fe ₃ O ₄ -Las NP de núcleo-caparazón de Au eran esféricas con un diámetro promedio de 13,5 nm y una distribución de tamaño estrecha.

Caracterización del Fe ₃ sintetizado O ₄ -Au NP core-shell. un , b Observaciones TEM del Fe ₃ sintetizado O ₄ -Au NP core-shell. c , d NP en solución acuosa, antes y después de aplicar un campo magnético externo. e El pico de absorbancia UV de las NP de núcleo-capa sintetizadas aparece a ~ 530 nm. f Bucles de histéresis magnética de Fe ₃ O ₄ núcleo

El aumento de ~ 8.5 nm del núcleo NP (Fe ₃ O ₄ ) proviene del recubrimiento de una capa de Au de ~ 2.5 nm de espesor en la superficie del núcleo, lo que da como resultado un NP núcleo-capa. Una imagen TEM de alta resolución con el análisis de transformada rápida de Fourier (FFT) del Fe ₃ O ₄ -Au core-shell NP se incluye en la información complementaria Fig. S1.

El producto elaborado en disolvente orgánico se purificó mediante separación magnética y se transfirió al agua.

Las NP de núcleo-capa estaban bien dispersas y eran estables en agua sin ninguna modificación de la superficie, debido a los copolímeros de bloques residuales que estaban presentes en las NP.

Las figuras 1c yd muestran las NP en solución acuosa antes y después de aplicar un campo magnético externo. Bajo un campo magnético externo, las NP núcleo-capa cambiaron rápidamente de una dispersión homogénea (Fig. 1c) a una solución clara y transparente (Fig. 1d).

La banda de absorción de las NP núcleo-capa se investigó usando espectrometría UV-Vis. Como se muestra en la Fig. 1e, apareció un pico de absorbancia a ~ 530 nm, lo que indica la presencia de Au en la superficie de las NP (información complementaria, la Fig. S2 incluye el resultado de los datos de EDX para Fe ₃ O ₄ -Au NP core-shell). Como la muestra había sido purificada, los resultados ópticos demostraron la formación de la estructura núcleo-capa.

Se obtuvieron bucles de histéresis magnética a partir de mediciones de muestras vibratorias para investigar las propiedades magnéticas del Fe ₃ O ₄ núcleo y los NP de núcleo-caparazón. Ambos NP mostraron un comportamiento superparamagnético con una coercitividad cercana a 0 Oe a temperatura ambiente (Fig. 1f).

Como se informó en trabajos anteriores, la susceptibilidad de las NP de núcleo-capa fue mayor que la de las NP de magnetita, lo que podría deberse en parte a efectos de proximidad y configuraciones espaciales únicas [41, 42]. Además, las magnetizaciones de saturación de las NP del núcleo y las NP del núcleo-capa son ~ 37 emu / gy ~ 21 emu / ga 10 kOe, respectivamente. La diferencia en Ms se debe a la existencia de un componente no magnético (Au) en los NP de núcleo-capa.

El gen VHH 5-24 K10 se clonó en marco para producir pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 después de la amplificación por PCR (Fig. 2a). La proteína recombinante se expresó en E. coli BL21 que se transformó con pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 después de la inducción con IPTG y se purificó mediante Ni-NTA His · Bind Resin. El anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinante se expresó fácilmente en E. coli como proteína soluble de 18 kDa. A partir de un cultivo de 1 L, obtuvimos 1 ± 0,5 mg de anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinante purificado.

Expresión y purificación de la proteína de fusión anti-Muc1-VHH 5-24 K10. El gen VHH 5-24 K10 se clonó en marco para producir a pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 después de b purificación de la proteína de fusión Muc1-VHH 5-24 K10. La proteína purificada se separó en SDS-PAGE al 15%. Escalera de proteínas del carril 1. Carril 2 de proteína purificada. c Ilustración esquemática de NP marcadas con colorante de nanocuerpo de PEG utilizadas en este estudio

La proteína purificada se verificó mediante gel de SDS-PAGE al 15%. La tinción con azul de Coomassie de la proteína purificada reveló que era> 95% pura (Fig. 2b). El Fe ₃ sintetizado O ₄ Las NP de -Au se modificaron en tres pasos, a saber, PEGilación, etiquetado de anticuerpos y etiquetado con colorante (Fig. 2c). Después de cada paso de modificación, se midió el potencial zeta para confirmar la modificación exitosa. La Tabla 1 muestra el efecto de la modificación sobre los potenciales zeta correspondientes. El potencial zeta de las NP de núcleo-capa desnuda fue - 19,8 ± 6,68 mV. La pegilación de NP se llevó a cabo utilizando OPSS-PEG-NHS. Para producir una serie de nanocomplejos con diferentes tamaños, se utilizó OPSS-PEG-NHS con varias longitudes (2 K, 5 K y 10 K).

Después de la PEGilación, los potenciales zeta se redujeron (- 44,9 ± 8,19 mV, - 40,7 ± 7,88 mV y - 39,6 ± 8,74 mV para 2 K, 5 K y 10 K, respectivamente).

Curiosamente, después del etiquetado de nanocuerpos, los potenciales zeta aumentaron claramente (- 38,5 ± 5,61 mV, - 23,3 ± 8,61 mV y - 31,8 ± 7,37 mV para 2 K, 5 K y 10 K, respectivamente).

Después del marcado con tinte, los potenciales zeta también aumentaron (- 12,5 ± 7,25 mV, - 17,7 ± 3,94 mV y - 10,6 ± 4,72 mV para 2, 5 y 10 K, respectivamente).

El potencial zeta del Fe ₃ desnudo O ₄ -El NP de núcleo-capa de Au fue de - 19,8 ± 6,68 mV. Después de la PEGilación, el potencial zeta se redujo a cerca de -40 mV. Estos resultados indican que las moléculas de PEG estaban bien unidas covalentemente a la capa de Au de las NP de núcleo-capa porque las moléculas de PEG tienen grupos funcionales N-hidroxisuccinimida cargados negativamente. Mientras tanto, el potencial zeta aumentó después del marcado con tinte al nanocuerpo (- 38,5 ± 5,61 mV para el nanocuerpo NP-PEG2 K y - 12,5 ± 7,25 mV para el colorante del nanocuerpo NP-PEG2 K). Este resultado es razonable porque el nanocuerpo recombinante tiene diez colas de lisina en el extremo terminal. Cada tipo de nanocuerpo se categorizó mediante la medición del potencial zeta y, para determinar la unión de anticuerpos en el nanocuerpo, medimos la fluorescencia de cada tipo de nanocuerpo.

Como se muestra en la Fig. 3, confirmamos que todos los tipos de nanopartículas y nanocuerpos tienen una buena absorción e internalización celular en ausencia de restricciones de inhibidores. Se obtuvo una curva de internalización celular a partir de células incubadas en presencia de Fe ₃ marcado con Cy3 de 50 μg / ml O ₄ -Au NP, NP marcadas con PEG-Cy3 y NP marcadas con nanocuerpo PEG-Cy3 durante diferentes períodos (entre 0 y 360 min) después de retirar el medio, lavar las NP libres y finalmente medir la fluorescencia total de las células con tripán azul (Fig. 3).

Fotofluorescencia normalizada de células de mucina CT26 después de la incubación con 50 μg / mL a Fe ₃ O ₄ -Au NP, b NP PEGiladas y NP etiquetadas con nanocuerpos de PEG, y c Fe ₃ O ₄ -Au NP, NP marcadas con nanocuerpos y NP marcadas con vimentina a 37 ° C en 5% CO ₂ para diferentes períodos (10, 20, 30, 60, 120 y 360 min)

De acuerdo con el resultado de la medición de la intensidad de la fluorescencia, podemos determinar que las NP se internalizaron en las células en 1 h (Fig. 3a). La intensidad de fluorescencia de NP alcanzó un máximo en 1 h, y la intensidad de fluorescencia disminuyó gradualmente después de alcanzar un estado estable. Aunque hay una ligera diferencia de tiempo dependiendo de la presencia de Ab, la intensidad de la fluorescencia por tiempo de cultivo no fue significativamente diferente del resultado de los NP desnudos (Fig. 3b). Como se muestra en la Fig. 3c, se confirmó que el efecto de Ab, mediante el uso de Ab heterogéneo de Muc1 y vimentina, fue insignificante en la absorción celular y la internalización de NP.

Con el ensayo WST-1, la viabilidad (%) de las células de mucina CT26 dependiendo de la concentración y modificación de la superficie de Fe ₃ O ₄ -Las NP de núcleo-capa de Au se estimaron después de varios tiempos de exposición (Fig. 4a, b). La viabilidad de las células CT26 no mostró diferencias significativas después de 24 y 48 h de exposición, ya sea con dosis variables o después de la modificación de la superficie de las NP. La viabilidad celular fue superior al 90% tanto en el Fe ₃ desnudo O ₄ -Au NP (Fig. 4a) y las NP modificadas en superficie (Fig. 4b).

Viabilidades de las células de mucina CT26 tratadas con Fe ₃ desnudo O ₄ -Au NP core-shell y Fe ₃ modificado en la superficie O ₄ -Au NP a diferentes concentraciones. un Fe ₃ O ₄ -Au NP y b NP marcadas con nanocuerpo PEG-Cy3. Cada gráfico experimental representa el promedio de una serie de cuatro experimentos diferentes

La Figura 5 indica que los NP entraron en las células de mucina CT26 a través de varias vías de endocitosis (vías mediadas por clatrina, mediadas por caveolas y de fagocitosis / macropinocitosis). Curiosamente, la Fig. 5b muestra que anti-Muc1 Ab también afectó principalmente a la endocitosis de NP marcadas con nanocuerpo de PEG-Cy3. Para comprender la vía de internalización de NP, intentamos inhibir las vías de endocitosis con inhibidores químicos específicos (Fig. 5). Se sabía que las vías de la endocitosis se dividían en tres tipos:mediada por clatrina, mediada por caveolas y macropinocitosis / fagocitosis.

Fotofluorescencia normalizada de células de mucina CT26 tratadas con inhibidores químicos de la endocitosis durante 1 hora e incubadas con 50 μg / ml de a NP y b de núcleo desnudo NP etiquetadas con nanocuerpos a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante 30 min. Inhibidores con efecto estadístico sobre la internalización (Student's t prueba, p (*) <0.05 y p (**) <0.01) están marcados con asteriscos negros

En este estudio, los inhibidores se utilizaron como un primer enfoque para investigar la internalización de NP etiquetadas con nanocuerpos. CPZ (inhibidor de endocitosis mediada por clatrina), nistatina (inhibidor de endocitosis mediada por caveolas), dynasore (inhibidor de dinamina), citocalasina D (inhibidor de fagocitosis / macropinocitosis), BFA (destructor del aparato de Golgi), monensina (inhibidor de lisosomas1) o anti-muc1 Se incubaron Ab (competidor específico de receptor / transportador) con células durante 1 h. CPZ, nistatina, dynasore y citocalasina D afectaron la endocitosis de las NP (Fig. 5a).

El grupo de orientación es la clave para el éxito de la orientación al cáncer, que es excepcionalmente importante en la terapia del cáncer. Para el direccionamiento, la modificación eficaz de la superficie es muy importante para aumentar la eficacia terapéutica y limitar los efectos secundarios. Fe ₃ etiquetado con nanocuerpos O ₄ -Las NP core-shell de Au se hicieron con éxito a partir de NP sintetizadas y nanocuerpos recombinantes. La Tabla 1 muestra claramente que cada paso de modificación se llevó a cabo con éxito.

La viabilidad celular es uno de los elementos esenciales para la aplicación biológica de los nanomateriales. Las viabilidades celulares fueron superiores al 90% en las NP de núcleo-capa desnuda y NP modificadas (Fig. 4a, b). Estos resultados implican que el Fe ₃ desnudo O ₄ -Las NP de Au y las NP modificadas no causaron una citotoxicidad significativa dependiente de la concentración y la modificación y que las NP modificadas eran adecuadas para la aplicación biológica.

Los estudios de la eficiencia de internalización y el efecto inhibidor de las NP proporcionan información importante para comprender los mecanismos a través de los cuales las NP ingresan a las células. Las NP pegiladas se internalizaron relativamente lentamente en las células en comparación con las NP desnudas, pero las NP marcadas con nanocuerpos se internalizaron en las células ligeramente más rápido que las NP desnudas (Fig. 3a, b). Debido a que la PEGilación es un método de modificación de la superficie bien conocido para prevenir la internalización de NP, la tendencia a la internalización de NP PEGiladas se explica fácilmente. Además, el nanocuerpo indujo la endocitosis de las NP. Para comprobar la especificidad del nanocuerpo, confirmamos la tasa de internalización de NP marcadas con vimentina Ab. Curiosamente, los NP marcados con vimentina Ab no promovieron la internalización celular (Fig. 3c).

Estos resultados indican que el nanocuerpo puede inducir eficazmente la internalización de nanomateriales en las células de mucina CT26 e implican que la tendencia a la internalización se puede controlar con una modificación específica de la membrana externa de las NP. Además, los mecanismos de la endocitosis de las NP marcadas con nanocuerpos se demostraron claramente mediante pruebas de inhibición e imágenes de microscopía confocal. La fotofluorescencia tanto de las NP marcadas con nanocuerpos como de las NP no marcadas mostró valores decrecientes similares cuando se cultivaron con CPZ, nistatina o dynasore (Fig. 5a, b). CPZ, nistatina y dynasore desempeñan un papel en la inhibición, respectivamente, de la endocitosis mediada por clatrina, la endocitosis mediada por caveolas y la dinamina, que es una gran GTPasa implicada en la gemación y escisión de las vesículas nacientes de las membranas originales. Por tanto, los valores de fotofluorescencia en ambos casos disminuyeron rápidamente porque la dinamina está estrechamente relacionada con la producción de vesículas para la endocitosis mediada por clatrina y por caveolas. Como se muestra en la Fig. 5a, tanto las NP no etiquetadas (Fig. 5a) como las etiquetadas con nanocuerpos (Fig. 5b) mostraron una rápida disminución de la fotofluorescencia.

En particular, los NP etiquetados con nanocuerpos mostraron valores de fotofluorescencia significativamente más bajos en CPZ, nistatina y dynasore. Además, confirmamos que las NP no marcadas se vieron más afectadas que las NP marcadas con nanocuerpo cuando se aplicaron a la citocalasina D, que es una toxina permeable a las células que bloquea la polimerización de los filamentos de actina para la fagocitosis [43]. Estos resultados implican que las NP no marcadas se internalizaron a través de múltiples mecanismos como la endocitosis mediada por clatrina, la endocitosis mediada por caveolas y la fagocitosis. En consecuencia, la internalización celular de las NP marcadas con nanocuerpos depende de la endocitosis mediada por clatrina y mediada por caveolas. Además, la cantidad de captación celular de NP marcadas con nanocuerpos se redujo considerablemente cuando las células se cultivaron con el anticuerpo Muc1 (Fig. 5b). Este resultado indica que el anticuerpo Muc1 libre juega un papel como competidor del nanocuerpo en las NP modificadas al unirse a la membrana celular CT26 y que el anticuerpo Muc1 juega un papel importante en la internalización celular de las NP modificadas. Curiosamente, las NP marcadas con vimentina Ab mostraron diferencias obvias en comparación con las NP marcadas con nanocuerpos en términos de capacidad de inhibición. La fotofluorescencia de los NP marcados con vimentina no se vio afectada en múltiples pruebas de inhibición, lo que indica que los NP fueron mínimamente influenciados por nistatina, dynasore, citocalasina D e incluso Muc1 Ab. Este fenómeno podría ser una prueba de la eficacia de la vimentina, que se ha confirmado bioquímicamente que afecta de forma potente a la fagocitosis [39]. En consecuencia, este resultado indica que Muc1 Ab puede dirigirse a moléculas específicas y puede controlar la endocitosis específica.

Como se muestra en la Fig. 6, se obtuvieron resultados análogos cuando las células se trataron con NP de núcleo desnudo marcadas con Cy7.5 y NP marcadas con nanocuerpo de PEG, lo que indica una absorción celular similar en ambos casos en ausencia de inhibición de dynasore. La inhibición de Dynasore indujo una internalización celular claramente más baja de las NP marcadas con nanocuerpos de PEG en comparación con las NP desnudas (Fig. 6b, fila inferior). Estos resultados implican que hay dos mecanismos de endocitosis, que son la endocitosis no específica de NP desnudas y la endocitosis restringida de NP marcadas con nanocuerpos a través de la molécula de dinamina. Una vez que el nanocuerpo se adhiere a la membrana celular externa, las NP marcadas con nanocuerpos podrían pasar fácilmente a través de la membrana celular debido a la activación simultánea de los mecanismos mediados por clatrina y caveolas. En consecuencia, podríamos suponer que los principales mecanismos son la endocitosis mediada por clatrina y caveolas para la internalización de NP marcadas con nanocuerpos en las células de mucina CT26.

Imágenes microscópicas confocales de células de mucina CT26 incubadas con a Fe ₃ O ₄ -Au NP y b NP etiquetadas con nanocuerpos de PEG durante 1 ha 37 ° C en CO ₂ al 5% incubadora, antes y después de la inhibición de dynasore (1 ng / mL)

Conclusiones

Los nanomateriales para la detección del cáncer y la inserción controlable de materiales exógenos como fármacos, genes y péptidos son avances fundamentales en las aplicaciones biomédicas. Estos conceptos familiares pero creativos pueden ofrecer estrategias para nuevos métodos terapéuticos. En este artículo, demostramos una captación celular mejorada de Fe ₃ O ₄ -Au NP core-shell después de la PEGilación con el anticuerpo Muc1. Se demostraron los principales mecanismos de endocitosis de las NP marcadas con nanocuerpos, mostrando la posibilidad de una endocitosis específica controlable en células de cáncer colorrectal. Estos hallazgos proporcionan información sobre la focalización entre NP etiquetadas con nanocuerpos y células de cáncer colorrectal para ayudar al diseño de portadores de focalización de alta eficiencia.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Abreviaturas

Fe ₃ O ₄ :: Magnetita
Au:: Oro
NP:: Nanopartículas
Ab:: Anticuerpo
HCAbs:: Anticuerpos de cadena pesada
VHH:: VH del camélido HCAb
PEG:: Polietilenglicol
PPG:: Poli (propilenglicol)
PCR:: Reacción en cadena de la polimerasa
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión
PEO-PPO-PEO:: Poli (óxido de etileno) -poli (óxido de propileno) -poli (óxido de etileno)
OPSS-PEG-NHS:: Éster succinimidílico de ortopiridil disulfuro PDP PEG
BFA:: Brefeldin A
CPZ:: Clorpromazina