Complementación de ELISA y una superficie de electrodo interdigitado en la funcionalización de nanopartículas de oro para la detección eficaz de defectos de coagulación de la sangre humana

Caracterización de nanopartículas de oro. Realizado con el tamaño óptimo de 15 nm. un Análisis de espectrofotometría UV-Vis. Se encontró un único pico prominente a 550 nm. b Observación por microscopio electrónico de transmisión. El recuadro de la figura muestra la imagen ampliada. Se muestra la barra de escala. c Análisis de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier. Posiciones máximas aparentes para el oro y el NH ₂ se indican. d Análisis de distribución de volumen del PNB. Se muestra la distribución obtenida. e Análisis de potencial Zeta. Se encontró que el valor era - 6,9

Preparación y optimización de la superficie de amina para capturar PNB

La cantidad de APTES influye en gran medida en la inmovilización de GNP o anticuerpos en la superficie de PS. En general, las moléculas APTES muy apiñadas tienen una probabilidad de generar resultados falsos positivos. Dado que APTES se ha utilizado de 1 a 2% para inmovilizar el anticuerpo en varias superficies de sensores, aquí titulamos de 1,25 a 5% de APTES, preparado en etanol absoluto. A continuación, nuestro objetivo era inmovilizar los GNP en las superficies modificadas con APTES. Existe la posibilidad de que los números más altos de GNP produzcan el efecto de apiñamiento, por lo que los GNP con 25, 50 o 100% de 15 nm se probaron en la superficie modificada con APTES para optimizar la dilución adecuada. En estas superficies modificadas, se detectaron 250 nM del FIX con el anticuerpo FIX. Como se muestra en la Fig.2a yb, APTES al 1.25% muestra menos absorbancia óptica (DO) con todas las diluciones de GNP (25, 50 y 100%), mientras que APTES al 2.5 y 5% mostró una mayor absorbancia con 50 y 100% de PNB. Al mismo tiempo, se mejoró la relación señal-ruido al aumentar las concentraciones de APTES y GNP (Fig. 3a, b). El 5% de APTES con 50 y 100% de GNP mostró unión inespecífica, y 50 y 100% de GNP con 2,5% de APTES mostraron una absorbancia similar. Basándonos en estos valores obtenidos, elegimos 2.5% de APTES y 25% de dilución de PNB para experimentos adicionales.

Determinación de las cantidades de APTES y PNB. Se utilizaron tres concentraciones diferentes (1,25, 2,5 y 5%) de APTES con tres diluciones de GNP (25, 50 y 100%). un Detección visual de FIX después de agregar el sustrato. Se incluyeron carriles de control sin FIX. b Representación gráfica del nivel APTES óptimo. Se encontró que el 2,5% de APTES y el 25% del PNB eran óptimos

Determinación del tamaño potencial del PNB

Después de la optimización de la dilución de APTES y GNP, evaluamos a continuación el tamaño adecuado de los PNB. Dado que el área de la superficie juega un papel crucial en la inmovilización de proteínas, aquí intentamos inmovilizar tres tamaños diferentes de GNP, incluidos 10, 15 y 80 nm. Los diferentes tamaños de GNP tienen diferentes áreas de superficie y diferentes cargas para atraer la proteína, y la capacidad de unión en la superficie modificada con APTES también es diferente. Como se muestra en la Fig. 4a, se detectó FIX 250 nM con la superficie ELISA modificada con GNP de 10, 15 y 80 nm. Se encontró que los GNP de 15 y 80 nm muestran casi la misma absorbancia de 0,4 (DO) para la detección de 250 nM de FIX, pero los GNP de 10 nm muestran solo una DO de 0,34. A partir de este experimento, confirmamos que los GNP de 15 u 80 nm son adecuados para experimentos adicionales, y continuamos con los GNP de 15 nm.

un Determinación del tamaño ideal del PNB. Entre 10, 15 y 80 nm, 15 y 80 nm mostraron resultados similares. Se utilizaron quince nanómetros para determinar el límite de detección con FIX. b Un experimento de control para la detección de FIX. Se llevaron a cabo tres experimentos de control diferentes (C1 — sin anticuerpo FIX; C2 — sin IgG anti-ratón; C3 — sin FIX). No se encontró ninguna señal significativa en ninguno de los experimentos de control. Las inserciones de figuras muestran los resultados visuales

Estrategias experimentales para confirmar la ausencia de contaminación y el alto rendimiento

Antes de detectar el FIX en la superficie ELISA modificada con GNP, realizamos tres tipos diferentes de experimentos de control como se explica en la sección “Materiales y métodos”. Como se muestra en la Fig. 4b, no pudimos observar una absorbancia significativa en los pocillos para los experimentos de control 1, 2 y 3 (C1, C2 y C3). En el experimento específico (S), el nivel más alto de absorbancia está claramente asociado con cambios de color aparentes. En el caso de C1, no agregamos el anticuerpo FIX, lo que confirma que el anticuerpo FIX interactúa específicamente con FIX (en S). No se encontró señal observable en ausencia de IgG anti-ratón en C2, lo que proporciona un anclaje adicional para la interacción adecuada de FIX y anticuerpo seguido de IgG anti-ratón. En C3, en ausencia de FIX, no pudimos medir la absorbancia significativa. A partir de estos resultados, se confirmó la interacción adecuada de FIX con su anticuerpo en la superficie de ELISA sin unión inespecífica.

ELISA asistido por GNP frente a ELISA convencional:determinación de la sensibilidad

Después de realizar los experimentos de control, detectamos FIX con superficies modificadas con GNP y comparamos los resultados con el método ELISA convencional. Realizamos tres experimentos diferentes para la detección de FIX. Primero, se inmovilizó GNP en superficies modificadas con APTES, y luego se unió FIX a la superficie de GNP mediante interacción electrostática. Debido a la interacción electrostática, la mayoría de las proteínas tienen la posibilidad de unirse a la superficie GNP; de esa manera, podríamos inmovilizar FIX en la superficie ELISA PS. La inmovilización de proteínas también depende de las cargas que surgen de los aminoácidos y el GNP. Gopinath y col. [37] han demostrado la fuerte unión de FIX en la superficie de GNP, y también encontraron que es estable en condiciones de alta salinidad. En el segundo método, el GNP y la proteína se premezclaron primero antes de inmovilizarse en la superficie de ELISA PS aminada. Se esperaba que más proteínas pudieran unirse de esta manera, porque existe una mayor posibilidad de que las moléculas de proteínas puedan unirse a la superficie de GNP en el estado de solución. La solución premezclada se inmovilizó luego sobre las superficies de amina modificadas con APTES. Estos métodos se compararon con el método ELISA convencional. Como se muestra en la Fig. 5a, cuando titulamos la concentración de FIX de 0 a 200 nM, el ELISA convencional (método 1) mostró el límite de detección de 6 nM. El método APTES-GNP-FIX (método 2) muestra el límite de detección de 200 pM, que es más de 30 veces mayor sensibilidad en comparación con el ELISA convencional. El aumento de la sensibilidad se logra mediante la orientación adecuada de un gran número de antígenos inmovilizados en la placa ELISA PS y, en última instancia, interactuarán más anticuerpos. En esta investigación, se utilizaron nanopartículas de oro para inmovilizar más antígenos mediante la modificación de amina de la placa ELISA. En el ELISA convencional, los antígenos se inmovilizan directamente en la placa ELISA, lo que conduce a un menor número de moléculas que se unen a la superficie y reduce la sensibilidad frente a la estrategia actual mediada por nanopartículas de oro. Además, la resonancia de plasmón de superficie localizada proporciona una mejora adicional de la sensibilidad, como se revela en los estudios con GNP. Cuando premezclamos GNP con FIX, como se esperaba, el límite de detección mejoró mucho y alcanzó el nivel de 100 pM, que es 60 veces mayor sensibilidad que el ELISA convencional. Como se muestra en la Fig.5a, se pudo ver claramente que cuando usamos GNP para la inmovilización de proteínas, la absorbancia máxima alcanzó ~ 0.6 para proteínas premezcladas e inmovilizadas directamente en las superficies de GNP, pero la absorbancia encontrada con ELISA convencional fue ~ 0.4 usando la concentración similar (200 nM) de FIX. Incluso con otras concentraciones, el método 3 mostró una mayor diferencia en absorbancia en comparación con el ELISA convencional, y esto también fue razonablemente mayor que el método 2. En el caso del ELISA convencional, la detección visible se encontró a partir de 25 nM y de 3 nM. en el método 2. Con el método 3, pudimos ver visiblemente el cambio de color de 200 pM de FIX debido a una mayor absorbancia (Fig. 5a). La absorbancia se saturó a 25 nM en el método 3. Como pudimos visualizar los cambios de color de 200 pM de FIX, evaluamos el límite de detección y titulamos usando las concentraciones más bajas de FIX. Era evidente que el límite de detección alcanzó los 100 pM cuando premezclamos los GNP y FIX (Fig. 5b).

un Comparación de la sensibilidad de FIX en ELISA modificado con GNP frente al ELISA convencional. El FIX se valoró desde 0,2 hasta 200 nM. El ELISA convencional presenta un límite de detección de 6 nM. En el ELISA modificado con GNP, la señal se observó hasta 200 pM. El recuadro de la figura muestra los resultados visuales. b Límite de detección de FIX en placa ELISA modificada con GNP. El FIX se tituló de 25 a 100 pM. Se encontró que el límite de detección era 100 pM. Las inserciones de figuras muestran los resultados visuales

Detección de FIX en suero humano y mejora mediante Spiking FIX

Dado que se encontró que FIX juega un papel importante en la cascada de la coagulación [38, 39], después de verificar el límite de detección, también detectamos FIX en suero humano. Para este análisis, titulamos el suero humano en el rango entre diluciones 1:1280 y 1:20. El suero diluido se mezcló previamente con GNP y se inmovilizó sobre la superficie de ELISA modificada con APTES, como se indicó anteriormente. Era obvio que el FIX se detectó a partir de una dilución de suero 1:640, que es equivalente a 125 pM de FIX (Fig. 6a). El suero humano sano generalmente contiene aproximadamente 87 nM de FIX, junto con otras proteínas importantes como la albúmina y la globulina. Con nuestra estrategia, alcanzamos el límite de detección específico de 125 pM en suero humano, que es útil para identificar un defecto de coagulación sanguínea. Por otro lado, cuando añadimos FIX de 1 a 8 nM en la dilución 1:640 de suero humano, mostró incrementos en la absorbancia que aumentaron concomitantemente con las concentraciones de FIX (Fig. 6b).

un Detección de FIX en suero humano. El suero humano se diluyó de 1:20 a 1:1280. Se detectó FIX en suero humano diluido 1:640 (la figura interior indica la representación esquemática). b Mezcla de FIX (0,125 a 8 nM) en una dilución 1:640 de suero humano. Con incrementos en la concentración de FIX, se incrementó la absorbancia. Las inserciones de figuras muestran los resultados visuales

Detección de GNP-FIX en la superficie IDE:análisis de complementación

Dado que se encontró que el FIX conjugado con GNP mejoró el límite de detección, aplicamos una estrategia similar utilizando el sensor electroquímico con superficie IDE para complementar estos hallazgos. Titulamos el FIX de 25 a 200 pM (mezclado con GNP), lo inmovilizamos en la superficie IDE modificada con amina y luego lo detectamos mediante el anticuerpo FIX. Como se muestra en la Fig. 7a, con el aumento en la concentración de FIX, el nivel actual también se incrementó concomitantemente desde la línea de base. El nivel de FIX se saturó desde 200 pM y se encontró que el límite de detección era de 25 pM. Esta detección se multiplica por cuatro en comparación con ELISA (100 pM). Además, se evidenció la detección de FIX en el suero humano diluido (Fig. 7b). Para este experimento, se diluyó suero humano de 1:80 a 1:1280. Como se muestra en la figura, la dilución de 1:1280 (curva roja) muestra una diferencia aparente de la línea de base (curva negra) con la estimación 3σ, lo que indica que la detección evidente de FIX del suero humano con la dilución de 1:1280 coincide con los resultados de ELISA (detectado a 1:640). La detección de IDE con menor dilución muestra el incremento en la sensibilidad.

un Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. b Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280