Nanoliposomas decorados con anticuerpos monoclonales PD-L1 cargados con paclitaxel y un inhibidor del transporte de P-gp para la quimioterapia sinérgica contra cánceres gástricos resistentes a múltiples fármacos

Resumen

La resistencia a múltiples fármacos (MDR) basada en transportadores de eflujo dependientes de ATP (p-glicoproteína (p-gp)) sigue siendo un obstáculo importante para el éxito del tratamiento de quimioterapia. En este documento, hemos investigado el potencial del nanoliposoma conjugado con mAb PD-L1 para servir como una plataforma de entrega dirigida para la entrega conjunta de paclitaxel (PTX) y el inhibidor de transporte específico de p-gp (TQD, tariquidar) en cánceres gástricos resistentes a fármacos. . Dos fármacos, PTX y TQD, se cargaron conjuntamente en un solo vehículo en una proporción precisa para mejorar la posibilidad de un efecto quimioterapéutico combinado. El estudio de captación celular indicó que PD-PTLP tenía una mayor eficiencia de internalización en el receptor de PD-L1 que sobreexpresa las células SGC7901 / ADR que las PTLP no dirigidas. La sinergia más alta se observó con una fracción de peso de 1 / 0,5 (PTX / TQD) y la combinación de PTX y TQD dio como resultado un efecto sinérgico obvio en comparación con el de los fármacos individuales solos. Nuestros resultados in vitro mostraron que TQD fue eficaz para revertir la resistencia a múltiples fármacos en las células SGC7901 / ADR. El valor de CI50 de PD-PTLP fue de 0,76 μg / ml en comparación con 6,58 μg / ml y 7,64 μg / ml para PTX y TQD, respectivamente. PD-TPLP desencadenó niveles significativamente más altos de especies reactivas de oxígeno (ROS) y apoptosis celular en comparación con los de PTX o TQD libres. Además, el estudio antitumoral in vivo mostró que la quimioterapia combinada de PD-PTLP mostró una inhibición significativa de la carga tumoral de los tumores de xenoinjerto resistentes a los fármacos con células positivas con marcaje final de mella dUTP de desoxinucleotidil transferasa terminal significativamente más alta (TUNEL). Además, la PTX libre dio como resultado un aumento significativo en los niveles de AST y ALT, mientras que la PD-PTLP fue insignificantemente diferente en comparación con la del control que indica el índice de seguridad. En general, creemos que la combinación de un fármaco contra el cáncer con un inhibidor de la gp-p podría proporcionar una dirección potencial hacia el tratamiento de los tumores gástricos resistentes a los fármacos.

Introducción

Los tratamientos quimioterapéuticos actuales basados en un régimen de un solo fármaco están lejos de ser perfectos y adolecen de efectos adversos graves a dosis más altas y, al mismo tiempo, conducen al desarrollo de resistencia a los fármacos [1]. La última década ha sido testigo de la alta eficacia terapéutica del régimen de combinación de fármacos en el tratamiento del cáncer [2]. Se ha demostrado que la combinación de dos o más fármacos produce una eficacia anticancerosa sinérgica debido a la diferente acción farmacológica de los fármacos combinados [3, 4]. Sin embargo, la elección de la combinación correcta de medicamentos depende de múltiples factores, incluido el tipo de célula cancerosa, los medicamentos hidrófilos / hidrófobos, las actividades bioquímicas y los patrones farmacocinéticos de los medicamentos. Entre todos, la combinación de fármacos es selectiva para tipos específicos de cánceres [5].

El cáncer gástrico es una carga para la salud mundial y la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. La prevalencia de cáncer gástrico es alta en el este de Asia, como Japón, Corea y China, y este último informa la tasa de mortalidad más alta del mundo [6]. En promedio, se registran 400.000 nuevos casos cada año en China y la mayoría de los casos se diagnostican en etapas avanzadas o tardías [7, 8]. Se han logrado enormes avances en las estrategias de tratamiento; sin embargo, no mejoró la tasa de supervivencia y resultó en el fracaso de la terapia. El fracaso del tratamiento se atribuyó principalmente al desarrollo de quimiorresistencia y toxicidad grave de la dosis de quimioterapia y la reaparición del episodio de cáncer gástrico [9]. Por tanto, existe una tarea urgente para mejorar la eficacia terapéutica y superar la metástasis y reincidencia del cáncer gástrico.

El paclitaxel (PTX) es uno de los fármacos importantes indicados en el tratamiento de los cánceres gástricos [10]. PTX inhibe la replicación celular al interferir con la degradación de los microtúbulos, lo que conduce a la detención del ciclo celular. Sin embargo, la adquisición de resistencia a múltiples fármacos (MDR) es un problema importante entre el éxito de la quimioterapia [11, 12]. El eflujo dependiente de ATP mediado por transportadores transmembrana de la familia de casetes de unión a ATP (ABC) en la que la p-glicoproteína (p-gp) se considera el factor afluente se sobreexpresa en los caners gástricos [13]. De otra manera, la PTX sirve como sustrato para los receptores de p-gp, en los que la salida del fármaco reducirá la concentración intracelular del fármaco, lo que producirá una baja eficacia y una alta resistencia [14]. En este sentido, Tariquidar (TQD) es un potente inhibidor de la p-gp de tercera generación y se ha informado que revierte la sobreexpresión de los receptores p-gp en varias células cancerosas [15, 16]. Sin embargo, los informes sugirieron que la administración de TQD debe interrumpirse antes, ya que impide la función de p-gp del sistema fisiológico normal. La expresión de P-gp es necesaria para mantener la barrera hematoencefálica (BHE) y eliminar las toxinas de los tejidos normales [17]. Dado que la p-gp está presente en los tejidos normales y actúa como barrera contra las toxinas celulares, la inhibición no específica de PTX o TQD podría interferir potencialmente con las funciones fisiológicas normales y conducir a una toxicidad adversa. Además, PTX y TQD son fármacos altamente lipofílicos con solubilidad limitada en soluciones acuosas y sangre sistémica, lo que requiere la necesidad de un sistema de administración de fármacos estable que se dirija a los cánceres gástricos en el cuerpo [18].

El sistema de administración de fármacos (DDS) aumentó significativamente la concentración de fármacos encapsulados en los tejidos cancerosos y ofreció una liberación sostenida del fármaco durante un período de tiempo prolongado [19]. En este sentido, el liposoma es uno de los portadores de fármacos más utilizados para mejorar la eficacia terapéutica en cánceres. Los liposomas adquirieron una importancia creciente debido a su biocompatibilidad, modificaciones de la superficie estructural, carga de fármaco hidrófilo / lipófilo y alta capacidad de carga de fármaco [20]. Los fármacos podrían incorporarse de forma estable en la bicapa lipídica del liposoma y podrían dotarse fácilmente de capacidad de circulación prolongada (PEGilación) mediante un efecto mejorado de permeación y retención (EPR) [21]. Recientemente, se ha informado de la capacidad de los liposomas para retener las proporciones de múltiples fármacos después de la administración intravenosa [22]. Esta idea se demostró en 2017 después de la aprobación de la FDA, Vyxeos® (formulación liposomal) que contiene proporciones de citarabina:daunorrubicina en el tratamiento de la leucemia [23]. En comparación con las formulaciones no dirigidas, las formulaciones dirigidas a ligandos resultaron muy atractivas y prospectivas. En este sentido, PD-1 es un receptor de superficie celular conocido por la regulación negativa del sistema inmunológico y suprime la actividad inflamatoria de las células T. La expresión de PD-L1 se ha informado en el 50% de los pacientes con cáncer gástrico que hacen que PD-L1 sea un receptor de direccionamiento para la internalización de nanopartículas [24, 25]. El anticuerpo monoclonal (mAb) PD-L1 podría unirse específicamente al dominio extracelular de la proteína PD-L1 y podría ser una excelente estrategia terapéutica para mejorar la eficacia contra el cáncer [26].

El objetivo principal del presente estudio fue mejorar la administración de fármacos combinados, PTX y TQD para mejorar la eficacia anticancerígena contra los cánceres gástricos. Para este propósito, se formuló y evaluó la eficacia anticancerígena de PD-L1 / nanoliposoma cargado con PTX y TQD en condiciones in vitro e in vivo. La eficacia in vivo se evaluó en un modelo de xenoinjerto basado en células de cáncer gástrico y se realizó inmunohistoquímica (IHC).

Conclusión

En conclusión, nuestro trabajo realizó una terapia combinada contra el tumor MDR mediante una estrategia de administración programada. Hemos demostrado el potencial de la combinación de PTX y el inhibidor de p-gp (TQD) para inhibir la carga tumoral de tumores de xenoinjerto SGC7901 / ADR resistentes a múltiples fármacos. La coadministración de PTX y TQD en un nanoportador multifuncional permitió el control radiométrico de los fármacos anticancerosos cocargados, inhibió la bomba de salida de p-gp y mostró la eficacia anticancerígena sinérgica. Creemos que la combinación de un medicamento contra el cáncer con un inhibidor de la p-gp podría proporcionar una dirección potencial hacia el tratamiento de tumores resistentes a los medicamentos.

Materiales y métodos

Formulación de nanoliposomas cargados con PTX / TQD conjugado con mAb PD-L1

La fosfatidilcolina de huevo (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilenglicol) -2000] ( DSPE-PEG) y DSPE-PEG2000-maleimida (DSPE-PEG2000-Mal) mezclados en una solución de cloroformo en una proporción molar de 3/2 / 0.5 / 0.25 junto con PTX y TQD y luego el solvente orgánico se evaporó usando un evaporador rotatorio seguido de liofilización durante 3 h. La película lipídica se hidrató con una solución de sulfato amónico 250 mM mantenida a pH 7,0. Los grandes liposomas multilaminares se sometieron a ultrasonidos durante 30 min en un sonicador de tipo baño (Branson ultrasonicbath, EE. UU.) Mantenido a 65 ° C. Los liposomas se dializaron frente a un gran volumen de agua destilada durante estrictamente 1 h para intercambiar el fármaco libre y los componentes iniciales. Los liposomas se redispersaron en una solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). El mAb PD-L1 se conjugó con el liposoma mezclándolo en una proporción de 8:1 (liposoma:mAb) y se incubó a 4ºC durante 4 h. El mAb PD-L1 se conjugará con el DSPE-PEG2000-Mal mediante la interacción entre los residuos sulfhidrilo de los anticuerpos de los grupos maleimida C-terminal de los liposomas. Los liposomas conjugados con PD-L1 se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se retiró y se volvió a dispersar en un tampón PBS y se almacenó a 4ºC hasta su posterior análisis. La cantidad de PTX y TQD encapsulada en el liposoma se evaluó mediante el método de HPLC. En el estudio se utilizó el sistema HPLC Agilent Technologies modelo 1260 Infinity equipado con un muestreador automático de Agilent Technologies y un detector de matriz de diodos G1315D. La fase móvil consiste en una mezcla de acetonitrilo / agua (70:30 v / v) mantenida a un caudal de 1 ml / min. Se utilizó una columna C18 (5 µm, 150 x 60 mm, ODS-3) para eluir las muestras y se detectó a 227 nm. Antes, el liposoma cargado con PTX / TQD se disolvió en acetonitrilo y se agitó en vórtex durante 15 min, se filtró a través de un filtro de 0,45 μm y se inyectaron 10 μl de una alícuota en la columna de HPLC.

Distribución de tamaño y análisis de morfología de partículas

La distribución de tamaño y el potencial zeta de las formulaciones cargadas de fármaco se determinaron mediante Malvern Zetasizer (Reino Unido) a 25 ° C. Antes del experimento real, las dispersiones de nanopartículas se diluyeron 10 veces con agua destilada y el experimento se realizó en un ángulo de detección de 90 ° por triplicado. La morfología de las nanopartículas se evaluó mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM). Las dispersiones de nanopartículas se diluyeron 10 veces con el agua destilada y se colocaron en una rejilla de cobre recubierta de carbono y se secaron con una lámpara de infrarrojos y luego la muestra se evaluó mediante TEM (CM 30, Philips (Eindhoven, Países Bajos)) después de teñir con acetato de uranilo. (1% p / v).

Análisis del perfil de la versión

El perfil de liberación de PTX y TQD del nanoliposoma se evaluó mediante el método de diálisis. Para ello, se disolvieron 15 mg de polvo liofilizado de PTX conjugado con PD-L1 mAb y nanoliposomas cargados con TQD (PD-PTLP) en 1 ml de agua destilada y se selló en una membrana de diálisis (MWCO 3,5 kDa) y se sumergió en un 30 ml de tampón de liberación respectivo mantenido a 37 ° C. En un momento predeterminado, se extrajeron alícuotas de muestras y se reemplazaron con una cantidad igual de tampón de liberación. El estudio continuó durante 72 h. Las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y se inyectaron en la columna de HPLC y se evaluaron mediante el método mencionado anteriormente.

Estudios de captación celular

Se cultivaron células SGC7901 / ADR en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con FBS al 10% y penicilina 100 UI / ml y estreptomicina 100 μg / ml en condiciones de CO ₂ al 5% atmósfera a 37 ° C. Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal (BX61WI; Olympus, Tokio, Japón) para evaluar la distribución celular y la captación celular de PTLP y PD-PTLP en células SGC7901 / ADR. Para lograr este propósito, 1 × 10 ⁵ las células se sembraron en cada pocillo de una placa de 12 pocillos y se incubaron durante 18 h. A continuación, las células se expusieron con PTLP y PD-PTLP y se incubaron durante 3 h. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 10 min. Las células se lavaron de nuevo con PBS y se tiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min. Finalmente, las células se lavaron cuidadosamente y se observaron bajo CLSM. El experimento competitivo sobre la absorción de PD-PTLP se realizó pretratando las células con mAb de PD-L1 libre durante 30 min y se lavaron. Las células se dividieron en dos grupos, uno tratado con mAb PD-L1 libre y otro no tratado con mAb PD-L1 libre. Las células se incubaron con PD-PTLP y se incubaron durante 3 horas y se siguió el mismo método para la evaluación del análisis de captación celular.

Expresión de proteínas mediante ensayo de transferencia Western

Las células SGC7901 / ADR se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de siembra de 3 × 10 ⁵ células / pocillo y se incubó durante 18 h. Las células se trataron con diferentes formulaciones (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) y se incubaron durante 24 h. Las células se lavaron y extrajeron con tampón de separación y se lisaron usando un tampón de lisis estándar (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.). Las células se centrifugaron a una velocidad de 12.000 rpm durante 15 min y se recogió el sobrenadante y se realizó la cuantificación de proteínas usando el ensayo de proteína BCA (Beyotime). Se cargó la misma cantidad de proteínas en gel SDS-PAGE al 8% y luego se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% durante 1 h para inhibir los sitios de unión no específicos. La membrana se incubó con anticuerpos primarios (p-gp y GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, EE. UU.) A 4 ° C durante la noche. La membrana se lavó con TBST y se incubó de nuevo con anticuerpos secundarios de anticuerpos de cabra anti-conejo o ratón de cabra marcados con peroxidasa de rábano picante (conejo o ratón, 1:10.000, Abcam, MA, EE. UU.) A temperatura ambiente. Las membranas se lavaron nuevamente con TBST. Las transferencias se visualizaron con un método de quimioluminiscencia mejorado (EMD Millipore).

Análisis de citotoxicidad in vitro

El efecto citotóxico de fármacos y formulaciones individuales se evaluó mediante ensayo MTT. Brevemente, las células cancerosas se colocaron en capas a una densidad de 1 × 10 ⁴ células / pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante 18 h. A continuación, las células se trataron con PTX, TQD, PTLP y PD-PTLP libres, respectivamente, durante 24 h. A continuación, las células se lavaron cuidadosamente y se añadieron 15 µl de solución de MTT de 5 mg / ml y se sometieron a incubación adicional durante 3 h y luego se añadieron 100 µl de DMSO para extraer el cristal de formazán. La absorbancia resultante se midió a 570 nm usando un lector de microplacas automático. La viabilidad celular se calcula mediante la DO del grupo de prueba / DO del control × 100%. El índice de combinación fue evaluado por Calcusyn ^TM software. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Análisis de especies reactivas de oxígeno y apoptosis in vitro

Para el ensayo de apoptosis, las células cancerosas se colocaron en capas a una densidad de 2 × 10 ⁵ células / pocillo en una placa de 12 pocillos y se incubó durante 18 h. A continuación, las células se trataron con PTX, TQD, PTLP y PD-PTLP libres, respectivamente, durante 24 h. Las células se extrajeron por separación y se centrifugaron y los sedimentos se redispersaron en 100 µl de tampón de unión. Las células se tiñeron conjuntamente con una combinación de 5 µl de Anexina-V / FITC y 2,5 µl de solución de trabajo de PI y se incubaron durante 15 min. Las células teñidas se analizaron mediante citómetro de flujo utilizando un BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, EE. UU.). La anexina-V y el PI representan el indicador de apoptosis temprana y el indicador de apoptosis tardía basados en los componentes estructurales de las células vivas y muertas, respectivamente.

El diacetato de 2,7-diclorofluorescina (DCFH-DA) se utilizó como sonda para el análisis de especies reactivas de oxígeno (ROS). Para análisis cuantitativo, 1 × 10 ⁴ células / pocillo se sembraron en una placa de fondo negro de 96 pocillos y se incubaron durante 18 h. A continuación, las células se trataron con PTX, TQD, PTLP y PD-PTLP libres, respectivamente, durante 24 h. Las células se lavaron con tampón PBS y luego se incubaron con 1 ml de solución de DCFH-DA según las pautas del fabricante durante 30 min. Seguido de células lisadas y centrifugadas a 10.000 rpm durante 15 min. El sobrenadante resultante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos y se midió la fluorescencia a 485 nm utilizando un lector de microplacas automático. Simultáneamente, se procesaron conjuntos separados de células de manera similar y se observaron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia (Nikon A1, Japón).

Eficacia antitumoral de PD-PTLP en un modelo de xenoinjerto

El estudio de eficacia antitumoral se realizó en ratones desnudos BALB / c y se obtuvo del Laboratorio Animal Center, The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las normas nacionales para la calidad de los animales de laboratorio. Los experimentos se realizaron estrictamente de acuerdo con las directrices del Comité de Regulaciones para Animales Experimentales del Cuarto Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin, Harbin. Los animales se inyectaron por vía subcutánea con 1 × 10 ⁶ Células SGC7901 / ADR en 150 μl de medio de cultivo en el flanco derecho de los ratones. Se permitió que los tumores crecieran hasta 100 mm ³ antes del experimento real. Los ratones se dividieron igualmente en cinco grupos con ocho ratones en cada grupo. La dosis individual de PTX y TQD se fijó en 5 mg / kg, mientras que la combinación utilizó una dosis total de 5 mg / kg. La inyección en la vena de la cola fue cada tres días, en total, se realizaron tres inyecciones. En días predeterminados, se midieron el volumen del tumor y el peso corporal. El volumen del tumor se calculó midiendo el diámetro más largo y el diámetro más corto de los tumores usando un calibre digital. Volumen del tumor ( V ) =½ × largo × ancho (mm) ² . Los ratones se sacrificaron al final del estudio y el tumor se extrajo y se pesó. El tumor se sometió a análisis inmunohistoquímico (IHC). Los tumores se extrajeron, se cortaron en trozos finos y se fijaron en una solución de formalina al 10%. Los tumores se incrustaron en una cera de parafina y luego se realizó el ensayo TUNEL según las pautas del fabricante.

Análisis bioquímico del suero

A los ratones se les administraron las respectivas formulaciones; 24 h más tarde, se sacrificaron los ratones y se recogieron muestras de sangre del control y de los grupos de animales tratados con el ensayo. El suero se separa de la sangre total y se almacena a -80 ° C hasta su posterior análisis. Se realizó un análisis bioquímico sérico para evaluar el rendimiento del hígado. Se midieron la aspartato transaminasa (AST) y la alanina transaminasa (ALT) para evaluar la función hepática. Todas las mediciones se realizaron de acuerdo con los procedimientos del ensayo del kit bioquímico.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de nanoliposomas conjugados con PD-L1 cargados con PTX / TQD

El PTX se ha utilizado ampliamente en las clínicas y está indicado principalmente en el tratamiento de cánceres gástricos. Sin embargo, la mayoría de los pacientes aparentemente padece una respuesta terapéutica deficiente debido a la resistencia a múltiples fármacos (MDR) de los cánceres gástricos. Un aumento en la dosis de PTX resultó en un aumento de la toxicidad sistémica, por lo que MDR se convirtió en un obstáculo importante en el tratamiento exitoso de la terapia del cáncer. Entre la plétora de mecanismos MDR, se considera que la salida del fármaco mediada por p-gp es el principal responsable de la resistencia a los fármacos en las células cancerosas [27]. Por lo tanto, en este estudio, hemos utilizado un segundo fármaco (TQD) como inhibidor de la p-gp para superar el fenómeno MDR en las células cancerosas y mejorar la eficacia anticancerosa de la PTX. Hemos estudiado cuidadosamente la fracción de peso de dos fármacos en los que exhiben el efecto sinérgico. Para maximizar el efecto anticanceroso, es importante administrar conjuntamente los múltiples fármacos en un único sistema de nanopartículas. La administración de dos fármacos (PTX e inhibidor de p-gp) simultáneamente permitirá la supresión eficaz del mecanismo de salida del fármaco y aumentará la posibilidad de un aumento de las concentraciones intracelulares en las células cancerosas [28]. Para ello, en este estudio, hemos cargado dos fármacos en la bicapa lipídica de los nanoliposomas que se consideran extremadamente estables en las circulaciones sistémicas (fig. 1). Para lograr la dirección mejorada específica del tumor, los nanoliposomas se conjugaron en la superficie con mAb PD-L1. El grupo maleimida presente en el nanoliposoma se unirá al grupo tiol del mAb PD-L1 y formará un enlace covalente estable. Pero una posible limitación de la conjugación de maleimida es que la reacción es reversible:el producto puede sufrir reacciones de adición retro-Michael con tioles biológicos en plasma que pueden conducir a la liberación de maleimida. Sin embargo, hemos superado dicha reacción mediante la máxima conjugación superficial del anticuerpo en el maleimida-liposoma. Se ha informado que el ligando dirigido a tumores administrará específicamente la carga terapéutica en los tejidos tumorales y evitará efectos secundarios innecesarios en los tejidos normales. Anteriormente, Patel et al. informó de que la incorporación del inhibidor de p-gp con PTX podría superar la MDR en la célula de cáncer de ovario en condiciones in vitro [11]. Del mismo modo, Zou et al. y Zhang et al. informó que la citotoxicidad de PTX contra células resistentes a múltiples fármacos SKOV-3TR y A2780-Adr aumentó significativamente en presencia de Tariquidar. Sin embargo, en estos estudios, se utilizó una combinación física de PTX + TQD o se desarrolló un portador no dirigido [29, 30]. Es importante destacar que todos estos estudios se han realizado solo en condiciones in vitro. El presente estudio se centró en el diseño del nanoportador dirigido utilizando una clase relativamente nueva de agente de orientación, el anticuerpo PDL1. Además, el presente estudio demostró la eficacia de PTX + TQD en un modelo de tumor de xenoinjerto y también evaluó los parámetros sanguíneos para relacionarlos con la toxicidad sistémica.

El tamaño de partícula promedio de PTLP fue 135,6 ± 1,26 nm mientras que aumentó a 168,59 ± 1,34 nm después de la conjugación con mAb PD-L1 (PD-PTLP). El tamaño de partícula aumentó debido al gran peso molecular del mAb PD-L1; sin embargo, el tamaño total de menos de 200 nm y la forma esférica fue el punto digno de mención (Fig. 2a). Las nanopartículas de tamaño inferior a 200 nm permitirán una mayor acumulación en los tejidos tumorales debido al efecto mejorado de permeación y retención (EPR). Además, la presencia de PEG permitirá prolongar el tiempo de circulación sanguínea en la circulación sistémica. El potencial zeta de PD-PTLP fue de 22,1 ± 1,21 mV, lo que no permitirá ninguna unión no específica a los componentes sanguíneos. PD-PTLP exhibió una alta eficiencia de atrapamiento de ~ 95% para ambos fármacos (PTX y TQD). PD-PTLP también exhibió una alta carga de fármaco de 12 a 14% p / p para PTX y TQD, respectivamente (Fig. 2b).

Liberación de fármacos in vitro

Se estudió el comportamiento de liberación de PTX y TQD de PD-PTLP en condiciones de pH 7,4 y pH 5,0 a 37 ° C. Como se muestra en la Fig. 2c, se observó una liberación controlada de fármacos (PTX y TQD) desde el PD-PTLP durante todo el período de estudio (72 h). La liberación de fármaco de la bicapa gruesa de nanoliposoma podría ser responsable de la liberación lenta y sostenida de dos fármacos del PD-PTLP. Cabe señalar que no se observaron diferencias significativas en el patrón de liberación de PTX y TQD en pH 7,4 y pH 5,0. En un punto de tiempo más largo, se observó una diferencia significativa en la liberación en diferentes condiciones de pH. Vale la pena señalar que no se agregaron elementos sensibles al pH en el nanoliposoma y una mayor liberación del fármaco en condiciones ácidas podría atribuirse a la mayor difusión a un pH más bajo. Por ejemplo, ~ 85% de PTX se libera en condiciones de pH 5,0 en comparación con ~ 55% de liberación de fármaco en un entorno de pH fisiológico. Otros investigadores han demostrado un patrón similar de liberación rápida de moléculas pequeñas en condiciones ácidas y liberación más lenta en condiciones de pH básico. No obstante, una liberación relativamente baja del fármaco en condiciones de pH 7,4 podría reducir los efectos secundarios sistémicos innecesarios y prolongar la circulación sistémica, mientras que una liberación más alta del fármaco en un pH 5,0 podría beneficiar la mayor eficacia terapéutica en los tejidos tumorales.

Análisis de absorción celular in vitro

La eficiencia de suministro de nanoliposomas dirigidos (PD-PTLP) y no dirigidos (PTLP) se probó en SGC7901 / ADR. La captación celular se evaluó utilizando rodamina-B como rastreador de fluorescencia. La rodamina-B es el fluoróforo de uso común sin interacciones biológicas celulares. El núcleo se tiñó con DAPI de color azul y el color rojo se originó a partir de las nanopartículas. Los datos de CLSM revelan claramente que PD-PTLP exhibió una fuerte fluorescencia roja en las células cancerosas en comparación con la de PTLP no dirigida. Una mayor fluorescencia roja en las células cancerosas tratadas con PD-PTLP atribuida a la mayor internalización de nanopartículas (Fig. 3a). El resultado de los datos de CLSM indica que el receptor PD-L1 expresado en la membrana celular fue reconocido por mAb PD-L1 conjugado en la superficie del nanoliposoma. Un mecanismo de captación pasivo o inespecífico fue evidente en las células cancerosas tratadas con PTLP. La especificidad de la diana PD-L1 se confirmó adicionalmente mediante el experimento de pretratamiento con mAb PD-L1. Las células SGC7901 / ADR se pretrataron con mAb PD-L1 y se incubaron durante 30 min. A continuación, las células se expusieron con PD-PTLP y PTLP y se incubaron durante 3 h. Como se muestra (Fig.3b), las células pretratadas con mAb PD-L1 mostraron significativamente menos fluorescencia roja en comparación con las células no tratadas, lo que indica que los receptores expresados en la superficie consumieron mAb PD-L1 y no había receptores adicionales disponibles para unirse. e internalización que da como resultado una menor absorción de nanopartículas y una menor internalización. Estos CLSM revelaron claramente la especificidad de focalización de PD-PTLP en células cancerosas SGC7901 / ADR.

Los nanoliposomas con doble carga de fármaco mejoran el efecto antiproliferativo

Para la terapia de combinación, se utilizaron diferentes proporciones de dos fármacos (PTX y TQD) para establecer el grado de efecto sinérgico o aditivo sobre las células de cáncer gástrico resistentes. Para calcular el isobolograma y el índice de combinación (CI) se utilizó el software CalcuSyn (Biosoft, Versión 2.1). El diagrama de isobolograma podría explicarse con base en la ecuación de Chou-Talalay. Los valores de CI se caracterizan por ser sinérgicos (CI <0,9), aditivos (CI =1) y antagonistas (CI> 1). Como se muestra, toda la relación de combinación de PTX y TQD reveló un valor de CI de <1, lo que significa un mecanismo de acción sinérgico (Fig. 4a). Para ser específicos, la sinergia más alta se observó en una fracción de peso de 1 / 0.5 (P / T) mientras que el nivel de sinergia disminuyó con el aumento en la fracción de peso de TQD, lo que indica la importancia de la presencia de dos fármacos en la fracción de peso específico. Una concentración demasiado baja y demasiado alta de TQD en un régimen de combinación no produjo el mejor efecto sinérgico. Para todos los experimentos in vitro, hemos utilizado la proporción P / T =1 / 0.5 en el estudio.

El efecto citotóxico in vitro de fármacos individuales y combinados se determinó mediante el protocolo MTT después de 24 h de incubación. Como se muestra en la Fig. 4b, el blanco NP no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular descartando la posibilidad de cualquier interferencia en los resultados finales. Sin embargo, la monoterapia con PTX y TQD mostró un efecto citotóxico dependiente de la concentración en las células de cáncer gástrico resistentes; no alcanzó una eficacia apreciable en el tratamiento. El efecto antiproliferativo del agente único mejoró notablemente cuando se combinó con el segundo fármaco encapsulado en un nanoliposoma. The combination of PTX and TQD resulted in obvious synergistic effect compared to that of individual drugs alone. Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.

In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.

Apoptosis analysis by flow cytometer

Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.

Intracellular ROS level determination

We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.

Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors

Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0.001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm³ , ~ 1650 mm³ , 1625 mm³ , ~ 1000 mm³ , and ~ 650 mm³ , respectivamente. Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0.001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].

Systemic toxicity analysis

The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.

Availability of data and materials

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Abreviaturas

EPR:: Enhanced permeation and retention effect
PD-PTLP:: PD-L1 mAb-conjugated PTX and TQD-loaded nanoliposomes
P-gp:: P-glycoprotein
PTLP:: PTX and TQD-loaded nanoliposomes
PTX:: Paclitaxel
TQD:: Tariquidar

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