Uso de nanopartículas magnéticas cargadas positivamente para capturar bacterias a concentraciones ultrabajas

Materiales y métodos

Nanomateriales

Hidrato de cloruro de hierro (III) (FeCl ₃ · 6H ₂ O), hidróxido de amonio (NH ₄ OH, 28% en peso), ácido clorhídrico (solución acuosa al 37% en peso), etilenglicol y acetato de sodio se adquirieron de Shanghai (China) Reagent Company. El ortosilicato de tetraetilo (TEOS), el (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) y la fluoresceína tetrametilrodamina (TRITC) se adquirieron en Sigma-Aldrich (EE. UU.). Polietilenimina ramificada (PEI, 99%, Mw ) =10,000) se compró a Alfa Aesar. Todas las soluciones se prepararon utilizando agua desionizada Milli-Q (18,2 MΩ cm a 25 ° C de resistividad).

Síntesis NP

Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas se prepararon mediante una reacción solvotermal [10]. Brevemente, 0.081 g de FeCl ₃ · 6H ₂ Se disolvió O en 30 ml de etilenglicol con agitación magnética. A continuación, se añadieron a esta solución 0,3 g de ácido poliacrílico (PAA) y 1,8 g de urea. Después de agitar durante 30 min, la solución se calentó a 200 ° C durante 12 h usando un autoclave de acero inoxidable revestido con teflón. Cuando se enfrió a temperatura ambiente, se recogió con un imán un producto negro, a saber, núcleos de nanopartículas magnéticas. Seguido de un lavado con etanol y agua desionizada cada tres veces, el Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas se trataron con HCl 0,15 M bajo sonicación durante 15 min y luego se recubrieron con sílice mediante hidrólisis y TEOS.

Para preparar las nanopartículas magnéticas fluorescentes cargadas negativamente (NP-), primero se hizo reaccionar el complejo APTES-TRITC (C33H44N3O6Si) en condiciones de oscuridad durante la noche en etanol. Luego, el complejo se injertó en Fe ₃ O ₄ nanopartículas a través de la reacción entre APTES y grupos hidroxilo en el Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ nanopartícula. Posteriormente, se agregaron 30 μL de TEOS y se hizo reaccionar durante 24 h en la oscuridad. Seguido por el lavado con etanol y agua desionizada cada tres veces, se produjeron NP- fluorescentes. Mediante la modificación de NP− con el polímero policatiónico PEI, se terminaron las nanopartículas magnéticas cargadas positivamente (NP +).

Caracterización de NP

Los estudios de microscopía electrónica de transmisión (TEM) fueron realizados por un TECNAI F ^{- 30} Microscopio electrónico de transmisión de alta resolución que funciona a 300 kV. El tamaño de partícula y el potencial zeta de las NP se determinaron mediante la serie Malvern Zeta Sizer Nano (Westborough, MA). La fluorescencia se examinó con un microscopio confocal de barrido láser Carl Zeiss LSM5 EXITER (Zeiss, Jena, Alemania).

Preparación de bacterias

La cepa gramnegativa E. coli Se utilizaron BL21 como bacterias modelo. E. coli se cultivó en 100 mL de medio de crecimiento Luria Broth [11]. Las bacterias se cultivaron en una incubadora termostática a 200 rpm, 37 ° C durante 16 h. Posteriormente, se retiraron 100 μL del cultivo bacteriano, diluidos con el medio 1 × 10 ⁵ veces, recubierto sobre el agar y cultivado a 37 ° C durante 24 h. Se contó el número de unidades formadoras de colonias. Las células bacterianas restantes se recolectaron mediante centrifugación a 5000 rpm durante 5 min, se lavaron tres veces con 1 × PBS (10 mM, pH 7,4) y se diluyeron a concentraciones de aproximadamente 1 × 10 ³ unidad formadora de colonias (UFC) / mL. Por razones de seguridad, todas las muestras bacterianas se colocaron en un autoclave a 121 ° C durante 20 minutos para matar las bacterias antes de desecharlas y todo el material de vidrio en contacto con las bacterias se esterilizó antes y después de su uso.

Experimento de captura de bacterias

Todos los estudios de captura por lotes se realizaron en tampón 1 × PBS esterilizado. Se dispersaron cuarenta microlitros de NP (1 μg / μL) en la solución salina esterilizada bajo ultrasonidos durante 10 min, y luego 1 mL de la solución bacteriana (aproximadamente 10 ³ CFU / mL) a la suspensión. Después de una incubación de 10 minutos, las bacterias unidas a NP se capturaron mediante un imán permanente en la pared del vial y las bacterias libres se eliminaron con la solución de lavado. Las bacterias capturadas se liberaron retirando el imán y se resuspendieron en PBS. Para el análisis microscópico, se extendió una alícuota de bacterias sobre portaobjetos y se tiñó con Hema-3 (Fisher Diagnostics). Para el análisis de inmunofluorescencia, se extendió una alícuota de bacterias en portaobjetos y se tiñó con 4′-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Eficiencia de captura bacteriana de NP a diferentes concentraciones

Un mililitro de suspensión bacteriana (aproximadamente 2 × 10 ² CFU / mL) se incubó con diferentes cantidades (5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 y 100 μg / mL) de NP + o NP- durante 10 min. Después de la separación magnética por las nanopartículas, se tomó una muestra de la solución total y se analizó la concentración bacteriana mediante un método de recuento en placa. La eficiencia de captura bacteriana de las NP se probó contando el número de UFC en las placas de agar LB.

Capacidad de los NP para capturar bacterias en concentraciones bajas

Se incubaron cuarenta microgramos de NP + o NP− con 1 mL de suspensión bacteriana a concentraciones muy bajas (10 y 10 ² UFC / mL). Después de la separación magnética por las nanopartículas, se tomó una muestra de la solución total y se analizó la concentración bacteriana mediante un método de recuento en placa. La eficiencia de captura bacteriana de las NP se probó contando el número de UFC en las placas de agar LB.

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (DE) como se indica en las leyendas de las figuras. Se calculó un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) con un análisis de hoc adecuado utilizando el software GraphPad Prism con P valores <0.05 considerados estadísticamente significativos.

Resultados

Caracterización de NP magnéticas

El diagrama esquemático para la preparación de las nanopartículas compuestas magnéticas cargadas en la superficie se muestra en la Fig. 1. El Fe ₃ O ₄ las nanopartículas se conjugan con APTES para formar una capa delgada de SiO ₂ caparazón en la superficie de las nanopartículas al reaccionar con TEOS y NH ₄ OH. Para visualizar y cuantificar las células capturadas directamente, se hace reaccionar inicialmente el complejo APTES-TRITC, seguido de un injerto en la superficie del Fe ₃ O ₄ @ compuestos de sílice a través de una reacción clásica sol-gel. Abundantes grupos de SiOH gobiernan la superficie general de este producto, exhibiendo una fuerte carga superficial negativa, es decir, nanopartículas magnéticas cargadas negativamente (NP-). Para las nanopartículas magnéticas cargadas positivamente (NP +), las moléculas de PEI se utilizan para cubrir y modificar la superficie de NP−. El producto modificado muestra una fuerte carga superficial positiva debido a la abundante presencia de grupos amina.

Diseño de las nanopartículas. Diagrama esquemático que muestra el diseño de nanopartículas compuestas (NP) superparamagnéticas fluorescentes con carga superficial

Como se muestra en la Fig. 2a, TEM demostró que las nanopartículas compuestas magnéticas tenían un diámetro de 450 nm, que estaban compuestas de SiO ₂ uniformado recubrimiento (tamaño de 60 nm). La dispersión de luz dinámica (DLS) de las partículas en la Fig. 2b mostró una distribución de tamaño estrecha con un diámetro medio aumentado después de la funcionalización de la superficie. Los tamaños máximos de las nanopartículas compuestas con cargas positivas y negativas son 620 y 700 nm, respectivamente. Las nanopartículas medidas por DLS suelen ser más grandes que las medidas por TEM. Esto se debe a que el tamaño evaluado por DLS está influenciado por el movimiento browniano y depende de la temperatura ambiente, el radio dinámico de la nanopartícula y el grado de aglomeración de nanopartículas provocada por un entorno estático a través de la aparición de conflictos [12]. La Figura 2c muestra las distribuciones de potencial zeta de las nanopartículas negativas y positivas. En agua desionizada (pH 7,0), los potenciales zeta de NP− y NP + son - 26,6 mV y + 28,1 mV, respectivamente. Las dependencias del pH de los potenciales zeta para NP + se muestran en el archivo adicional 1:Figura S1. Estos resultados indicaron que las nanopartículas cargadas en la superficie están bien dispersas en una solución acuosa en condiciones neutras, lo que podría aplicarse para la captura de células.

Caracterización de las nanopartículas. un Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanopartículas cargadas positivamente (NP +) y nanopartículas cargadas negativamente (NP-). b Tamaño de dispersión de luz dinámica y distribución de NP. c Distribuciones potenciales Zeta de NP

Capacidad de los NP magnéticos para capturar E. coli

La Figura 3 muestra el procedimiento experimental general de captura de bacterias. Las NP se mezclaron con una solución de bacterias y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente, usamos un imán permanente para capturar las bacterias "magnetizadas" (nanopartículas magnéticas unidas a la superficie celular) en la pared del tubo. Después de eliminar la solución restante y lavar los agregados con PBS (con un imán en el exterior), transferimos los agregados a un portaobjetos para su análisis microscópico. Como se muestra en el esquema, NP + proporciona suficiente capacidad de respuesta electrostática para enriquecer rápidamente E. coli . Por el contrario, las bacterias se eliminan enjuagando con PBS en el experimento NP−.

Ilustración de los procedimientos de captura de bacterias. E. coli en suspensión se mezclan respectivamente con NP + y NP-, seguido de 10 min de incubación. Las bacterias "magnetizadas" fueron atraídas a la pared del vial por un imán. Después de la eliminación de la solución restante, las NP capturaron las bacterias, se lavaron con PBS y se contaron a partir del número de colonias bacterianas

Las imágenes ópticas de las nanopartículas se muestran en la Fig. 4. La imagen óptica de NP− mostró las partículas monodispersas y uniformemente distribuidas. Sin embargo, NP + tendió a aglomerarse. La distribución de tamaño de NP + es obviamente más amplia que la de NP−. Estos resultados demostraron que NP + y NP− tenían un patrón de interacción completamente diferente con E. coli . Para investigar más a fondo la afinidad bacteriana de NP +, la localización NP + en E. coli se examinó mediante análisis de fluorescencia. La Figura 5a muestra que capturaron E. coli son positivos tanto para DAPI (color azul) como para TRITC (color rojo). Para confirmar claramente la afinidad de NP + por las bacterias, se utilizó la tecnología TEM. En la Fig. 5b, se observó que varios NP + se acumulaban en la pared celular bacteriana. Estos resultados sugirieron que NP + tiene una fuerte afinidad por las bacterias.

Comparación de E. coli capacidad de unión de NP + y NP−. Las imágenes de la izquierda son los campos de contraste de fase de las bacterias que se unen con NP +. Las imágenes de la derecha solo tienen nanopartículas, lo que sugiere que NP− sin capacidad de unión a E. coli celdas

Imágenes fluorescentes y TEM de E. coli unión con NP +. un Los paneles superiores muestran las imágenes fluorescentes de E. coli células que se unen con NP +. DAPI se usa para teñir el núcleo celular. TRITC está etiquetado en NP. b Los paneles inferiores son imágenes TEM representativas que muestran NP + y E. coli complejos

Detección de bajas concentraciones de E. coli

Para caracterizar aún más la dinámica de las bacterias y las interacciones NP +, incubamos E. coli en un número constante (2 × 10 ² CFU / mL) con varias concentraciones de NP que van desde 5 a 100 μg / mL. A continuación, las bacterias unidas a NP se capturaron y separaron magnéticamente. Las eficiencias de captura magnética de bacterias por NP + y NP− se trazan como se muestra en la Fig. 6. El número de E. coli capturado por NP− es solo del 12% incluso a una alta concentración de 100 μg / mL. En contraste con NP−, NP + mostró capacidades de captura de bacterias significativas y logró 81% de eficiencia de captura con 40 μg / mL ( P <0,001). Como puede verse en las placas de agar LB, se demostró un aumento dependiente de la dosis de colonias bacterianas con NP +.

Capture las eficiencias de E. coli por NP + o NP− a las diversas concentraciones indicadas. La imagen de la izquierda es la fotografía de placas de agar LB recubiertas con E. coli capturado por NP + y NP−. La imagen de la derecha muestra la eficiencia de captura bacteriana de NP a las diferentes concentraciones indicadas. E. coli (2 × 10 ² UFC en 1 ml de solución de PBS) sin incubación de NP se contó como 100% y sirvió como control. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0,001

Para confirmar la afinidad de NP + por E. coli a una concentración ultrabaja, mezclamos 40 μg de NP con 1 ml de solución de PBS que contenía solo 10 y 100 UFC de E. coli . La Figura 7 muestra fotografías de las colonias resultantes en placas de agar para todas las muestras. Como era de esperar, el NP + de hecho capturó E. coli a una concentración ultrabaja, mientras que las colonias bacterianas no fueron obvias en las placas con NP−. Las pocas colonias en la placa podrían atribuirse a la afinidad inespecífica de las nanopartículas. Un análisis adicional indicó que se obtuvieron eficiencias de captura bacteriana de más del 90% a una concentración ultrabaja (10 y 100 UFC / ml) usando NP +. Por el contrario, la eficiencia de captura es inferior al 4% con NP− en las mismas condiciones y tiene una diferencia significativa ( P <0,001). Estos resultados sugieren que NP + tiene una fuerte afinidad por las bacterias, lo que podría explicarse por las atracciones electrostáticas. Para investigar las propiedades de captura bacteriana de amplio espectro, empleamos tres bacterias grampositivas ( Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus y Lactococcus lactis ) como modelos. Como se ilustra en el archivo adicional 1:Figura S2, NP + tiene una mayor capacidad de adsorción de baclilli ( E. coli y B. subtilis ) que los estafilococos ( S. aureus ) y estreptococos ( L. lactis ). Además, también encontramos que las moléculas cargadas negativamente, como el 3-bromopiruvato (3-BP) y el ADN, podrían interferir con el efecto de captura bacteriana. La E. coli muerta no es válido para dicho sistema (archivo adicional 1:Figura S3).

Capture las eficiencias de E. coli por NP + o NP− a concentraciones ultrabajas. La imagen de la izquierda es la fotografía de placas de agar LB recubiertas con E. coli capturado por NP + y NP−. La imagen de la derecha mostraba el E. coli eficiencia de captura de NP (40 μg / mL) con concentraciones ultrabajas de bacterias. E. coli (10 y 100 UFC en 1 ml de solución de PBS) sin incubación de NP se contó como 100% y sirvió como control. *** P <0,001

Discusión

Se sabe que ambas bacterias gramnegativas (como E. coli ) y bacterias grampositivas (como B. subtilis ) interactúan mucho más fácilmente con partículas cargadas positivamente que las partículas cargadas negativamente a través de atracciones electrostáticas [13, 14]. Esto también se encontró en nuestro estudio. Una ventaja de nuestro sistema de captura es que las nanopartículas funcionalizadas con PEI tienen más grupos amina, que fueron capaces de capturar bacterias en concentraciones ultrabajas. Hasta la fecha, existen algunos ensayos generales y satisfactorios que podrían detectar bacterias en concentraciones inferiores a 10 ² UFC / mL sin pre-enriquecimiento de bacterias mediante un proceso de cultivo. Este estudio mostró un ensayo simple que utiliza nanopartículas eléctricamente magnéticas para capturar y detectar bacterias gramnegativas (los organismos tienen una membrana citoplasmática, una pared celular y una membrana externa intacta) en 1 hora a una concentración de 10 UFC / mL.

En nuestro experimento, encontramos que la carga superficial de las NP puede influir en las eficiencias de captura bacteriana. Aquí, los efectos de la carga en la superficie de las NP sobre las eficiencias de captura bacteriana se estudiaron utilizando E. coli como bacteria modelo. Cuando se utilizaron NP + en el ensayo de captura, mostraron una capacidad de adsorción eficaz de las bacterias. Las eficiencias de captura bacteriana aumentaron con la dosis de NP +. La microscopía TEM muestra agregados macroscópicos compuestos por nanopartículas y células bacterianas. Por el contrario, NP−, incluso a altas concentraciones, mostró una baja capacidad de captura de bacterias. En general, estas observaciones demostraron que el NP + tiene una capacidad de captura significativamente mayor que el NP−.

Aunque las bacterias grampositivas y gramnegativas tienen diferencias en la estructura de su membrana, la mayoría de ellas tienen una carga negativa cuando se cultivan a valores de pH fisiológico [15, 16]. La carga de la superficie celular de las células bacterianas se ha caracterizado por cromatografía de interacción electrostática (ESIC) [17]. La pared celular de las bacterias grampositivas se compone principalmente de una capa gruesa de peptidoglicano, que es ácido teicoico incrustado. Por otro lado, las bacterias gramnegativas tienen una capa de lipopolisacárido en la superficie externa seguida de una capa delgada de peptidoglicano. El ácido teicoico y los lipopolisacáridos imparten una carga negativa a la superficie de las células bacterianas [18]. Anteriormente, las nanopartículas de plata cargadas positivamente (AgNP) mostraban una notable eficacia contra los microorganismos, incluido E. coli [19]. Descubrieron que las partículas más pequeñas tienen una mayor actividad antibacteriana. Consideramos que las partículas más grandes pueden tener un beneficio diferente de la capacidad de absorción bacteriana. En primer lugar, las partículas más grandes alcanzan con dificultad el contenido nuclear de las células y causan toxicidad a las bacterias. En segundo lugar, pueden proporcionar una mayor superficie y, por lo tanto, una interacción bacteriana más fuerte. Por lo tanto, diseñamos y aplicamos nanopartículas más grandes cargadas positivamente como un agente de "esponja" para capturar bacterias.

Conclusiones

En conclusión, mediante nanopartículas magnéticas PEI, hemos demostrado un ensayo simple y rápido para permitir E. coli para ser capturado y analizado. Los archivos existentes de perfiles ópticos y TEM de bacterias permiten una fácil identificación de las bacterias capturadas. La alta recuperación proporcionada por las nanopartículas magnéticas cargadas positivamente permitirá la detección de otras cepas de bacterias en concentraciones ultrabajas.

Abreviaturas

APTES:

3-aminopropil trietoxisilano

CFU:

Unidad formadora de colonias

DLS:

Dispersión de luz dinámica

E. coli :

Escherichia coli

NP:

Nanopartículas magnéticas cargadas negativamente

NP +:

Nanopartículas magnéticas cargadas positivamente

NP:

Nanopartículas

PAA:

Ácido poliacrílico

PEI:

Polietilenimina

SD:

Desviación estándar

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

TEOS:

Ortosilicato de tetraetilo

TRITC:

Tetrametilrodamina

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