Detección de microARN-335-5p en una superficie de electrodo interdigitado para determinar la gravedad de los aneurismas de la aorta abdominal

Resultados y discusión

Fabricación del sensor IDE y análisis de superficie

El estudio actual utilizó miRNA-335-5p como herramienta para dilucidar la gravedad de AAA mediante análisis interactivo en un sensor de electrodo interdigitado (IDE) (Fig. 1). Para el análisis interactivo con la sonda y el objetivo diseñado a partir de la longitud completa de miARN-335-5p, se diseñó y fabricó una superficie IDE utilizando técnicas fotolitográficas convencionales. Las modificaciones de la superficie paso a paso se llevaron a cabo y se midieron con un amperímetro (Fig. 2b, c). La alineación de la máscara diseñada para la fabricación de IDE y la uniformidad se confirmaron mediante análisis de nanoprofilometría 3D de alta resolución. Esta observación confirmó que la fabricación y la distancia entre cada dedo estaban bien alineadas (Fig. 2d). Los IDE tienen un tamaño de electrodo de ~ 100 μm con un espaciado de ~ 85 μm, y se forma una gran red intercalada con millones de biomarcadores en serie / paralelo. Para asegurar el éxito de los IDE fabricados, utilizamos diferentes dispositivos desnudos para determinar la reproducibilidad bajo el sistema dieléctrico. Este sistema mide las vibraciones moleculares entre los dielectrodos causadas por el momento dipolar (Fig. 2c). Este IDE dieléctrico es un sistema bien aceptado que se ha utilizado ampliamente para diferentes análisis biomoleculares y químicos [15, 25, 26, 27, 28]. En este estudio, todas las modificaciones químicas de la superficie y los análisis interactivos se midieron mediante el modo de corriente I-V.

Representación de la detección de miRNA-335-5p en un IDE. La sonda y el objetivo diseñados se muestran junto con la formación de dúplex en la superficie IDE

Medidas de superficie en un IDE. un Pasos de medición. b Modo de medición. Se muestran el patrón IDE y el sistema de conexión. También se muestra una medición dieléctrica. c Mecanismo de superficie durante la medición. Se muestra un momento dipolar. d El perfil de perfilometría 3D del IDE fabricado

Ensamblaje molecular de superficie de alta densidad:estrategia de estreptavidina-biotina

Se ha demostrado que las uniones moleculares de alta densidad en la superficie de detección o los biochips son cruciales y dependen en gran medida de la funcionalización de la superficie [29, 30]. Este estudio tuvo como objetivo determinar la superficie adecuada necesaria para un gran número de adaptaciones moleculares, que es obligatorio para la expresión, el descubrimiento y el análisis molecular de genes. Para estas posibles aplicaciones, la generación de superficies de sistemas analíticos requiere el acoplamiento adecuado de moléculas para inmovilizarlas en formatos adecuados. Estas superficies de material se estudiaron para investigar el mecanismo de interacción de la superficie, ya que son baratas y proporcionan diversos grados de densidades de empaquetamiento, morfología y espesor. Este hallazgo facilitará la correcta unión de moléculas y evitará la pérdida de actividad biomolecular. Además, la orientación correcta de la inmovilización biomolecular se conserva con la confirmación estructural secundaria adecuada.

Para lograr moléculas de alta densidad en la superficie, inicialmente lavamos a fondo la superficie de sílice con una solución alcalina y la modificamos con CDI. Para capturar altos niveles de sondas de biotinilación en la superficie de CDI, inmovilizamos la sonda con estreptavidina. La estreptavidina es una proteína tetravalente con cuatro sitios para unirse a la biotina y se considera una molécula de alta afinidad en las ciencias biológicas [31, 32]. La superficie de IDE tenía un nivel de corriente de 2.08E− 10 A, y después de la fijación de CDI, se incrementó a 9.2E− 06 A. Este hallazgo indica claramente que la superficie de IDE modificada por CDI es apropiada para nuestros análisis. Cuando se añadió estreptavidina, el nivel actual se incrementó aún más a 2,36E - 05 A. Con esta estrategia, inmovilizamos un mayor número de sondas biotiniladas diseñadas a partir de miRNA-335-5p de longitud completa en la superficie IDE (Fig. 3a). Las interacciones de biotina se llevaron a cabo después de la etapa de bloqueo en la superficie IDE para enmascarar las áreas que no reaccionaron. Con cada modificación de la superficie, se determinaron los cambios en la corriente (Fig. 3b). Como se muestra en la Fig.3c, después de la adición de etanolamina, los cambios de corriente fueron 2.53E - 05 A, y cuando se agregó 1 nM de secuencia de captura biotinilada, el nivel de la corriente se redujo a 1.29E - 08 A. Este cambio en la corriente confirmó la inmovilización de la sonda de captura en la superficie de detección del IDE. Generalmente, un oligonucleótido monocatenario lleva una carga más negativa con la cadena principal de fosfato 5-carbonatado expuesta (sonda), mientras que la carga neta de etanolamina es neutra, como lo indica el proveedor. Esta gran diferencia de carga resultó en una variación aparente en la corriente medida, como se muestra en la Fig. 3c. Además, este parámetro se revirtió de nuevo tras la formación de dúplex con la hebra diana. Este hallazgo se debe a la reducción en la exposición de la cadena principal de fosfato, y las cargas positivas adicionales se originan en las nucleobases en la cadena de miARN (Fig. 4a).

un Estructura secundaria predicha del miRNA-335-5p. El miARN-335-5p de longitud completa se muestra con las regiones de tallo y bucle. Se indica la región objetivo seleccionada para el análisis interactivo. b Mediciones I-V en el IDE para las modificaciones químicas y biológicas de la superficie (círculo negro, desnudo; círculo rojo, CDI; círculo azul oscuro, estreptavidina; círculo verde, etanolamina). La figura insertada se muestra esquemáticamente. c Mediciones de I-V en el IDE para el accesorio de la sonda. (círculo verde, etanolamina; círculo rojo oscuro, sonda). La imagen de la complicación AAA se muestra como el recuadro de la figura

Análisis interactivo de la sonda y el objetivo. un Interacción de dosis más alta de la sonda y miARN-335-5p (diana). (círculo rojo oscuro, sonda; círculo negro, objetivo). b Análisis dependiente de la dosis de miARN-335-5p. Pruebas desde el femtomolar inferior al rango nanomolar inferior. (círculo rojo oscuro, sonda; círculo naranja, 1 fM; círculo azul, 10 fM; círculo verde, 100 fM; círculo violeta, 1 pM; círculo rosa, 10 pM; círculo azul claro, 100 pM; círculo negro, 1 nM)

Análisis interactivo dependiente de la dosis en el IDE

Tras la unión de la sonda biotinilada en la superficie de detección, se realizó el análisis interactivo del objetivo con diferentes dosis. Esta validación se realizó desde el rango femtomolar bajo hasta el rango nanomolar bajo. Para asegurar este rango, realizamos el análisis preliminar con 1 nM de secuencias diana de miARN-335-5p. Después de la adición de 1 nM de la secuencia de miARN-335-5p diana en la superficie modificada con la sonda de captura, el nivel de corriente se cambió de 1,29 E-08 A a 1,29E-07 A (Fig. 4a); este resultado indicó que se produjo la hibridación entre la sonda de captura y la secuencia diana. Después de esta confirmación, para determinar el límite de detección, titulamos la secuencia objetivo de 1 fM a 1 nM, que cayó de forma independiente en las superficies modificadas con la sonda de captura. Los cambios actuales se detectaron antes y después de la inmovilización. Las diferencias en la corriente para las hibridaciones de 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM y 1 nM fueron 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 y 11,61E - 08 A, respectivamente. Según los resultados obtenidos, se detectaron cambios de corriente claros dependientes de la dosis en todas las concentraciones probadas de la secuencia objetivo (Fig. 4b).

Alto rendimiento analítico:sensibilidad, especificidad y reproducibilidad

Sobre la base de los resultados anteriores con incrementos dependientes de la concentración, se realizó un análisis de regresión lineal. La sensibilidad de la detección se estimó mediante el cálculo de 3σ, y cayó a 1 fM (Fig. 5a, b). La concentración fue menor de 1 fM, mostrando la señal de fondo y valores más bajos. Además, se realizó un análisis de especificidad para discriminar las secuencias diana de las secuencias no complementarias y con desajustes simples y triples. Era evidente que la sonda diseñada mostró una reacción más fuerte con las secuencias complementarias de miARN-335-5p perfectas que las otras secuencias (Fig. 6a). Una secuencia con un solo emparejamiento incorrecto dio como resultado una respuesta de corriente más alta que las secuencias no complementarias y con un triple desajuste debido a la formación de dúplex parcial por la secuencia de un solo emparejamiento incorrecto en la secuencia de la sonda. Se llevaron a cabo análisis de reproducibilidad con todas las modificaciones químicas y biológicas en la superficie IDE por triplicado, y se promediaron los datos. Los datos promediados indican que no hubo cambios significativos cuando se realizaron los diferentes experimentos (Fig. 6b). Además, para respaldar el rendimiento del IDE, se compararon las características de los métodos actualmente disponibles (Tabla 1).

Dependencia de la dosis. un Interacción dependiente de la dosis de miARN-335-5p con la sonda. b Análisis de regresión lineal con diferentes concentraciones de miARN-335-5p. LOD se consideró la concentración más baja de un analito frente a la señal de fondo (S / N =3:1)

Análisis de alto rendimiento. un Análisis de especificidad. Las secuencias diana se discriminaron de las secuencias no complementarias y las secuencias con desajuste simple y triple. b Prueba de reproducibilidad. Los valores promediados se muestran con experimentos por triplicado