Efectos protectores de los puntos de carbono derivados de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata contra Deinagkistrodon acutus Lesión renal aguda inducida por veneno

Resumen

Antecedentes

Como nanomaterial emergente, los puntos de carbono (CD) han sido objeto de una enorme atención para las aplicaciones biomédicas. Sin embargo, hay poca información disponible sobre su bioactividad para inhibir la lesión renal aguda (LRA) inducida por el veneno de serpiente.

Métodos

Este estudio informa sobre el desarrollo de un proceso de pirólisis verde en un solo paso para sintetizar CD utilizando Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) como único precursor, y su posible aplicación como protector contra Deinagkistrodon acutus (D. acutus) La LRA inducida por veneno se investigó por primera vez. El modelo AKI se estableció inyectando D. acutus veneno en la cavidad abdominal de los ratones y los posibles efectos protectores de PCC Carbonisata-CD (PCCC-CD) sobre anomalías renales que incluyen disfunción, reacciones inflamatorias, daño tisular y trombocitopenia en seis puntos de tiempo (1, 3 y 12 h, y 1, 2 y 5 días) fueron investigados.

Resultados

Estos resultados demostraron que los PCCC-CD inhibieron significativamente la disfunción renal (concentraciones reducidas de creatinina sérica (SCR), nitrógeno ureico en sangre (BUN), proteína total en orina (UTP) y microalbuminuria (MALB)) y la producción de quimioatrayente (proteína quimiotáctica de monocitos). 1 (MCP-1)), citocinas proinflamatorias (interleucina (IL) -1β) y citocinas antiinflamatorias (IL-10) en respuesta a la inyección intraperitoneal de D. acutus veneno. El efecto beneficioso de los PCCC-CD en los ratones envenenados fue similar al del cambio en la histología renal y la trombocitopenia.

Conclusiones

Estos resultados demostraron los notables efectos protectores de los PCCC-CD contra la IRA inducida por D. acutus veneno, que no solo ampliaría las aplicaciones biomédicas de la EC, sino que también proporcionaría un objetivo potencial para el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos para la IRA inducida por D. acutus envenenamiento por mordedura de serpiente.

Introducción

Deinagkistrodon acutus (D. acutus) , perteneciente a la familia Viperidae, es considerada una de las serpientes terrestres más peligrosas de China [1]. Envenenamiento por D. acutus se asocia con una serie de síntomas como hemorragia, trombocitopenia y posible daño directo al riñón [2, 3]. La lesión renal aguda (LRA) es el efecto sistémico más grave y la complicación común del envenenamiento por D. acutus que conduce directamente a una disfunción renal persistente y una alta morbilidad [4, 5]. El tratamiento tópico actual implica el uso de antídoto hiperinmune derivado de caballo como antídoto. Sin embargo, su eficacia es limitada para neutralizar el daño tisular local, especialmente en la aparición de LRA, y tiene varios efectos insatisfactorios, como reacciones anafilácticas y pirogénicas [6]. Además, el costo relativamente alto y la escasa estabilidad del antiveneno también contribuyen al tratamiento insatisfactorio de las personas mordidas por D. acutus , especialmente en las zonas silvestres o rurales [7,8,9]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de medicamentos complementarios eficaces, seguros y asequibles para el tratamiento de D. acutus AKI inducida por veneno.

Los puntos de carbono (CD), una nueva clase de nanomateriales de carbono con un tamaño <10 nm, se descubrieron por casualidad mediante la separación y purificación de nanotubos de carbono de pared simple en 2004 [10] y han atraído mucho interés durante la última década debido a su notable propiedades novedosas como biocompatibilidad apreciable, baja toxicidad, alta solubilidad en agua y abundantes materias primas [11,12,13]. La llegada de los CD ha contribuido a la investigación sobre el desarrollo de varios nanosistemas "inteligentes", incluidos principalmente los de bioimagen [14], biomedicina [15], administración de fármacos [16] y fotocatálisis [17].

Es de destacar que el desarrollo de EC con potencial de bioactividad inherente proporciona muchas estrategias para el descubrimiento de una nueva generación de fármacos para el control o tratamiento eficaz de algunas enfermedades debido a las notables ventajas antes mencionadas. En varias bioactividades, como las actividades antibacterianas para tratar la queratitis bacteriana [18], se han informado actividades hemostáticas [19], similares a las peroxidasa [20], anticancerígenas, antivirales y antiinflamatorias [21]. Estos efectos han atraído la atención de los científicos para estudiar aplicaciones farmacéuticas y biomédicas adicionales de los CD. Especialmente, las actividades de alivio de CD derivadas de Schizonepetae Spica Carbonisata [22] en D. acutus La hemorragia inducida por veneno ha proporcionado una nueva perspectiva sobre la investigación de los efectos beneficiosos de las EC sobre la IRA inducida por D. acutus mordedura de serpiente, que seguía siendo menos comprendida hasta ahora.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC) -CD se sintetiza mediante pirólisis directa de PCC (un tipo de medicina tradicional china, que se ha utilizado durante más de 1000 años) mediante un tratamiento de pirólisis de un solo paso. Los PCCC-CD son CD hipotóxicos que varían en diámetro de 1,2 a 4,8 nm. Se ha informado que los PCCC-CD poseen efectos hemostáticos notables, lo que no solo ha ampliado la aplicación biomédica de los CD, sino que también ha sido pionera en el esclarecimiento de la base material hemostática del PCCC [23]. Es de destacar que el PCCC, una medicina tradicional china preparada mediante el procesamiento de carbón vegetal, se registró por primera vez en las Recetas sagradas de Taiping para el alivio universal (978–992 d. C., en China). El perfil de seguridad y la eficacia terapéutica satisfactoria del PCCC, como la hemostasia y la antiinflamatoria, alentó su aplicación clínica continua durante más de 1000 años, lo que fue reconocido en la Farmacopea de la República Popular China (PPRC, 2015). Sin embargo, el estudio de las bioactividades subyacentes adicionales de los PCCC-CD ha sido un desafío. Especialmente, hay poca información sobre la inhibición de AKI inducida por D. acutus envenenamiento.

Además, se ha informado que el envenenamiento por mordedura de serpiente posiblemente pone en peligro la fisiología renal directamente a través de los componentes nefrotóxicos o mediante la activación o modulación de mediadores inmunes e inflamatorios [24]. Estos efectos afectan principalmente a los parámetros biomédicos [25] (creatinina sérica (SCR), nitrógeno ureico en sangre (BUN), concentración de proteína total en orina (UTP) y microalbuminuria (MALB)), citocinas inflamatorias (interleucina (IL) -1β), citocina antiinflamatoria (IL-10) y proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), el cambio en la histología renal y el recuento de plaquetas (PLT). En el presente estudio, sintetizamos PCCC-CD utilizando un método de pirólisis verde de un solo paso y, por primera vez, investigamos sus efectos protectores contra el desarrollo de estas anomalías en la LRA inducida por la inyección intraperitoneal de ratones con D. acutus veneno.

Material y métodos

Productos químicos

El material de PCC se compró a Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, China) y el PCCC se preparó en nuestro laboratorio. Se adquirieron membranas de diálisis con un peso molecular de 1000 Da de Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, China). El kit de recuento de células (CCK) -8 se adquirió de Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japón). El veneno de serpiente liofilizado de D. acutus fue proporcionado por An Ren Snake Farm (condado de Yujiang, Yingtan, Jiangxi, China) para uso experimental. Otros reactivos químicos de grado analítico se obtuvieron de Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, China). Se adquirieron kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de ratón MCP-1, IL-10 e IL-1β de Cloud-Clone Crop. (Wuhan, China). Todos los experimentos se realizaron con agua desionizada (DW).

Animales

Los protocolos de investigación y manejo de animales fueron apoyados y aprobados por el Comité Institucional de Ética de la Experimentación Animal de la Universidad de Medicina China de Beijing. Se compraron ratones Kunming machos (que pesaban 30,0 ± 2,0 g) de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., con un certificado de conformidad de animales de laboratorio, y se mantuvieron en jaulas a temperatura y humedad constantes en una luz de 12 h / ciclo oscuro con ad libitum acceso a alimentos y agua.

Preparación de la solución de veneno

El veneno liofilizado se disolvió en solución salina normal con una mezcla suave durante 20 minutos (concentración final:5 mg / ml) y se almacenó a -20 ° C hasta que se necesitó.

Preparación de PCCC-CD

El PCCC se preparó utilizando un método de pirólisis de un solo paso con PCC como único precursor de acuerdo con métodos anteriores [23]. Brevemente, las muestras de PCC se colocaron en crisoles de porcelana separados y se calentaron durante 1 ha 350 ° C en un horno precalentado. Después de enfriar a 30 ° C, los residuos negros homogéneos obtenidos se trituraron en un polvo fino y se hirvieron dos veces en agua a 100 ° C durante 1 hora cada vez. Luego, se recogió la solución filtrando previamente la suspensión a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 µm. Las impurezas no carbonosas se eliminaron mediante diálisis frente a DW durante 72 h (peso molecular retenido:1000 Da). La solución de PCCC-CD se concentró y se almacenó a 4 ° C hasta su uso. El diagrama de flujo de la Fig. 1 ilustra el proceso anterior.

Ilustración del proceso de formación de puntos de carbono (CD) de Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) por tratamiento de pirólisis

Caracterización de PCCC-CD

La morfología de los CD se estudió mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM-2100 electron, JEOL, Japón) con energía electrónica de 200 kV. Los detalles estructurales se examinaron usando TEM de alta resolución (HRTEM) usando un microscopio electrónico Tecnai G2 20 (FEI, EE. UU.). El espectro ultravioleta-visible (UV-Vis) y las propiedades de fluorescencia se registraron y midieron usando espectroscopía UV-Vis (CECIL, Cambridge, Reino Unido) y de fluorescencia (F-4500, Tokio, Japón), respectivamente. Se utilizó la espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) para analizar la información de los grupos funcionales de la superficie en una ventana espectral entre 400 y 4000 cm ^{- 1} .

Ensayos de citotoxicidad

Se usaron líneas de células T 293 de hepatocito L02 humano y riñón embrionario humano para evaluar la citotoxicidad potencial de PCCC-CD usando un ensayo CCK-8. Se cultivaron células L02 en medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%, mientras que se cultivaron células T 293 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, que contenía FBS al 10%. Ambas líneas celulares se incubaron a 37 ° C en CO ₂ humidificado al 5%. .

Se sembraron células T L02 y 293 a una densidad de 2,0 × 10 ⁴ células / pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivan a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ durante 24 h. Luego, ambos tipos de células se trataron con 100 μL de diferentes concentraciones (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 y 19,5 μg / mL) de las soluciones de PCCC-CD en medio libre de suero y se incubaron durante otras 24 h. Posteriormente, se eliminó el medio que contenía las PCCC-CD y las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La citotoxicidad se determinó leyendo la placa a 450 nm inmediatamente después de agregar 10 μL del reactivo CCK-8 e incubar durante 4 ha 37 ° C.

D. acutus AKI inducida por veneno y tratamiento

D. acutus Modelo AKI inducido por veneno

El modelo de ratón AKI se estableció inyectando intraperitonealmente a ratones con D. acutus veneno de serpiente. Los ratones se dividieron aleatoriamente en los siguientes cinco grupos de 36 animales cada uno:control; modelo; y grupos de tratamiento de PCCC-CD de dosis alta, media y baja. El grupo modelo recibió D. acutus veneno a 1 mg / kg (0,15 mg / ml, 0,2 ml) de peso corporal y 0,5 ml de solución salina normal por vía intraperitoneal, mientras que los grupos de tratamiento de PCCC-CD de dosis alta, media y baja recibieron un volumen equivalente de veneno de serpiente y PCCC -Extracto de CD en dosis de 8.0, 4.0 y 2.0 mg / kg, respectivamente. Los ratones inyectados por vía intraperitoneal sólo con solución salina normal (NS) sirvieron como controles. Se sacrificaron seis ratones de cada grupo 1, 3 y 12 h después de la administración de NS, D. acutus veneno y PCCC-CD en el programa descrito anteriormente, mientras que los ratones sacrificados los días 1, 2 y 5 se administraron continuamente con NS, D. acutus veneno de serpiente y PCCC-CD dos veces al día.

Análisis de concentraciones de UTP y MALB

Después de la administración de los tratamientos respectivos, los animales de los grupos de control, modelo y tratados con PCCC-CD (4,0 mg / kg) se colocaron inmediatamente en jaulas metabólicas apropiadas para la recogida de orina hasta que finalizó el período de incubación (24 h). Las concentraciones de UTP y MALB se analizaron utilizando un analizador bioquímico automático.

Análisis de biomarcadores de la función renal

La función renal se evaluó midiendo los niveles de SCR y BUN. Antes de que los ratones fueran sacrificados, se extrajeron muestras de sangre del plexo retroorbital y luego se colocaron en tubos de plástico durante al menos 4 ha 4 ° C. El suero se obtuvo por centrifugación a 750 × g durante 15 min, y los niveles de BUN y SCR se analizaron utilizando un analizador bioquímico automático.

Detección de niveles de citocinas inflamatorias

Se extrajeron los riñones derechos de los ratones, se congelaron rápidamente en hielo seco y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso en los siguientes procedimientos. Las muestras de tejido (100 mg) de los diferentes grupos se homogeneizaron con PBS en hielo y luego se centrifugaron a 750 × g durante 15 min. Los sobrenadantes se recolectaron para determinar los niveles de MCP-1, IL-10 e IL-1β utilizando los respectivos kits de ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Histología renal

Las muestras de tejido del riñón izquierdo del ratón se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% a 4 ° C durante más de 48 h, se deshidrataron, se incrustaron en parafina, se cortaron en secciones y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se compararon los cambios morfológicos entre el control, el modelo y los grupos tratados con PCCC-CD.

Actividad trombocitopénica

El PLT se realizó en sangre extraída de los ratones del plexo retroorbital y se detectó usando un analizador hematológico automático (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japón).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó mediante el paquete estadístico para las ciencias sociales (SPSS, versión 13.0). Los datos distribuidos normalmente y las varianzas homogéneas se expresan como medias ± desviación estándar (DE). Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de la diferencia mínima significativa (LSD) para las comparaciones múltiples. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización de PCCC-CD

Se utilizó TEM para observar directamente la morfología y la distribución del tamaño de los PCCC-CD (Fig. 2a, cyd). Los CD preparados eran esféricos y de tamaño uniforme, con la mayoría a 2,84 ± 0,89 nm sin agregaciones distintas. La imagen HRTEM mostró franjas de celosía (0,24 nm) de los CD, que correspondían al carbono grafítico como se muestra en la Fig. 2b.

un y c Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de puntos de carbono de Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD), b Imagen TEM de alta resolución de PCCC-CD, d Distribución de tamaño de PCCC-CD

Como se muestra en la Fig. 3a, los CD exhibieron una fluorescencia claramente azul con un pico máximo a 445 nm después de una excitación de 370 nm. En consecuencia, la información óptica en los PCCC-CD mostrados en el espectro UV-Vis mostró un fuerte pico de absorción a 265 nm correspondiente a la transición π-π * de moléculas orgánicas conjugadas en las superficies de los CD (Fig. 3b).

Propiedades ópticas de los puntos de carbono de Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD). un Espectros de fluorescencia, b espectros ultravioleta-visible (UV-Vis) y c Espectro infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR)

Además, los grupos funcionales de los CD formulados se identificaron en base al espectro FTIR en detalle, como se muestra en la Fig. 3c. El pico a 3433 cm ^{- 1} se asignó a las bandas de absorción de las vibraciones de estiramiento O – H y N – H mientras que las vibraciones de estiramiento C – H aparecieron a 2923 cm ^{- 1} y 2853 cm ^{- 1} . Además, el pico de absorción a 1624 cm ^{- 1} indicó la presencia de C =O. Se observaron enlaces C – O – C a 1109 cm ^{- 1} y el pico a 1400 cm ^{- 1} se atribuyó al estiramiento C – N. Estos hallazgos fueron consistentes con los de informes anteriores.

Citotoxicidad in vitro

Para evaluar la citotoxicidad, se expusieron células T L02 y 293 a diversas concentraciones de PCCC-CD durante 24 horas y se examinó la viabilidad utilizando el ensayo CCK-8. Como se ilustra en la Fig. 4a, la viabilidad de las células L02 tratadas con PCCC-CD fue> 85% en comparación con la de las células de control, incluso a una concentración tan alta como 5 mg / ml. De manera similar, los PCCC-CD no afectaron el crecimiento de células T 293 a concentraciones de hasta aproximadamente 2500 μg / ml (Fig. 4b). Estos resultados indicaron que los PCCC-CD mostraron una baja citotoxicidad.

Viabilidad celular por ensayo CCK-8 de ( a ) Celdas L02 y ( b ) 293 células T incubadas con PCCC-CD durante 4 h

Efecto de los PCCC-CD en las concentraciones de UTP y MALB

En comparación con el nivel de UTP en el grupo de control (0,98 ± 0,38 mg / L), los niveles de UTP aumentaron significativamente en D. acutus tratado con veneno (3,08 ± 0,92 mg / L, P <0.01) y PCCC-CD (2.36 ± 0.83 mg / L, P <0,05) grupos (Fig. 5a). Además, el nivel de UTP disminuyó después del tratamiento con PCCC-CD en comparación con los niveles posteriores a la administración del veneno ( P <0,05). Además, el nivel de MALB aumentó obviamente 24 h después de la inyección intraperitoneal de D. acutus veneno (17,78 ± 5,96 mg / L, P <0,01) en comparación con el del grupo de control (2,02 ± 0,91 mg / L). Por el contrario, los ratones tratados con PCCC-CD mostraron una tendencia a la disminución en el nivel de MALB (14,25 ± 4,16 mg / L, Fig. 5b).

Efectos de los puntos de carbono de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sobre la proteína total urinaria (UTP) y la microalbuminuria (MALB) en la orina. un UTP y b MALB. Los ratones se trataron con solución salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) y PCCC-CD (4 mg / kg) + Dav (1 mg / kg). Los datos se representan como media ± DE de seis animales de cada grupo. * p < 0.05 y ** p < 0,01 en comparación con el grupo de control tratado con NS. ^# p < 0,05 en comparación con el grupo Dav

Los CD-PCCC alivian la disfunción renal en D. acutus Ratones AKI inducidos por veneno

La función renal se evaluó midiendo los niveles de BUN y SCR, que se muestran en las Figs. 6 y 7. Los ratones tratados con D. acutus el veneno tenía niveles significativamente más altos de BUN (12,07 ± 1,00 mmol / L [1 día], P <0,01; 11,43 ± 1,37 mmol / L [2 días], P <0,01; 14,83 ± 2,53 mmol / L [5 días], P <0.01) y SCR (12.83 ± 1.43 μmol / L [1 día], P <0,01; 13,48 ± 2,26 µmol / L [2 días]; P <0,01. 13,80 ± 1,90 μmol / L [5 días], P <0,01) que los ratones tratados con NS (BUN:8,95 ± 1,04 [1 día], 9,53 ± 1,40 [2 días] y 9,07 ± 1,57 [5 días] mmol / L; SCR:9,40 ± 0,89 [1 día] , 10,27 ± 2,04 [2 días] y 9,85 ± 1,99 [5 días] μmol / L) del día 1 al 5 (Figs. 6a y 7a). Es de destacar que, en comparación con el grupo modelo, el tratamiento con PCCC-CD en dosis bajas inhibió significativamente el aumento de los niveles de SCR (9,77 ± 0,79 μmol / ml, P <0.01) y BUN (10.50 ± 1.38 mmol / L, P <0.05), mientras que alto (9.62 ± 1.87 μmol / mL, P <0.01) y medio (10.75 ± 1.48 μmol / mL, P <0,05) dosis inhibieron el aumento de SCR (Fig. 7b) pero no BUN (Fig. 6b) inducido por D. acutus veneno en el día 1. Los niveles de SCR (Fig. 7c) de los grupos tratados con PCCC-CD de dosis alta, media y baja disminuyeron (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75 y 10,68 ± 1,41 μmol / ml, respectivamente; P <0.05) que en el grupo modelo en el día 2. Además, en comparación con el grupo modelo, los niveles de BUN disminuyeron significativamente en el alto- (9.57 ± 0.52 mmol / L, P <0.01) y dosis bajas (10.72 ± 2.04 mmol / L, P <0,05) grupo de PCCC-CD pero no el grupo de dosis media (Fig. 6c) el día 2. Como se muestra en las Figs. 6d y 7d, se observaron efectos inhibidores en los niveles de ambos índices altos (12,28 ± 1,65 mmol / L, P <0,01 (BUN); 11,38 ± 1,80 μmol / ml, P <0.05 (SCR), respectivamente) y medio (12.40 ± 1.33 mmol / L, P <0,05 (BUN); 10,83 ± 2,57 μmol / ml, P <0,05 (SCR), respectivamente) dosis de PCCC-CD. Además, no se observaron diferencias significativas entre los grupos de control y tratados con PCCC-CD en el SCR.

Efectos de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata - puntos de carbono (PCCC-CD) sobre el nitrógeno ureico en sangre (BUN). un La concentración de BUN cambia en 1 h, 3 h, 12 h, 1 día, 2 días y 5 días. Los niveles de BUN en ( b ) 1 día ( c ) 2 días ( d ) 5 días. Los ratones fueron tratados con solución salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) y dosis altas (H), medias (M) y bajas (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg / kg). Los datos se representan como media ± DE de seis animales de cada grupo. * p < 0.05 y ** p < 0,01 en comparación con el grupo de control tratado con NS. ^# p < 0,05 en comparación con el grupo Dav

Efectos de los puntos de carbono de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sobre la creatinina sérica (SCR). un La concentración de SCR cambia en 1 h, 3 h, 12 h, 1 día, 2 días y 5 días. Los niveles de SCR en ( b ) 1 día ( c ) 2 días ( d ) 5 dias. Los ratones se trataron con solución salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) y dosis altas (H), medias (M) y bajas (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg / kg). Los datos se representan como media ± DE de seis animales de cada grupo. * p < 0.05 y ** p < 0,01 en comparación con el grupo de control tratado con solución salina normal (NS). ^# p < 0,05 en comparación con el grupo Dav

Secreción de citocinas inhibidas por PCCC-CD

Los efectos de tres concentraciones de PCCC-CD sobre la producción de quimioatrayentes (MCP-1) y citocinas proinflamatorias (IL-1β) y antiinflamatorias (IL-10) en respuesta a inyecciones de D. acutus Se investigó el veneno. La Figura 8 mostró que la inyección de veneno aumentó la IL-1β liberada en el modelo de ratón (1 h:58,19 ± 5,35 ng / ml, P <0,01; 3 h:56,57 ± 3,54 ng / ml, P <0,01; 12 h:49,48 ± 7,74 ng / ml, P <0,05; día 1:41,09 ± 4,82 ng / ml, P <0,05; día 2:47,96 ± 8,33 ng / ml, P <0,05; día 5:45,11 ± 6,95 ng / ml, P <0,05) en comparación con los niveles en el ratón tratado con NS (1 h:35,96 ± 4,72 ng / mL, 3 h:34,94 ± 2,58 ng / mL, 12 h:36,42 ± 5,25 ng / mL, día 1:34,47 ± 3,67 ng / mL, día 2:39,84 ± 3,71 ng / mL, día 5:36,82 ± 8,27 ng / mL). Como se muestra en la Fig. 8b – d, comparación con el D. acutus grupo inducido por veneno mostró que la exposición de 1, 3 y 12 h a altos (50,09 ± 7,68 ng / ml, P <0,05 [1 h]; 40,36 ± 8,51 ng / ml, P <0,01 [3 h]; 39,87 ± 4,64 ng / ml, P <0.05 [12 h], respectivamente) y bajo- (46.64 ± 3.83 ng / mL, P <0,01 [1 h]; 37,65 ± 9,61 ng / ml, P <0,01 [3 h]; 38,75 ± 6,64 ng / ml, P <0,05 [12 h], respectivamente) dosis de PCCC-CD disminuyen significativamente los niveles de IL-1β. Además, los PCCC-CD de dosis media redujeron significativamente el nivel de IL-1β (41,50 ± 11,08 ng / ml, P <0,01) en comparación con la de los ratones tratados con veneno a las 3 h, pero no en otros momentos.

Efectos de los puntos de carbono de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sobre el nivel de IL-1β en el tejido renal. un El nivel de IL-1β cambia en 1 h, 3 h, 12 h, 1 día, 2 días y 5 días. Niveles de IL-1β en ( b ) 1 h, ( c ) 3 h, ( días ) 12 h, ( e ) 1 día, ( f ) 2 días y ( g ) 5 dias. Los ratones se trataron con solución salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) y dosis altas (H), medias (M) y bajas (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg / kg). Los datos se representan como media ± DE de seis animales de cada grupo. * p <0.05 y ** p <0,01 en comparación con el grupo de control tratado con solución salina normal (NS). ^# p < 0,05 en comparación con el grupo Dav

Los niveles de la citoquina antiinflamatoria IL-10 aumentaron drásticamente en D. acutus grupo tratado con veneno en diferentes momentos (23,27 ± 0,72 ng / ml, P <0,01; 22,03 ± 0,96 ng / ml, P <0,05; 21,76 ± 1,99 ng / ml, P <0,05; 26,31 ± 6,55 ng / ml, P <0,01; 3 h, 12 h, día 1 y día 2, respectivamente) en comparación con el grupo tratado con NS (Fig. 9). En marcado contraste, el tratamiento con PCCC-CD de dosis alta y media (17,17 ± 4,04 y 17,25 ± 5,64 ng / ml, respectivamente, ambos P <0,05) inhibieron la secreción de IL-10 inducida por veneno a las 3 h, mientras que los PCCC-CD en dosis bajas inhibieron los niveles a las 3 h, 12 h y el día 1 (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11 y 18,31 ± 2,14 ng / mL, respectivamente, todos P <0,05). No se observaron diferencias significativas entre el grupo tratado con PCCC-CD y el grupo con NS.

Efectos de los puntos de carbono de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sobre el nivel de IL-10 en el tejido renal. un El nivel de IL-10 cambia en 1 h, 3 h, 12 h, 1 día, 2 días y 5 días. El nivel de IL-10 en ( b ) 1 h, ( c ) 3 h, ( días ) 12 h, ( e ) 1 día, ( f ) 2 días y ( g ) 5 dias. Los ratones se trataron con solución salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) y dosis altas (H), medias (M) y bajas (L) de PCCC-CD + Dav (1 mg / kg). Los datos se representan como media ± DE de seis animales de cada grupo. * p <0.05 y ** p <0,01 en comparación con el grupo de control tratado con solución salina normal (NS). ^# p < 0,05 en comparación con el grupo Dav

Además, la figura 10 muestra que la inyección de D. acutus el veneno aumentó significativamente la liberación de MCP-1 en el grupo modelo (1 h:197,45 ± 22,34 ng / ml, P <0,01; 3 h:182,42 ± 12,94 ng / ml, P <0,01; 12 h:169,20 ± 26,74 ng / ml, P <0,01; 24 h:142,81 ± 25,85 ng / ml, P <0,05) en comparación con el control tratado con NS (1 h:115,82 ± 14,80 ng / mL; 3 h:106,46 ± 13,76 ng / mL; 12 h:120,35 ± 15,75 ng / mL; y 24 h:108,81 ± 25,60 ng / mL). Más notable, el tratamiento de ratones envenenados con las tres dosis de PCCC-CD inhibió el aumento de los niveles de MCP-1. El medio- (3 h:136,84 ± 39,94 ng / mL, P <0,01; 12 h:127,48 ± 13,75 ng / ml, P <0.01) y bajo- (1 h:152.13 ± 18.89 ng / mL, P <0,05; 3 h:129,54 ± 30,85 ng / ml, P <0,01; 12 h:118,75 ± 19,96 ng / ml, P <0,01) dosis de PCCC-CD inhibió el aumento de los niveles de MCP-1 a 1, 3 y 12 h, excepto para dosis media, a 1 h (178,20 ± 22,79 ng / ml). El tratamiento con PCCC-CD en dosis altas disminuyó eficazmente el nivel de MCP-1 solo a las 3 h (131,42 ± 24,62 ng / ml, P <0.01).

Efectos de los puntos de carbono de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) sobre el nivel de MCP-1 en el tejido renal. un El nivel de MCP-1 cambia en 1 h, 3 h, 12 h, 1 día, 2 días y 5 días. MCP-1 levels in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

In contrast, IL-1β, IL-10, and MCP-1 levels of the PCCC-CDs-treated groups at certain time points were not significantly different from those of the model group, and showed a decreasing tendency.

Effect of PCCC-CDs on the Inhibition of Thrombocytopenia

PLTs have a specific role in the pathogenesis of AKI; therefore, the PLT count was investigated and the results are shown in Fig. 11 [26]. Compared with the PLT values of the control group (1 h:[1228 ± 51] × 10⁹ ; 3 h:[1120 ± 36] × 10⁹ ; 12 h:[1245 ± 111] × 10⁹ ; day 1:[1177 ± 69] × 10⁹ ; day 2:[1195 ± 51] × 10⁹ ; and day 5:[1181 ± 46] × 10⁹ ), a drastic reduction occurred as early as 1 h after D. acutus venom administration, with a nadir occurring at 3 h. Subsequently, the PLT steadily increased up to day 5 (1 h:[354 ± 70] × 10⁹ , P <0,01; 3 h:[315 ± 77] × 10⁹ , P <0,01; 12 h:[435 ± 91] × 10⁹ , P <0,01; day 1:[663 ± 226] × 10⁹ , P <0,01; day 2:[941 ± 248] × 10⁹ , P < 0.05; day 5:[1083 ± 89] × 10⁹ ). Of note, even at this time interval, the PLT values were significantly lower than those of control mice. In addition, administration of PCCC-CDs at a dose of 8 mg/kg markedly inhibited the venom-induced thrombocytopenia induced at 1 h ([435 ± 91] × 10⁹ , P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10⁹ , P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10⁹ , P < 0.01), day 1 ([1028 ± 248] × 10⁹ , P < 0.01), and day 2 ([1183 ± 89] × 10⁹ , P <0,01). This inhibitory effect was also observed at a dose of 2 mg/kg PCCC-CDs at 3 h and day 2 and 4 mg/kg PCCC-CDs at day 2, in addition to increased PLT. Although there was no significant difference between the model and medium-dose groups, an increasing tendency was observed at other different time points.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on platelet (PLT) counts in the blood. un PLT changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. PLT in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

Histopathological Observations

The renal injury in the venom group was histologically evaluated. As shown in Fig. 12a, in contrast to the NS-treated group, which showed normal glomeruli and tubular cellularity, marked changes were observed in the renal parenchyma of the D. acutus venom-treated group. These changes include marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration. Cotreatment with PCCC-CDs prevented D. acutus venom-induced renal damage, and the histopathological examination of the architecture of the renal tissues was almost normal with mild haemostasis, renal tubular dilation, and degeneration.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on histopathological changes in kidney tissues in D.acutus venom (Dav)-induced AKI mice. After D.acutus venom challenged, kidney tissues from each experimental group were prepared for histological evaluation. Histological changes of kidney obtained from mice of different groups normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg) in (a ) 1 h, (b ) 3 h, (c ) 12 h, (d ) 1 day, (e ) 2 days, and (f ) 5 days

Discussion

As an emerging nanomaterial, CDs are beginning to occupy an important niche as innovative materials for next-generation nanomedicines. Compared to traditional heavy-metal-based quantum dots, CDs are good candidates for biomedical application because of their unique characteristics that have considerable potential advantages in the development of novel medicines with relatively low toxicity [27, 28].

The derived PCCC-CDs particles were quasi-spherical and well-dispersed in water, with abundant functional groups present on the surface. This observation is consistent with previously reported findings [23]. In addition, the as-prepared CDs showed low toxicity against L02 and 237 T cells, which indicated its suitability for biomedical applications.

The current study is the first, to the best of our knowledge, to demonstrate the remarkable bioactivities of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus snakebite. D. acutus is widely called “five pacer” or “hundred pacer” in Chinese folk medicine on account of the folkloric description that the people or animals bitten by D. acutus could not walk more than 100 steps. More than 90% of the population of D. acutus is found in China, and the frequency of critical conditions and even death related to the bite of this snake is higher than that by many other venomous snakes [29]. AKI is the most serious systemic effect and common complication, which leads to secondary renal ischemia and failure. An enhanced knowledge of relevant information on AKI induced by D. acutus envenomation would contribute to the development of novel therapeutic approaches. However, in contrast to the considerable knowledge available on the nephrotoxicity of snake venom in general [30, 31], information on the AKI induced by D. acutus venom is rare, which led us to investigate this potential medicine that is still in the early stages of development.

In this study, we established an AKI model by intraperitoneally injecting D. acutus venom into mice to assess the complex and multifactorial pathogenesis of venom-induced AKI. Furthermore, the model provided a tool for investigating the protective effects of PCCC-CDs against AKI induced by D. acutus venom.

Current experiments have shown the development of substantial AKI with distinct changes in inflammatory cytokines and serum and urinary biochemical index, as well histopathological evidence of renal injury after intraperitoneal injection of snake venom [31]. These findings indicated the possible factors that may mainly contribute to the venom toxicity are [32] (1) direct venom cytotoxicity against the kidney and (2) renal inflammatory reactions.

Specifically, renal insufficiency was confirmed approximately 24 h post venom injection based on oliguria associated with proteinuria and elevated serum biomarkers (SCR and BUN). We further affirmed the renal involvement in the D. acutus venom-treated group using biochemical analysis, which showed significantly elevated UTP and MALB levels compared with those of the control group. These findings indicated the presence of glomerular malfunction and tubular reabsorption in the venom-treated group [33], which were supported by evidence of histopathological change. In contrast, a significant reduction in the levels of UTP and MALB was observed in the envenomated medium-dose PCCC-CD-treated group. In addition, serum biochemical indicators (SCR and BUN) are other vital parameters used to determine the elevation of renal dysfunction in AKI and they remain clinical indicators in its diagnosis [34]. Injecting snake venom from day 1 to 5 also dramatically increased the levels of SCR and BUN, whereas treatment with PCCC-CDs reversed these effects, resulting in a faster recovery than that of the control group. More importantly, the distinct changes in the kidney tissue, marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration further indicated the direct impairment of the kidney by the venom. The attenuating effects of PCCC-CDs on the histopathological changes were demonstrated in this study. These results suggested that PCCC-CDs inhibited the AKI-induced abnormal manifestation of urinary and serum biochemical markers associated with kidney dysfunction as well as renal histological damage. Furthermore, these effects may be attributable to the amelioration of the direct nephrotoxicity of the D. acutus venom by the PCCC-CDs [35]. The protective effects of PCCC-CDs were evidenced by the inhibition of D. acutus venom-induced direct kidney damage.

An intense inflammatory response is a common feature induced by envenomation by venomous animals such as snakes and caterpillars [35,36,37]. The signs of systemic inflammation with mononuclear cell infiltration, neutrophilic leukocytosis, tubular epithelial cell degeneration, and necrosis have also been shown in kidney impairment induced by injecting snake venom. MCP-1 is a small molecule protein that plays a vital role in recruiting and activating leukocytes during inflammatory responses [38]. In addition, mononuclear phagocytes and lymphocytes may contribute to acute renal cell injury by different mechanisms such as the secretion of proinflammatory mediators, which may then induce resident renal cells to express chemokines [39]. The involvement of MCP-1, inflammatory cytokines (IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) in the inflammatory response in the pathogenesis of AKI in mice injected with D. acutus venom only was demonstrated in the present study. This observation indicated that the underlying mechanism of the D. acutus venom-induced AKI may be associated with the renal inflammatory response. The evidence that exposure to PCCC-CDs significantly reduced levels of IL-1β, IL-10, and MCP-1 suggests that CDs may exhibit renoprotection by inhibiting renal inflammatory reactions.

Furthermore, PLTs play a crucial role in acute haemostatic and inflammatory processes and are associated with diverse inflammatory pathologies [40, 41]. They are highly sensitive and respond quickly to biological changes when an organism is injured or bleeding, as the first cells to arrive at the site of acute injury to interact with endothelial cells and leukocytes [42]. PLTs are involved in the pathogenesis of AKI [43], and are considered a prognostic marker that is significantly associated with a worse outcome of AKI [44]. This study provided evidence that D. acutus venom conspicuously decreased the PLT count, which was consistent with the results of studies reporting that thrombocytopenia can be induced by snake venom [34, 45]. We observed that exposure to PCCC-CDs significantly elevated the PLT counts, which was consistent with the findings of a previous study [23].

The abnormalities of AKI induced by D. acutus venom were, to our knowledge, demonstrated for the first time in the current study and mainly included renal dysfunction associated with proteinuria, oliguria, elevated BUN and SCR levels, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia.

Remarkably, the PCCC-CDs demonstrated protective activity against D. acutus venom-induced AKI by inhibiting the associated impairments, as evidenced in this study for the first time. This study was a preliminary evaluation of the beneficial effects of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus venom, and further investigations of the underlying mechanism would be the focus of future studies.

Conclusion

The impressive protective effects of PCCC-CDs on D. acutus venom-induced AKI have been demonstrated in this study, for the first time, to the best of our knowledge. The AKI-related effects were mainly manifested as renal dysfunction, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia. These results indicated that PCCC-CDs have potential application prospects for use as a complementary medicine for the treatment of abnormalities induced by D. acutus venom-induced AKI. Furthermore, this provides a novel strategy for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine formulations, and further broadens the biomedical applications of CDs.

Disponibilidad de datos y materiales

All data generated or analysed during this study are included in this published article.

Abreviaturas

AKI:: Acute kidney injury
BUN:: Blood urea nitrogen
CD:: Puntos de carbono
D. acutus :: Deinagkistrodon acutus
HE:: Haematoxylin and eosin
IL:: Interleukin
MALB:: Microalbuminuria
MCP-1:: Monocyte chemotactic protein 1
PCC:: Phellodendri Chinensis Cortex
PCCC-CDs:: Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots
PLT:: Platelet counts
SCR:: Serum creatinine
UTP:: Urinary total protein

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