Mejora de la magnetofección de nanopartículas magnéticas de polietilenimina en osteoblastos MG-63 utilizando un nuevo campo magnético uniforme

Descripción general de la magnetofección utilizando el complejo PEI-SPIO-NPs / pDNA. La polietilenimina revestida (LPEI) y las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIO-NP) están asociadas por la reacción de condensación por deshidratación. Para este propósito, los SPIO-NP se recubrieron con LPEI, es decir, el LPEI está fuertemente unido a la superficie de los SPIO-NP y forman juntos PEI-SPIO-NP. Si las PEI-SPIO-NP se mezclan con pDNA desnudo, el pDNA cargado negativamente se une a las PEI-SPIO-NP con carga positiva mediante adsorción electrostática. Las células se incuban con los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA en presencia de un campo magnético que atrae los complejos hacia las células. El resultado de la magnetofección es que esencialmente todas las células entran en contacto con los vectores y un alto porcentaje de células se transfectan rápidamente

Caracterización de complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA

La Figura 2a muestra que los PEI-SPIO-NP son aproximadamente esféricos y los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA parecen agregados, ambos con una dispersabilidad favorable, y la atracción entre cargas positivas y negativas hace que los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA puedan adquirir un tamaño pequeño. El bucle de histéresis de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA se muestra en la Fig. 2b. El porcentaje en peso de óxido de hierro en PEI-SPION-NPs medido por un espectrómetro de absorción atómica es 20,33 (± 2,87)%. La magnetización de saturación de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA fue de 21,5 (± 1,6) emu / g de hierro. A pesar de las propiedades magnéticas reducidas en comparación con las de las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas no modificadas, los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA exhibieron una excelente capacidad de respuesta magnética, que es necesaria para una magnetofección de alta eficiencia.

Características de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA. un TEM de complejos PEI-SPIO-NPs y PEI-SPIO-NPs / pDNA. b Bucles de histéresis de complejos SPIO-NP y PEI-SPIO-NP / pDNA. c Potencial zeta y diámetro hidrodinámico de complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA en varias proporciones N / P. d Imagen AFM en escala de grises y estructura molecular de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA. Los puntos rojos representan la ubicación del grupo químico SPIO, los puntos verdes indican átomos de nitrógeno, los puntos amarillos significan átomos de carbono y el átomo de fósforo está representado por un círculo blanco y un punto negro. e (a) Distribución de tamaño de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA y e (b) potencial zeta de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA medido por un instrumento de dispersión de luz dinámica Malvern Zetasizer. Los resultados se expresan como la media ± DE ( n =5)

El diámetro hidrodinámico y el potencial zeta se consideraron los parámetros indispensables de los portadores de genes. La Figura 2c muestra que el diámetro hidrodinámico de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA fue de 200 (± 21,7) nm con una relación N / P (NH ₂ —Grupo en PEI / PO ₄ —Grupo en pDNA) de 2,5 y 175 (± 16,4) nm cuando la relación N / P era 5, lo que indica que el cambio rápido de tamaño se produjo durante la transición del potencial de negativo a positivo. A partir de entonces, las fuerzas repulsivas entre los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA aumentaron con relaciones N / P más altas, lo que indica que el tamaño de las nanopartículas había aumentado.

Analizamos los tipos de enlaces químicos de acuerdo con la disposición de los átomos y especulamos más sobre la estructura molecular de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA. La estructura molecular de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA fue revelada indirectamente por microscopía de fuerza atómica (AFM, Fig.2d), que mostró que los grupos carboxilo de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas se combinaban con la amina primaria de PEI por el enlace amida. Además, el pDNA se envolvió en una cadena molecular de PEI mediante unión electrostática entre los grupos fosfato de la cadena de nucleótidos y los grupos amina de PEI, formando complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA. En la imagen de AFM en escala de grises, el punto rojo representa la ubicación de los átomos de hierro, el punto verde indica átomos de nitrógeno, los puntos amarillos significan átomos de carbono y el átomo de fósforo está representado por un círculo blanco con un punto negro.

Como se muestra en la Fig. 2e, el potencial de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA se detectó usando el instrumento de dispersión de luz dinámica. A pH =7, el potencial de las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIO-NP) era - 6,6 (± 1,1) mV, lo que indicaba la presencia de grupos carboxílicos en su superficie. El potencial de PEI-SPIO-NP fue de + 18,2 (± 1,5) mV. El potencial de PEI modificado con SPIO-NP se transformó en una superficie cargada positivamente, que podría usarse como un portador de genes que se combinan con pDNA cargado negativamente. Evaluamos el cambio en las cargas superficiales de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA en diferentes proporciones N / P. Los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA mostraron una carga superficial negativa incluso con una relación N / P baja de 2,5, que se tradujo gradualmente en una carga superficial positiva a medida que la relación N / P aumentaba a 5. Este aumento en las relaciones N / P en los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA resultó en un aumento en la carga superficial positiva de polyplexes. En una relación N / P de 10, el potencial de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA (N / P =10) fue de + 11,9 (± 1,2) mV, y la carga superficial alcanzó una meseta. Los complejos cargados positivamente entraron en contacto con la membrana celular cargada negativamente y permitieron la absorción celular de las nanopartículas complejadas [29]. Los PEI-SPIO-NP no solo se pueden utilizar como portadores de genes de pDNA cargado negativamente, sino que también contribuyen con un cierto nivel de magnetismo para la administración de fármacos dirigida y se convierten en el agente de contraste utilizado para la formación de imágenes de contraste por resonancia magnética (MRI) [30, 31]. .

Un requisito fundamental de los portadores de genes es que el portador de transfección debe formar eficazmente un complejo estable con ácidos nucleicos. Para evaluar su capacidad de unión, se mezclaron volúmenes similares de solución de PEI-SPIO-NPs y solución de pDNA a diferentes proporciones N / P y se agitaron en vórtex. A continuación, se analizó una alícuota de 10 µl de la mezcla mediante electroforesis en gel de agarosa (Fig. 3a). En contraste con el pDNA desnudo, la migración del plásmido se bloqueó completamente en una relación N / P de 5, lo que indica que las PEI-SPIO-NPs concentraron completamente el pDNA [32].

El ensayo de unión de pDNA y el ensayo de protección de pDNA de PEI-SPIO-NPs. un Electroforesis en gel de agarosa de complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA en varias proporciones N / P. b Análisis de movilidad electroforética de PEI-SPIO-NP / pDNA después del tratamiento con DNasa-I. Se incubaron PEI-SPIO-NP en varias proporciones N / P y pDNA (3 μg) a 37 ° C en un 5% de CO ₂ ambiente subhúmedo durante 30 min con DNasa-I (4 U) en DNasa / Mg ²⁺ tampón de digestión que consta de Tris-HCl 50 mM (pH =7,6) y MgCl ₂ 10 mM . Después, la ADNasa I se inactivó añadiendo una solución de EDTA (pH =8) hasta que la concentración final fue de 2,5 mM. Luego, la muestra se incubó durante 15 min a 65 ° C y se agregaron 10 μL de 1 mg / ml de heparina sódica para liberar pDNA de PEI-SPIO-NPs / pDNA. La integridad del pDNA se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (90 V, 30 min)

Otra característica de las PEI-SPIO-NP como portadores de genes potenciales es que podrían proteger el pDNA de la degradación por nucleasas, favoreciendo así la transfección. La Figura 3b muestra que el ADNp desnudo es degradado significativamente por la ADNasa-I. Los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA en una relación molar N / P <5 se digirieron totalmente, mientras que los pDNA liberados de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA (N / P =5:1) permanecieron intactos. Los resultados de estos ensayos de protección de DNasa-I mostraron que los PEI-SPIO-NP protegían eficazmente el pDNA de la digestión de DNasa-I, lo que implica sus posibles aplicaciones a la terapia génica.

Como se muestra arriba, cuando N / P era <5, las PEI-SPIO-NP no podían proteger a los pDNA de la degradación por nucleasas. Los tamaños de los complejos PEI-SPIO-NPs / pDNA aumentaron cuando N / P era> 10, lo que no era adecuado para el transporte de vectores [33, 34]. El tamaño de los complejos PEI-SPIO-NP / pDNA fue el más pequeño y mostró estabilidad en N / P =5. Además, el potencial zeta de los PEI-SPIO-NP no aumentó significativamente cuando N / P> 10. Por lo tanto, Para asegurar la estabilidad de PEI-SPIO-NPs / pDNA, se seleccionó una relación N / P de 10 para los experimentos posteriores.

Generación de un campo magnético

El nuevo generador de campo magnético Halbach (Fig. 4a, b) fue desarrollado por nuestro grupo, en colaboración con el Colegio de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Chongqing [20, 21]. El novedoso generador de campo magnético está compuesto por nueve módulos de imanes permanentes cuboides idénticos y dos láminas de calce pasivas (Fig. 4c), que generan un campo magnético altamente uniforme en el plano horizontal.

El generador de campo magnético y su uniformidad de campo magnético y PEI-SPIO-NPs distribuidos en los diferentes campos magnéticos. un Medición de la uniformidad del campo magnético mediante Graussmeter. b Generador de campo magnético uniforme. c Imagen 3D de la disposición de imanes del generador de campo magnético uniforme (donde cada imán tiene un tamaño de 40 × 40 × 200 mm ³ ). d Generador de campo magnético de 96 pozos. e Uniformidad del campo magnético del generador de campo magnético de 96 pocillos. f Uniformidad del campo magnético del generador de campo magnético uniforme. g Distribución de PEI-SPIO-NP en un campo magnético de 96 pozos. h Distribución de PEI-SPIO-NP en campo magnético uniforme. yo La distribución del plano XOY del campo magnético uniforme (50 mm × 50 mm) y j Distribución 3D del campo magnético uniforme

La estructura del imán de optimización puede generar un campo magnético que se distribuye de manera plana en la dirección horizontal del área de 50 mm × 50 mm en el plano YOZ. La pendiente se distribuye en dirección vertical con una pendiente de 2 mT / mm. El campo magnético se distribuye uniformemente en un área XOY de 50 mm × 50 mm con una uniformidad de 1,3 × 10 ⁻³ y un campo magnético de 0.0739 T, las fuerzas magnéticas del plano coronal y planos sagitales donde se colocó la placa de cultivo celular son respectivamente 0.0632 T y 0.07 T. La diferencia de uniformidad de cada pocillo en la placa magnética de cultivo celular de 96 pocillos fue de aproximadamente 80% (Fig. 4d, e). Sin embargo, la diferencia de uniformidad de cada pocillo en el nuevo campo magnético de Halbach es menor que 2 ‰, por lo que la diferencia de uniformidad entre los dos campos magnéticos es> 100 veces (Fig. 4f). En este caso, configuramos una placa magnética de cultivo celular de 96 pocillos como un campo magnético no uniforme, y el nuevo campo magnético de Halbach es un campo magnético relativamente uniforme, que se utilizó como herramienta experimental para estudios posteriores.

La distribución de PEI-SPIO-NP se vio significativamente afectada por el campo magnético. Los PEI-SPIO-NP se hundieron gradualmente debido a la gravedad y se distribuyeron aleatoriamente en ausencia del campo magnético. Tras la aplicación de un campo magnético, los PEI-SPIO-NP se hundieron rápidamente hasta el fondo de las placas. Además, la distribución también podría cambiar significativamente en diferentes campos magnéticos. En el campo magnético convencional no uniforme (placa magnética de cultivo celular de 96 pocillos), las PEI-SPIO-NP se reunieron en masas o bandas y se distribuyeron junto con las líneas de fuerza magnética (Fig. 4g). Sin embargo, los PEI-SPIO-NP se distribuyeron uniformemente en el campo magnético uniforme inducido por el nuevo generador de campo magnético (Fig. 4h). Como puede verse en la distribución del plano XOY y la distribución 3D del campo magnético (Fig.4i, j), el área roja en la figura es un campo magnético relativamente uniforme, con una uniformidad de aproximadamente dos milésimas ( Z =10 mm), y se puede ver que el gradiente del campo magnético en la región objetivo es de aproximadamente 1,3 t / m (130 G / cm). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P  < 0.05) and lower than that of the control group (P  > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P <0,05). As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P  < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Comparison of cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes, and different nanoparticles with pDNA and without pDNA on MG-63 osteoblasts. Cytotoxicity is detected by the CCK-8 test kit, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm, which reflects the cell viability, and the high viability is indicative of the low cytotoxicity. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P  < 0.05, **P < 0.01). un The cytotoxicity effects of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes on MG-63 osteoblasts. b The cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field on MG-63 osteoblasts and c the cytotoxicity effects of different nanoparticles with pDNA and without pDNA

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37]. Sonawane et al. [38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

Intracellular tracking of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes in the presence of uniform magnetic field (uniform MF) or non-uniform magnetic field (non-uniform MF) and PEI-NPs/pDNA complexes without magnetic field (No MF) at 6, 12, and 24 h post-transfection to MG-63 osteoblasts. Confocal images were obtained from three channels and overlaid:red indicates RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes (excitation:554 nm; emission:576 nm), green represents lysosomes stained with Lysotracker-DND26 and the homogeneous green in the cytoplasm implies GFP expression (excitation:443 nm; emission:505 nm), blue signifies the nuclei stained by the Hochest 33342. (excitation:359 nm; emission:461 nm)

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P  < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

MG-63 osteoblasts transfected with PEI-SPIO-NPs/pDNA or PEI-NPs/pDNA under the condition of no magnetic field, non-uniform magnetic field, or uniform magnetic field. GFP-pDNA was used for reporter gene in combination with PEI-NPs or PEI-SPIO-NPs (N/P = 10), and the cells were exposed to the non-uniform or uniform magnetic fields for 20 min. At 24-h post-transfection, cell images were captured under an inverted fluorescent microscope. PolyMag-200 comprise commercial magnetic transfection reagents that were used as positive control, naked pDNA was used as the negative control. un At × 40 magnification in an inverted fluorescent microscope. b Transfection efficiency was calculated by flow cytometer and c statistical analysis of the transfection efficiency of PEI-SPIO-NPs/pDNA group, PolyMag-200/pDNA group and PEI-NPs/pDNA group. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P  < 0.05, **P  < 0.01)

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.