Novedosa terapia quimio-fototérmica en el cáncer de mama con nanopartículas de Au @ SiO2 conjugadas con ácido fólico cargadas con metotrexato

Resumen

La terapia con láser de bajo nivel (LLLT) se conoce como un tipo seguro de fototerapia para atacar tejido / células tumorales. Además, el uso de nanopartículas dirigidas aumenta el éxito de la terapia contra el cáncer. Este estudio fue diseñado para investigar el efecto combinado del oro recubierto de sílice cargado con folato (FA) / metotrexato (MTX) (Au @ SiO ₂ ) nanopartículas (NP) y LLLT sobre la lucha contra el cáncer de mama.

Las NP se sintetizaron y caracterizaron utilizando FTIR, TEM y DLS-Zeta. Las NP tenían morfología esférica con un diámetro medio de alrededor de 25 nm y carga positiva (+13,3 mV) mientras que después de la conjugación con FA y MTX su carga neta se redujo a alrededor de -19,7 mV.

Nuestros hallazgos en estudios de captación celular mostraron claramente una captación celular mejorada de NP después de NP cargadas con FA y MTX en ambas líneas celulares de cáncer de mama, especialmente en MDA-MB-231 debido a la alta expresión de receptores de folato. Los resultados indicaron que LLLT tuvo un efecto proliferativo en ambas líneas celulares de cáncer de mama, pero en presencia de nanopartículas dirigidas contra el cáncer de mama diseñadas, la eficacia de la terapia quimio-fototérmica combinada aumentó significativamente usando el ensayo MTT (p <0.05), tinción DAPI y Hallazgos del ciclo celular. El efecto apoptótico más alto en las líneas celulares de cáncer de mama se observó en las células expuestas a una combinación de Au @ SiO ₂ cargado con MTX-FA NP y LLLT demostradas por tinción DAPI y ciclo celular (aumentando la detención celular en subG0 / G1). En conjunto, una combinación de quimioterapia y LLLT mejora el potencial de la terapia del cáncer de mama con efectos secundarios mínimos.

Introducción

El cáncer de mama (CM), como la mujer más frecuente, que afecta al cáncer ha informado recientemente con 1,7 millones de casos nuevos en todo el mundo [1]. Debido a su etiología complicada y mala respuesta al tratamiento, a menudo se sabe que es la causa central de muertes de mujeres asociadas al cáncer en todo el mundo [2, 3, 4, 5]. Se podía predecir que unas 40.000 mujeres en los Estados Unidos morirían de BC en 2014 [2, 6, 7] “(www.cancer.org)”. Con las 522.000 muertes en total, es la quinta causa de muerte por cáncer con alrededor de 800.000 casos en las regiones menos desarrolladas y aproximadamente la misma frecuencia en las regiones desarrolladas [1]. En los países asiáticos la mayor edad de inicio es entre los adultos de 40 o 50 años en comparación con los países occidentales, que es frecuente entre los 60-70 años [8]. Los principales factores de riesgo del cáncer de mama son el sexo femenino, los antecedentes familiares, la edad y las diferentes inclinaciones generativas, como el primer parto a la edad de más de 30 años, la menarquia temprana y la menopausia posterior y la nuliparidad [9].

El principal objetivo en la lucha contra el cáncer es desarrollar planes terapéuticos eficaces con baja toxicidad y alta especificidad para eliminar los tumores, principalmente sus metástasis, y favorecer la prevención de su recurrencia. Pero los enfoques de tratamiento del cáncer que se utilizan actualmente, como la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, mostraron varios efectos secundarios [10, 11, 12] y ninguno de ellos logró este objetivo [13, 14]

En las últimas décadas se han observado importantes luchas en el tratamiento del cáncer [15, 16]. Entre los enfoques terapéuticos populares actuales, la terapia térmica ha crecido como un método de tratamiento prospectivo [17]. Recientemente, la terapia fototérmica (PTT), como una terapia contra el cáncer potencialmente eficaz y no invasiva, ha atraído una atención significativa [18, 19]. El PTT basado en nanoestructuras fotoabsorbentes se ha convertido en una forma diferente a los métodos generales [20, 21]. En un PTT típico, que usa agentes de PTT para destruir el tumor obteniendo suficiente hipertermia (42 ° C) bajo irradiación láser (luz del infrarrojo cercano (NIR) en el rango de 700-1100 nm), se ha estudiado como un método muy preciso y método insignificantemente invasivo de tratamiento del cáncer [22,23,24,25,26,27,28].

Varias nanopartículas se han estudiado ampliamente como agentes de contraste de imágenes, portadores de administración de fármacos y transformadores de modalidades de energía, como láser, ondas de radio y ultrasonido, para fenómenos térmicos responsables de los efectos terapéuticos [29,30,31,32,33 , 34,35,36,37,38,39].

Las nanopartículas de oro han atraído una gran atención durante la última década debido a su alta resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR) y su fácil conjugación de superficie con biomoléculas [40]. Han revelado una capacidad de conversión fototérmica de alto rendimiento en el área NIR [41,42,43] sin efectos secundarios dañinos en los sistemas biológicos [44].

Aunque las nanopartículas de oro han sido reconocidas como un foto-sintetizador prometedor, pero debido a su escasa estabilidad fototérmica tras la irradiación repetitiva NIR, las nanopartículas de oro pierden gradualmente su capacidad de conversión fototérmica que limitaba su uso en la práctica clínica. Además, las nanopartículas de oro tampoco son buenos portadores de fármacos debido a su escasa capacidad de carga de fármacos y su perfil de liberación controlada de fármacos [45, 46]. Alternativamente, se sabía que la nanopartícula de sílice mesoporosa (MSN) era un portador apropiado de fármacos, ADN y proteínas debido a su mayor capacidad de carga de fármacos y la falta de contenidos tóxicos que se producían a partir de sus degradaciones. También tienen una gran área de superficie, tamaño controlable, volumen de poros altamente disponible y las características de superficie deseadas se aplican para una modificación [47].

Las nanopartículas después de la conjugación con un agente quimioterapéutico y un ligando dirigido al cáncer pueden inhibir las desventajas de la quimioterapia de rutina, como la administración inespecífica, la escasa solubilidad en agua y los índices terapéuticos bajos [48, 49].

Los agentes que muestran propiedades quimioterapéuticas, como la doxorrubicina, la ciclofosfamida, el metotrexato, el fluorouracilo y el docetaxel, se utilizan solos o en combinación como tratamientos básicos principales, o con la ayuda de otros tratamientos como el PTT. La mayoría de los pacientes con cáncer experimentan efectos adversos de los medicamentos de quimioterapia debido a su distribución no precisa en el cuerpo del paciente que afecta a todos los órganos. Estos medicamentos dañan algunas de las células normales de crecimiento rápido, por ejemplo, las células sanguíneas, las células de la membrana mucosa que cubren los órganos internos y los folículos pilosos [50,51,52,53].

El metotrexato (MTX) ha sido el fármaco utilizado con más frecuencia para la artritis reumatoide y varios tipos de tumores como piel, pulmón, cabeza y cuello y mama [54, 55]. Inhibe la dihidrofolato reductasa (DHFR), la enzima que contribuye a la producción de tetrahidrofolato y sus subproductos que son necesarios para la síntesis de timidilato y purina y ambos son vitales para el crecimiento celular y la proliferación celular. Por lo tanto, bloquear el metotrexato de DHFR previene la síntesis de 4 macromoléculas básicas:ADN, ARN, timidilatos y proteínas [56].

Desafortunadamente, al igual que la mayoría de los agentes de PTT convencionales, el principal desafío es lograr la acumulación selectiva de GNP en el tejido diana después de la inyección sistémica [57,58,59]. La terapia contra el cáncer dirigida permite la administración de fármacos quimioterapéuticos a células cancerosas específicas al tiempo que disminuye la exposición de las células sanas normales. Esto nos llevó a administrar una mayor dosis de fármaco a las células cancerosas con menor toxicidad sistémica. Las nanopartículas dirigidas a ligandos son marcadores de células cancerosas identificados con precisión, que se expresan en gran medida en la superficie de las células cancerosas [40].

El ácido fólico (folato o vitamina B9) es un material clave para el crecimiento y el metabolismo celular. Debido a la gran afinidad del folato por las proteínas receptoras de folato, se utiliza como elemento para atacar el cáncer. El receptor de folato, como biomarcador tumoral, se sobreexpresa en células malignas definidas como cáncer de mama, ovario, pulmón, riñón, cerebro y colon [60]. Los sistemas de administración de fármacos conjugados con folato mejoran la captación celular del fármaco mediante endocitosis [61].

Materiales y método

Reactivos y materiales

Usamos agua bidestilada (Ghazi Company, Tabriz, Irán) y reactivos químicos de grado analítico para nuestros experimentos. Se adquirieron varios reactivos de Sigma-Aldrich Company, incluidos:ortosilicato de tetraetilo (TEOS, 98%), (3-mercaptopropil) trimetoxisilano (MPTES, 95% de pureza), ácido fólico y rodamina B. Se compró un grupo de materiales a Merck Co:ácido clorhídrico (HCl, 37%), solución de amoníaco (25%), hidróxido de sodio tolueno (NaOH, 98%) y otros disolventes. MTX se compró a Zahravi Farma Company, Tabriz, Irán.

Instrumentación

En este estudio, para analizar el tamaño y la morfología de las partículas, se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) (LEO 906, Alemania). Preparamos alrededor de 100μL de nuestras nanopartículas suspendidas en solución acuosa a temperatura ambiente. La solución se transfirió a una película de carbono revestida sobre una rejilla de cobre de TEM con posterior liofilización y se observó a 80 KV. La determinación del tamaño de partícula se realizó mediante medición DLS (dispersión dinámica de luz) a 25 ° C usando un Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido. Las mediciones del potencial Zeta para las NP preparadas se realizaron mediante espectroscopía de correlación de fotones (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, Reino Unido). Se empleó un espectrofotómetro UV-Vis de doble haz (UV-1601 PC modelo SHIMADZU, Kyoto, Japón) para medir la absorbancia mediante una cubeta de cuarzo de 700 μL con una longitud de trayectoria de 10 mm. Se utilizó la espectroscopia infrarroja de transformadas de Fourier (FTIR) del espectrómetro Bruker Tensor 27, Alemania, para la realización del método de pastillas de KBr. Las medidas de pH se realizaron con un medidor de pH Metrohm 713 (Herisau, Suiza). Para las agitaciones se utilizó el agitador mecánico Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Alemania). La eficiencia de encapsulación de FA y MTX se calculó utilizando el sistema HPLC que constaba del módulo de separación Waters 2690 equipado con un detector de UV-vis Detectores Waters 2500 Pump 1000 (Waters, Milford, MA). La separación cromatográfica se implementó a temperatura ambiente utilizando columnas de cromatografía Bondapak C18 m (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Irlanda).

Preparación de Au @ SiO ₂ Nanopartículas

El SiO ₂ Las NP se sintetizaron basándose en el método sol-gel informado anteriormente [62, 63]. En el siguiente paso, se prepararon nanopartículas recubiertas de sílice funcionalizadas con tiol (TFSNP) de acuerdo con el método mencionado en nuestro estudio anterior [64]. Las nanopartículas de Au se produjeron mediante un método de reducción de citrato (método de Turkevich) [65]. Finalmente, la superficie de los TFSNP fue cubierta por AuNP. Al principio, los TFSNP se dispersaron en agua con la ayuda del sonicador de baño durante al menos una hora y se agregaron a la solución de AuNP y se sonicaron durante 30 minutos adicionales. La reacción se realizó en condiciones de oscuridad durante dos días con agitación dinámica a 25ºC. El Au @ SiO ₂ Las nanopartículas con apariencia de color púrpura se recolectaron por centrifugación (10000 rpm, 10 min) y se secaron en un horno de vacío.

Carga de MTX y FA

MTX y FA se cargaron en Au @ SiO ₂ nanovehículo como sigue:se añadió MTX (10 mg) a una suspensión bien dispersa de nanovehículo en PBS (5 mg / mL, pH 7,4) y se agitó moderadamente a temperatura ambiente durante un día en condiciones de oscuridad. El MTX cargó Au @ SiO ₂ El nanoportador se recogió mediante centrifugación. Se recogió el sobrenadante para medir el MTX descargado. Luego MTX cargó Au @ SiO ₂ El nanoportador se dispersó en PBS (5 mg / ml, pH 7,4) y se añadieron FA (10 mg) a la solución y se agitó moderadamente a temperatura ambiente durante otro día en condiciones de oscuridad. El FA-MTX cargó Au @ SiO ₂ El nanoportador se recogió por centrifugación y el sobrenadante se separó para el cálculo del FA no unido en el paso final. El FA-MTX cargó Au @ SiO ₂ El nanoportador se liofilizó y se almacenó para los siguientes experimentos. Las cantidades de MTX y FA no unidos se calcularon mediante el método de HPLC según el protocolo informado anteriormente [66]. Se disolvió ácido fólico en hidróxido de amonio (10% en peso) y se diluyó con la fase móvil. El tiempo de retención para MTX y ácido fólico fue de 10,5 y 5,95 min, respectivamente. Se aplicaron muestras por triplicado. La eficiencia de carga de fármaco (DLE) se calculó mediante las siguientes fórmulas:

$$ ee \ left (\% \ right) =\ frac {\ left (inicial \ total \ medicamentos- No absorbido \ medicamentos \ derecha)} {Inicial \ total \ medicamentos} \ veces 100 $$ (1)

Selección y cultivo de líneas celulares

Se seleccionaron dos líneas celulares de cáncer de mama de interés con niveles de expresión en la superficie del receptor de folato (FR) [67], incluidos MCF-7 y MDA-MB-231, y se compraron en el Pasteur Cell Bank (Teherán, Irán) para las investigaciones de citotoxicidad. Las líneas celulares seleccionadas se cultivaron en medio completo que contenía RPMI1640 (Thermoscientific), 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de Penstrep (Thermoscientific) en condiciones térmicas y atmosféricas de 37 ° C, 5% CO ₂ y 95% de humedad.

Ensayo de citotoxicidad celular

Se realizaron ensayos de viabilidad celular para medir la proliferación celular después de diferentes tratamientos con NP sin irradiación con láser. Brevemente:las células MCF-7 o MDA-MB-231 se sembraron en 96 microplacas con una densidad celular de 1,5 × 10 ⁴ durante 24 h, luego las células se trataron con MTX, Au @ SiO ₂ y FA-MTX cargado Au @ SiO ₂ NP. Las células sin tratamiento se consideraron control. En el siguiente paso, se añadió a las células el tinte de tetrazolio MTT (Sigma) a concentraciones finales de 5 μg / ml y se incubaron a 37 ° C durante 4 h. Luego, se eliminó la solución de MTT y los cristales de Furmazan sedimentados se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) (BioIdea, Irán) con agitación suave durante 10 min. Finalmente, se midió la absorbancia en 570 nm mediante un lector de ELISA. La viabilidad de las células se normalizó para controlar las células y el fondo se eliminó mediante la resta de las medidas del blanco.

Terapia con láser in vitro

Para la terapia con láser de bajo nivel (LLLT), se utilizó un láser NIR de longitud de onda de 810 nm (láser de diodo Mustang 2000, Rusia) con una dosis de potencia de salida de 185 mW para la destrucción de las células cancerosas. Al principio, células MCF-7 y MDA-MB 231 con una densidad celular de 1,5 × 10 ⁴ tratado con el Au @ SiO ₂ y FA-MTX cargado Au @ SiO ₂ Luego, las NP fueron expuestas a irradiación láser con diferentes dosis de láser (30, 60, 75, 90 y 105 J / cm ² ) y tiempo de exposición fijo (139 seg). Las células expuestas solo a irradiación láser (sin NP) y las células sin NP y tratamientos con láser se consideraron control positivo y negativo, respectivamente. Después de 24 h de irradiación con láser, se midió la viabilidad celular mediante el método de ensayo MTT [64].

Ensayo de captación celular de nanopartículas

Una verificación detallada de la internalización de las células NP es esencial para confirmar el efecto específico del nanoportador de superficie modificada para cada línea celular. En el presente trabajo, empleamos tanto la citometría de flujo como la microscopía cuantitativa y de fluorescencia para verificar cualitativamente la absorción de NP por las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231.

Para la suspensión de NP, se añadió la solución de rodamina B (RhoD) en PBS junto con agitación durante 24 h a temperatura ambiente y cuarto oscuro (evitando el blanqueo). Luego, las NP cargadas con RhoD se separaron mediante un filtro Amicon con límite de peso molecular nominal (NMWL) de 30 kDa y se centrifugaron durante 15 min a 5000 rpm y se lavaron con tampón PBS para eliminar la RhoD no unida. Las células se sembraron en placas a una densidad de 5 × 10 ⁵ Per bien y dejar que llegue a la confluencia. Las células se trataron con NP cargadas con Rhodamina B durante 30, 90 y 180 minutos, se usaron células no tratadas como control. Posteriormente, las células se tripsinizaron y lavaron con PBS, y luego se cuantificó la fluorescencia con análisis de citometría de flujo (citómetro de flujo BD Biosciences FCASCalibur; BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.). La captación intracelular de NP o NPD marcadas con rodamina B se confirmó además mediante microscopía de fluorescencia. Las células MCF-7 y MDA-MB-231 se cultivaron en cubreobjetos y, después de 24 h, las células se trataron con Au @ SiO ₂ libre. NP y MTX-FA cargado Au @ SiO ₂ NP. Después de la incubación durante 30, 90 y 180 minutos, las células se lavaron con PBS y se observó la captación del nanoportador marcado con rodamina B utilizando un microscopio de fluorescencia (microscopio Olympus Bh2-FCA, Japón).

Estudio de apoptosis por microscopía de fluorescencia

Un método para el estudio cualitativo nuclear de la apoptosis es un colorante fluorescente DAPI que se une al ADN y es detectable por microscopía apropiada. Utilizamos un protocolo como se informó anteriormente para la tinción DAPI [68], en breve:las células MCF-7 o MDA-MB-231 se sembraron en recipientes de formato de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁵ y déjelos adherir y crecer durante 24 horas. Después del tratamiento con MTX, Au @ SiO ₂ NP y MTX-FA cargado Au @ SiO ₂ NP con y sin tratamiento con láser, las células se lavaron con PBS (Sigma) y luego se sometieron a fijación con formaldehído al 10% (Merck), a continuación:las células se permeabilizaron con Triton X-100 (Sigma) durante 15 minutos. Después de los lavados adecuados, las células se tiñeron con DAPI (sigma) durante 5 min. Finalmente, los núcleos apoptóticos (fragmentados o arrugados) fueron visualizados por un microscopio de fluorescencia (Olympus). Las células sin ningún tratamiento se consideraron como control negativo y las células recibieron solo irradiación con láser como control positivo.

Investigaciones de alteraciones del ciclo celular

Las distribuciones del ciclo celular de MCF-7 y MDA-MB-231 se determinaron mediante análisis de citometría de flujo. De esta manera, las células se sembraron con poblaciones iniciales de 5 × 10 ⁵ y se dejó que alcanzara el 80% de confluencia. Posteriormente, las células tratadas con MTX, Au @ SiO ₂ NP y MTX-FA cargado Au @ SiO ₂ Se realizaron NP con y sin irradiación láser. Las células sin ningún tratamiento se consideraron como control negativo y las células recibieron solo irradiación con láser como control positivo. Luego, las células se recolectaron mediante tripsinización seguida de lavados adecuados con PBS. A continuación, las células se fijaron con etanol (Merck) durante 48 horas. En el siguiente paso, las células fijadas se lavaron, luego se trataron con Ribonucleasa A (Cinaclone), con posterior adición de yoduro de propidio (PI) (Sigma) en la oscuridad. Las señales de fluorescencia fueron detectadas por el conjunto FACS de Beckton Dicinson Company.

Estadísticas del estudio

Los experimentos para cada paso se han realizado en tres repeticiones y los resultados se informaron como media ± DE. El ANOVA se utilizó para comparar la significancia entre los grupos. Las diferencias fueron significados reflejados donde el valor de probabilidad se calculó <0.05 por el software SPSS.

Resultados y discusión

Caracterización de NP sintetizadas

El Au @ SiO ₂ Las NP se produjeron en cuatro pasos:1-síntesis de SiO ₂ nanopartículas, 2-adición de ligador que contiene tiol a NP de SiO2, 3-síntesis de nanopartículas de oro y 4-unión de las nanopartículas de oro a la superficie de complejos de SiO2-ligador (Fig. 1). La síntesis exitosa de Au @ SiO ₂ fue confirmado por FTIR (Fig. 2a). El pico Si-O-Si apareció alrededor de 1088 cm ^-1 . Un pico ancho a 3000–3700 y 803 cm ^–1 se atribuye al estiramiento y flexión fuera del plano de los grupos O – H de silanol libre, respectivamente. La vibración de estiramiento alifático C – H se mostró como un pico fuerte a 2950 cm ^–1 . El C – O de tres grupos de metoxisilano se mostró mediante un pico a 1191 cm ^–1 .

El esquema sintético paso a paso para la preparación de folato y metotrexato biocompatible cargado Au @ SiO ₂ Nanopartículas NP

un ) Espectros FTIR de Au @ SiO ₂ nanopartículas, b ) distribución de tamaño de Au @ SiO ₂ conjugado con FA-MTX NP medidos por dispersión dinámica de luz (DLS) c ) El potencial zeta de Au @ SiO ₂ y Au @ SiO ₂ conjugado con FA-MTX NP medidas por dispersión dinámica de luz (DLS) a pH =7,4 y T =25 ° C, d ) Cromatograma de MTX y FA descargados separados de Au @ SiO ₂ conjugado con FA-MTX NP medido simultáneamente por el método HPLC

Las mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) indicaron que FA-MTX conjugado Au @ SiO ₂ El tamaño de las NP estaba en el rango nanométrico (105 ± 2,3 nm) con una distribución de tamaño estrecha (Fig. 2b).

El potencial zeta es un parámetro fisicoquímico importante que influye en la estabilidad de las nanosuspensiones. Los valores de potencial zeta extremadamente positivos o negativos provocan fuerzas repulsivas mayores. Por otro lado, la alta carga de las partículas, ya sean positivas o negativas, hace que los NP sean absorbidos por los fagocitos del hígado y eliminados por el organismo. En el caso de una estabilización electrostática y estérica combinada, es deseable un potencial zeta mínimo de ± 20 mV [69, 70, 71]. Los datos del potencial zeta de las NP se compararon antes y después de la carga con MTX-FA a pH =7,4 y T =25 ° C (Fig. 2c). Los potenciales zeta obtenidos de Au @ SiO ₂ Los NP fueron de +13,3 mV que después de la carga de fármaco dual disminuyeron a -19,7 mV que estaban en el rango deseable. El MTX y el FA tenían una carga neta negativa a pH (7,4) por encima de su pka (3,8 y 4,8, 3,5 y 4,3), debido a la desprotonación de dos grupos de ácido carboxílico en su estructura ([72], https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). Por lo tanto, después de la carga simultánea de MTX y FA en Au @ SiO ₂ NP, la carga neta se volvió negativa.

El análisis TEM proporciona el tamaño de partícula individual definido. Las nanopartículas de Au se vieron como esferas oscuras dispersas en las NP de SiO2 como una capa de lecho gris. Las imágenes TEM confirmaron que las NP de Au @ SiO2 se sintetizaron con una forma esférica homogénea en la que el tamaño medio de las partículas era de alrededor de 25 nm (Fig. 3).

Imagen TEM de Au @ SiO ₂ nanopartículas

Carga de medicamentos

En este documento, el folato está mediando el aumento de la captación de GNP en ciertos tipos de células cancerosas que sobreexpresan el receptor de folato a través de la endocitosis mediada por el receptor para superar la baja eficacia de internalización de los GNP, por lo tanto, el receptor de folato conocido como marcador tumoral y el folato se utilizan cada vez más para los tumores. segmentación [67, 73].

Después de la conjugación de moléculas de MTX y FA en Au @ SiO ₂ NP, el potencial zeta cambió de +13,3 a -19,7 mV. Los valores estimados de pKa de los dos restos de ácido carboxílico de MTX son 3,8, 4,8 y FA es 3,5 y 4,3 [72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Por lo tanto, debido a la desprotonación de dos grupos de ácido carboxílico de MTX y FA a pH 7,4 que está por encima de su pka, la carga neta se volvió negativa e indica la conjugación exitosa de MTX y FA en Au @ SiO _{2 NP. De Ying Tian et al muestran que la carga de MTX en nanopartículas de Au de 18 y 30 mm de diámetro son 15 ± 0,4% y 10 ± 1,0%, respectivamente [74]. En este estudio, FA y MTX se cargaron en NP de Au @ SiO2 con una eficiencia de encapsulación de 22,6 y 77,5%, respectivamente. El cromatograma del pico de evaluación simultáneo de MTX y FA se muestra en la Fig. 2d.}

Captación de células

Debido a que los agentes fototérmicos intracelulares pueden mejorar la eficacia de la terapia fototérmica del cáncer [75], se ha creído que es necesaria la internalización celular de los materiales fototérmicos. In vitro La prueba de captación celular se realizó utilizando células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano, conocidas por sobreexpresar en gran medida el receptor de folato [40]. Estudiar el papel de FA como agente de focalización y la eficiencia del recubrimiento de la superficie en la absorción de Au @ SiO ₂ Las NP de las células diana, las células MCF-7 y MDA-MB-231 se trataron con NP de Au @ SiO2 y NP de Au @ SiO2 cargadas con MTX-FA. Los resultados de intensidad fluorescente media de la captación celular se muestran en la Fig. 4. Los resultados mostraron que la captación de NP de Au @ SiO2 tanto en MCF-7 como en MDA-MB-231 se incrementó durante el tiempo de cultivo celular para todas las muestras (Figs. 4 y 5). ). Además, después de la decoración de la superficie de NP de Au @ SiO2 con MTX y FA, la captación de células aumentó significativamente tanto en MCF-7 como en MDA-MB-231 como células que expresan el receptor de folato. La captación de NP de Au @ SiO2 cargadas con MTX-FA en las células MDA-MB-231 fue mayor que la de MCF-7. Debido a que las células MDA-MB-231 expresan niveles más altos de receptores de folato de superficie, una gran parte de las NP dirigidas al receptor de folato se ingresó a través del mecanismo de endocitosis mediado por receptor, lo que resultó en una mayor captación celular. En otro estudio, el aumento de la internalización celular de los NP conjugados con folato se está produciendo solo en las células cancerosas que sobreexpresan el aHFR y no en las células sanas que tienen menos expresión de aHFR en la superficie celular [40]. La conjugación de NP de Au @ SiO2 con FA puede facilitar la absorción celular de NP y metotrexato, lo que aumenta la toxicidad hacia las células MDA-MB-231 [76].

Ensayo cuantitativo de captación celular de Au @ SiO ₂ marcado con rodamina B nanopartículas (NP) o Au @ SiO ₂ cargadas con MTX-FA marcada con rodamina B nanopartículas (NPD) en MCF-7 ( a ) y MDA-MB-231 ( b ) líneas celulares para duraciones de exposición de 0,5 h, 1,5 hy 3 h obtenidas por citometría de flujo. Se emplearon células no tratadas de ambas líneas celulares como control negativo. c Comparación de la intensidad fluorescente media de Au @ SiO ₂ marcado con rodamina B nanopartículas (NP) o Au @ SiO ₂ cargadas con MTX-FA marcada con rodamina B nanopartículas (NPD) para duraciones de exposición de 0,5 h, 1,5 hy 3 h obtenidas por citometría de flujo

A Ensayo de captación celular cualitativa utilizando Au @ SiO ₂ marcado con rodamina B nanopartículas (NP) en MCF7 con duraciones de exposición de 30 ( a ), 90 ( b ) y 180 ( c ) min o con MTX-FA marcado con rodamina B y Au @ SiO ₂ nanopartículas (NPD) con una duración de exposición de 30 ( d ), 90 ( e ) y 180 ( f ) min y ( B ) Ensayo cualitativo de captación celular utilizando Au @ SiO ₂ marcado con rodamina B nanopartículas (NP) en MDA-MB-231 con duraciones de exposición de 30 ( a ), 90 ( b ) y 180 ( c ) min o con MTX-FA marcado con rodamina B y Au @ SiO ₂ nanopartículas (NPD) con una duración de exposición de 30 ( d ), 90 ( e ) y 180 ( f ) min capturado por microscopía fluorescente

Ensayo de citotoxicidad

Estudios de citotoxicidad celular in vitro del MTX libre, Au @ SiO ₂ en blanco NP y MTX-FA conjugado Au @ SiO ₂ Las NP se evaluaron mediante ensayo MTT durante 24, 48 y 72 h (Fig. 6). Los resultados del ensayo MTT mostraron que Au @ SiO ₂ Las NP no tuvieron ningún efecto citotóxico sobre las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231. Además, para comparar los efectos de citotoxicidad tanto del MTX libre como del Au @ SiO ₂ conjugado con MTX-FA NP, se utilizó la misma concentración de MTX (25, 50, 100 y 200μg / mL) para todos los tiempos de tratamiento. Los resultados de citotoxicidad celular indican que el MTX libre o el MTX-FA conjugado Au @ SiO ₂ Los NP mostraron una tasa de mortalidad de alrededor del 10-25% en ambas líneas celulares después de 24 h de tratamiento. Estudios anteriores informaron del efecto proliferativo de las nanopartículas de oro en diferentes líneas celulares como las células de osteoblastos murinos MC3T3-E1 y las células madre del ligamento periodontal humano en condiciones in vitro. Nuestros resultados están en línea con estos estudios y las Figuras 6a yb muestran el efecto proliferativo de las NP de Au @ SiO2 libres. Por lo tanto, el efecto citotóxico igual de las nanopartículas de Au @ SiO2 (NPD) cargadas con MTX y FA-MTX puede deberse a este fenómeno [77, 78].

un MCF-7 y ( b ) Tasas de inhibición del crecimiento de las células MDA-MB-231 después del tratamiento con diferentes concentraciones de NP, MTX y FA-MTX cargadas con Au @ SiO ₂ nanopartículas (NPD) después de un tiempo de exposición de 24, 48 y 72 h

Irradiación láser

En este estudio, la viabilidad celular de las células MCF-7 y MDA-MB 231 tratadas con Au @ SiO ₂ NP y MTX-FA cargado Au @ SiO ₂ NP después de la irradiación con láser con dosis en el rango de 30-105 J / cm ² fue investigado por ensayo MTT. La tasa de mortalidad de las células MCF-7 y MDA-MB-231 tratadas con Au @ SiO ₂ cargado con MTX-FA NP (la concentración de MTX fue de 100 μg / ml) después de LLLT a una dosis de 75 J / cm ² fueron alrededor del 39 y 45,5%, respectivamente. Mientras que en las mismas condiciones las células tratadas con Au @ SiO ₂ Las NP después de la irradiación con láser o con láser solo no mostraron una muerte celular obvia. También aumentando la dosis de láser a 105 J / cm ² la tasa de mortalidad de ambas líneas celulares aumentó a 60-75%, mientras que ambas células se trataron con Au @ SiO ₂ Las NP + láser o láser solo a la misma dosis de irradiación no mostraron ningún efecto citotóxico. El valor de IC50 para las células MCF-7 y MDA-MB-231 después de la terapia de combinación con Au @ SiO ₂ cargado con MTX-FA Se obtuvieron NP (dosis de MTX de 100 μg / ml) y LLLT a una dosis de 90 y 75 J / cm ² , respectivamente. Por otro lado, la tasa de mortalidad de MTX y MTX-FA cargados con Au @ SiO ₂ Las NP sin irradiación con láser a una dosis de MTX de 100 μg / ml (dosis seleccionada para el estudio de terapia con láser) estuvieron entre el 15 y el 25% en ambas líneas celulares. Estos resultados indicaron que la combinación de Au @ SiO ₂ cargado con MTX-FA NPs and laser therapy showed a synergistic effect in both cell lines and significantly decreased the cell viability (p <0.001) compared to cells received only laser irradiation. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).

A comparison of cell growth inhibition rates exposed to different laser powers (30, 60, 75, 90 and 105 J/cm² ) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h

Apoptosis study by DAPI

The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO₂ NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO₂ NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO₂ NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO₂ NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm² , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO₂ NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.

Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )

Cell cycle

Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO₂ NPs and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs either in combination with LLLT (75 J/cm² ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm² laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.

Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cells. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution

Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.

Conclusiones

In this study MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO₂ nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.