Inhibidor de la autofagia (LY294002) y nanoliposoma a base de combinación de 5-fluorouracilo (5-FU) para una eficacia mejorada contra el carcinoma de células escamosas de esófago

Resumen

En este estudio, se preparó un nanoliposoma PEGilado cargado con 5-fluorouracilo (5-FU) y LY294002 (LY) para atacar el carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC). Las partículas se caracterizaron en términos de parámetros fisicoquímicos y biológicos. La coadministración de inhibidor de la autofagia y fármaco quimioterapéutico en un solo vehículo se logró con éxito. Los dos componentes de 5-FU y nanoliposoma PEGilado cargado con LY (FLNP) se liberaron de manera controlada con LY relativamente más rápido en comparación con el de 5-FU. FLNP mostró una captación celular mediada por receptores que permitirá la liberación gradual del fármaco en el entorno ácido. La captación celular de nanopartículas (NP) se confirmó además mediante análisis FACS. La combinación de 5-FU y LY dio como resultado un mayor efecto citotóxico en comparación con el de los fármacos individuales. Lo más importante es que FLNP mostró un efecto anticanceroso significativamente mayor en las células cancerosas en comparación con las combinaciones de cócteles libres. La liberación más rápida de LY de FLNP conduce a la inhibición de la autofagia que mejora la sensibilidad de las células cancerosas hacia el 5-FU, lo que resulta en una mayor muerte celular. De manera constante, FLNP indujo una mayor apoptosis (~ 48%) de las células cancerosas en comparación con la de cualquier otro grupo. El análisis de transferencia de Western mostró claramente que 5-FU y LY aumentaron individualmente la expresión de caspasa-3 y PARP, mientras que, como se esperaba, FLNP indujo una expresión notable de estos marcadores proteicos que indicaban un efecto anticanceroso superior. Creemos que la liberación programada de un inhibidor de la autofagia y un fármaco quimioterapéutico de un solo nanoportador aumentará las perspectivas de la terapia contra el cáncer en ESCC.

Antecedentes

El carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC) es uno de los tipos comunes de cánceres de esófago que son más frecuentes en el este de Asia, como China [1, 2]. La tasa de supervivencia a 5 años de ESCC es de alrededor del 25%. La cirugía es la principal opción de tratamiento para el tratamiento de ESCC; sin embargo, se cree que la quimioterapia adyuvante tendrá un gran impacto en el tratamiento con ESCC [3, 4]. Se ha informado de que el tratamiento quimioterapéutico basado en un único régimen farmacológico resultó en una eficacia terapéutica deficiente debido a la heterogeneidad de las células cancerosas [5]. Las células cancerosas a menudo son resistentes a fármacos antineoplásicos individuales y no serán eficaces por naturaleza. En este sentido, una combinación de dos o más fármacos actuará de forma sinérgica dirigiéndose a diferentes dianas celulares [6, 7]. Se ha informado que los inhibidores de la autofagia superan la resistencia a múltiples fármacos (MDR) de las células cancerosas. Cuando las células tienen una nutrición y un factor de crecimiento limitados, la autofagia proporciona la homeostasis muy necesaria al entorno del cáncer y contribuye a su supervivencia [8]. La autofagia también sirve para proteger las células cancerosas de los agentes quimioterapéuticos. En este estudio, hemos seleccionado LY294002 (LY) como inhibidor de la autofagia [9].

Varios estudios han informado que los inhibidores de la autofagia funcionan mejor cuando se combinan con un medicamento contra el cáncer. En este estudio, hemos seleccionado 5-fluorouracilo (5-FU) como agente quimioterapéutico. El 5-FU se ha indicado principalmente en el tratamiento de cánceres de células escamosas y se ha utilizado en pacientes con cáncer de mama y otros cánceres [10]. El 5-FU tiene un átomo de flúor en la posición C-5 del uracilo en lugar de hidrógeno. El efecto anticancerígeno del 5-FU surge de la regulación de varias moléculas como Bax y Bcl-2 e inducen la apoptosis de las células cancerosas [11, 12]. A pesar del potencial efecto citotóxico del 5-FU y LY, ambos agentes adolecen de problemas de baja solubilidad en agua y estabilidad, lo que da como resultado una semivida plasmática corta y efectos tóxicos indeseables en las células normales [6]. Además, una simple mezcla de ambos agentes anticancerosos no induce un efecto sinérgico debido a la liberación aleatoria de fármacos y la distribución incontrolada de fármacos en varios tejidos [7]. Por lo tanto, es sumamente importante administrar ambos medicamentos contra el cáncer de una manera programada y muy controlada, lo que aumentará su eficacia terapéutica.

Las nanopartículas se han investigado ampliamente como portadores de administración de fármacos para aplicaciones dirigidas al cáncer [13]. El fármaco poco soluble podría incorporarse de manera estable en las nanopartículas y, por lo tanto, podría mejorarse su solubilidad y biodisponibilidad. Entre todos los portadores, el liposoma ha sido ampliamente estudiado por su idoneidad para aplicaciones sistémicas [14, 15]. Estudios anteriores han demostrado que se encuentran disponibles muchas formulaciones liposomales comerciales, como Doxil, Myocet, LipoPlatin, etc. La circulación sistémica de los liposomas podría mejorarse mediante la conjugación superficial de polietileno (glicol) (PEG) como capa hidrófila [16]. La capa nanométrica e hidrófila de PEG conferiría la circulación sanguínea prolongada y reduciría las depuraciones plasmáticas mediadas por el reticuloendotelial (RES). Además, NP podría acumularse pasivamente en los tejidos tumorales a través del efecto mejorado de permeación y retención (EPR) [17, 18]. Por lo tanto, se puede esperar que si el fármaco quimioterapéutico y el inhibidor de la autofagia pudieran incorporarse en el portador único, tendrá un efecto anticanceroso sinérgico en la ESCC.

Hasta ahora, el objetivo principal del presente estudio fue administrar una combinación de 5-FU y LY para tratar ESCC. Para ello, se incorporaron de forma estable 5-FU y LY en el nanoliposoma PEGilado. Se esperaba que la liberación temprana del inhibidor de la autofagia (LY) interrumpiera el mecanismo protector de las células cancerosas y, posteriormente, el 5-FU actuará de manera más fuerte en las células cancerosas. El liposoma cargado con fármaco se caracterizó en términos de tamaño de partícula, forma y patrón de liberación. Se han realizado ensayos de captación celular y viabilidad celular en células cancerosas ESCC. Además, el ensayo de apoptosis se realizó mediante tinción con anexina V / PI y tinción Hoechst 33382. Finalmente, se realizó un estudio de eficacia antitumoral en un modelo animal de xenoinjerto portador de células ESCC.

Métodos

Materiales

El 5-fluorouracilo se adquirió en Sigma-Aldrich, China. La 2- (4-morfolinil) -8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona (LY294002, LY) se adquirió en Beijing Huafeng United Technology Corporation, China. L-a-fosfatidilcolina (huevo / pollo) (EPC), disteroilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol (2000) (DSPE-PEG) y colesterol se adquirieron en Avanti Polar Lipids, China. Todos los demás productos químicos eran de grado reactivo y se utilizaron para purificaciones posteriores.

Preparación de nanoliposomas cargados con fármacos duales

EPC, DSPE-PEG y colesterol se mezclaron en una mezcla de metanol-cloroformo (relación 10:4:1 M (total 10 mg)), y a esta mezcla orgánica, 5-FU (1,5 mg) y LY (1,5 mg) se adicional. Los disolventes orgánicos se evaporaron usando un evaporador rotatorio (Buchi, EE. UU.) A 60 ° C durante 1 h. La fina película de lípidos se hidrató con el tampón PBS durante 1 hora y luego se extruyó a través de una miniextrusora a través de una membrana de policarbonato (200 nm). El nanoliposoma cargado con fármaco se filtró a través de un tubo Millipore con un PM de 3500. El liposoma cargado con fármaco se recogió de la cámara superior y se determinó el fármaco no atrapado mediante el método de HPLC. La carga y la encapsulación del fármaco se calcularon mediante las siguientes ecuaciones:

$$ \ mathrm {DL} \ \ left (\% \ right) =\ left (\ mathrm {Peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {cargado} \ \ mathrm {fármaco} / \ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {liposoma} \ right) \ times 100 \% $$$$ \ mathrm {EE} \ \ left (\% \ right) =\ left (\ mathrm {Peso} \ \ mathrm { de} \ \ mathrm {cargado} \ \ mathrm {fármaco} / \ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {fármaco} \ \ mathrm {inicialmente} \ \ mathrm {añadido} \ derecha) \ veces 100 \% $$

Análisis del tamaño de partículas

El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de las nanopartículas se determinaron mediante la técnica de dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments, Reino Unido). El tamaño de partícula se midió a 25 ° C después de diluir apropiadamente con agua destilada. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

Análisis morfológico

La morfología de NP se estudió primero mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM; H-7600, Hitachi, Tokio, Japón) a un voltaje de aceleración de 100 kV. Las muestras se cargaron en una rejilla de cobre recubierta de carbono y se secaron. La morfología NP se observó además en microscopía de fuerza atómica (AFM). Las muestras se colocaron sobre una superficie de mica.

Estudio de lanzamiento in vitro

Se estudió la liberación in vitro de 5-FU y LY a partir de 5-FU y nanoliposoma PEGilado cargado de LY (FLNP) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a 37 ° C. La dispersión de NP (1 ml que contiene 1 mg de cada fármaco en un vehículo) se colocó en una membrana de diálisis (PM ~ 3500) y se sellaron ambos extremos. La membrana de diálisis se colocó en un tubo con 30 ml de medio de liberación. El tubo que contenía la membrana de diálisis se colocó en un baño de agitación y se dejó incubar durante el período de tiempo prerrequisito. En momentos específicos, se extrajeron 100 µl de la muestra y se sustituyeron por una cantidad igual de tampón nuevo. La cantidad de fármaco liberada en el tampón se estudió mediante el método de HPLC. Se utilizó un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Hitachi, Tokio, Japón) que consta de un muestreador automático L-2200 y un detector UV-Vis L-2420. Se utilizó una columna Inertsil C18 (150 mm × 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 μm; Cosmosil, Nacalai Tesque Inc., EE. UU.) Bajo elución isocrática de la fase móvil a un caudal de 1,0 mL / min y una temperatura de columna de 25 ° C. Se observó una buena linealidad entre 0,025 y 2 μg / ml para ambos fármacos con un coeficiente de correlación ( r ² ) alrededor de 0.9995. El LOD (μg / ml) para 5-FU y LY fueron 0.020 y 0.050, respectivamente. El LOQ (μg / ml) para 5-FU y LY fueron 0.070 y 0.150, respectivamente.

Cultivo celular

La línea celular de cáncer de esófago, EC 9706, se cultivó en medio RPMI normal con FBS al 10% y 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina en CO ₂ al 5% y atmósfera de 95% de humedad en el humidificador.

Análisis de absorción celular

La captación celular de NP se observó mediante microscopio de barrido láser confocal (CLSM). Para este propósito, se preparó NP cargado con rodamina B y se purificó mediante filtración en gel usando una columna Sephadex G-50 con tampón HEPES. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se incubaron durante la noche. A continuación, las células se expusieron con NP cargado con rodamina B (10 µg / ml) y se incubaron durante 2 h. Las células se lavaron con PBS tres veces y se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 2% y se lavaron de nuevo con PBS. A continuación, las células se tiñeron con DAPI como agente de tinción nuclear. Las células se lavaron y observaron bajo un microscopio de fluorescencia (microscopio Nikon TE2000-E).

La captación celular se observó adicionalmente usando un citómetro de flujo. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se incubaron durante la noche. A continuación, las células se expusieron con NP cargado con rodamina B y se incubaron durante 1 hy 2 h, respectivamente. A continuación, las células se extrajeron y se lavaron dos veces con PBS. Las células se resuspendieron en tampón PBS y se analizaron usando un clasificador de células activado por fluorescencia Calibur equipado con el software CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San José, CA, EE. UU.).

Ensayo de citotoxicidad

El potencial citotóxico de las formulaciones individuales se evaluó mediante el ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetil-2-tiazoil) -2,5-difenil tetrazolio (MTT). Brevemente, 1 × 10 ⁴ las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. A continuación, las células se expusieron con diferentes concentraciones de 5-FU, LY, 5-FU + LY y FLNP libres, respectivamente, y se incubaron adicionalmente durante 24 h. Se prepararon soluciones de MTT (5 mg / ml) y se añadieron 10 µl de solución de MTT a cada pocillo y se incubaron durante 4 h. El cristal de formazán se extrajo agregando DMSO y la absorbancia se estudió usando un lector de microplacas (Synergy ™ HTX Multi-Mode Microplate Reader) (a 570 nm).

Ensayo de apoptosis

La apoptosis de la célula cancerosa se determinó mediante el protocolo de tinción de Anexina-V / PI (BD Biosciences, EE. UU.). Brevemente, se sembró EC 9706 en una placa de 12 pocillos y se incubó durante 24 h. Las células se incubaron con 5-FU, LY, 5-FU + LY y FLNP libres, respectivamente, y se incubaron adicionalmente durante 24 h (1 µg de concentración de fármaco equivalente). Las células se extrajeron y se tiñeron con anexina V-FITC y PI durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se enumeraron mediante análisis de citometría de flujo utilizando un software FACS CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San José, CA, EE. UU.).

Ensayo Hoechst 33342

La apoptosis de la célula cancerosa se determinó además mediante el protocolo de tinción Hoechst 33342. Brevemente, se sembró EC 9706 en una placa de 12 pocillos y se incubó durante 24 h. Las células se incubaron con 5-FU, LY, 5-FU + LY y FLNP libres, respectivamente, y se incubaron adicionalmente durante 24 h (1 µg de concentración de fármaco equivalente). Las células se fijaron con PFA al 2% y se incubaron con Hoechst 33342 (1 μg / ml) durante 15 min. A continuación, se observó la apoptosis celular con un microscopio de fluorescencia.

Western Blot

Se sembraron células EC 9706 y se trataron con 5-FU, LY, 5-FU + LY y FLNP libres, respectivamente, y se incubaron adicionalmente durante 24 h. A continuación, las células se lisaron y el sobrenadante se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación con el anticuerpo secundario conjugado peroxidasa de rábano picante, se revelaron transferencias utilizando el sistema ECL (AbClon) para la detección de señales. Las películas se desarrollaron utilizando un procesador Kodak M35-A X-OMAT.

Inhibición del crecimiento tumoral in vivo

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las pautas famosas por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales, Hospital Popular Subei de la provincia de Jiangsu, China. Se inoculó a ratones desnudos hembra de 6 semanas de edad con 1 × 10 ⁶ Células OE-19 en el flanco derecho de los ratones en 100 μl de medio. Se permitió que los tumores crecieran hasta 80 mm ³ (día 10). El animal se dividió en cinco grupos con seis ratones en cada grupo. A los ratones se les inyectaron las respectivas formulaciones a una dosis fija de 5 mg / kg y se les administró tres veces durante los primeros 10 días del experimento. El tamaño del tumor se midió en términos de volumen del tumor usando calibres vernier y el tamaño estimado usando la fórmula; Volumen =(ancho ² × longitud) / 2.

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± desviaciones estándar. La significancia estadística se determinó usando t prueba y análisis de varianza (ANOVA). P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Las células cancerosas a menudo son resistentes a fármacos antineoplásicos individuales y no serán eficaces por naturaleza. En este sentido, una combinación de dos o más fármacos actuará de forma sinérgica dirigiéndose a diferentes dianas celulares. Se ha informado que los inhibidores de la autofagia superan la resistencia a múltiples fármacos (MDR) de las células cancerosas. Varios estudios han informado que los inhibidores de la autofagia funcionan mejor cuando se combinan con un medicamento contra el cáncer. En este estudio, hemos seleccionado 5-fluorouracilo (5-FU) como agente quimioterapéutico y LY294002 (LY) como inhibidor de la autofagia. Para abordar los problemas de solubilidad y estabilidad de los fármacos libres, que a su vez dan como resultado una semivida plasmática corta y un efecto tóxico indeseable, hemos incorporado de forma estable 5-FU y LY en el nanoliposoma PEGilado (Fig. 1).

Preparación y caracterización de nanoliposomas cargados con 5-FU y LY

El liposoma cargado con doble fármaco se preparó mediante el método de hidratación de película fina. Se encontró que el tamaño de partícula promedio del liposoma en blanco era ~ 110 nm con un índice de dispersión excelente. El tamaño de partícula del liposoma cargado con fármaco dual (FLNP) aumentó a ~ 150 nm con un buen índice de polidispersidad (PDI ~ 150) (Fig. 2a). El aumento del tamaño de las partículas se atribuyó principalmente a la incorporación de fármacos hidrófobos en el liposoma. Se ha informado que un tamaño de partícula de alrededor de 200 nm mejorará la acumulación de fármaco en los tejidos tumorales en virtud del efecto de permeación y retención mejorada (EPR). El liposoma cargado con fármaco exhibió una capacidad de almacenamiento a largo plazo atribuida a la presencia de PEG en su superficie que contribuyó al efecto antiincrustante. Además, FLNP exhibió una carga superficial media de ~ 25 mV, lo que indica su estabilidad coloidal. La carga superficial negativa evitará interacciones en las circulaciones sistémicas.

La morfología de FLNP se observó por primera vez utilizando TEM (Fig. 2b). Como se ve, las partículas tenían una forma esférica típica y estaban uniformemente dispersas en la rejilla de cobre. Una capa ligeramente grisácea en la circunferencia se atribuyó a la presencia de PEG en su superficie. El tamaño de partícula observado de TEM fue ligeramente más pequeño en comparación con el de DLS. El tamaño de partícula de TEM fue ~ 130 nm en comparación con ~ 150 nm de DLS. La diferencia de tamaño de las partículas de dos técnicas podría atribuirse al estado de medición. El TEM mide la partícula en condiciones secas mientras que el DLS mide la partícula en condiciones hidratadas y el alargamiento de la cadena de PEG. La morfología de las partículas fue confirmada adicionalmente por AFM (Fig. 2c). Las partículas eran circulares y estaban presentes como un objeto aplanado en la superficie de la mica.

Carga de fármaco y liberación de fármaco in vitro

FLNP mostró una alta eficacia de atrapamiento para ambos fármacos (92,5% para 5-FU y 86% para LY) con una carga activa de fármaco de aproximadamente ~ 16% w / w . El comportamiento de liberación in vitro de 5-FU y LY de FLNP se observó en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). Los dos componentes del FLNP se liberaron de forma controlada en condiciones de pH 7,4. Por ejemplo, ~ 30% de 5-FU y ~ 40% de LY liberado del liposoma al final de las 24 h. La liberación de fármacos continuó hasta 90 h con ~ 60% de 5-FU y ~ 75% de LV liberado (Fig. 3). Cabe señalar que la velocidad de liberación disminuyó significativamente después de 24 h hasta 90 h, lo que indica la lenta difusión de los fármacos desde el sistema NP. Tal liberación controlada del fármaco sería beneficiosa para las aplicaciones dirigidas al cáncer. Además, una liberación lenta del fármaco en condiciones neutrales indica efectos secundarios menores en los tejidos normales. Vale la pena señalar que LY se lanzó relativamente más rápido en comparación con el 5-FU. Será una situación beneficiosa, ya que el LY haría que las células cancerosas fueran más sensibles al 5-FU, lo que produciría un efecto citotóxico mejorado en los tejidos tumorales.

Estudio de internalización celular

Se realizó microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para determinar el patrón subcelular de FLNP. La rodamina B se utilizó como sonda fluorescente para rastrear la captación intracelular de las NP en ESCC. Como se ve (Fig. 4), se observó una fuerte señal de fluorescencia roja en el citoplasma celular en la circunferencia del núcleo que indica la captación celular mediada por endocitosis típica. La captación celular mediada por receptores permitirá la liberación gradual del fármaco en el entorno ácido. El tamaño nanométrico de la partícula permitió la internalización fácil del sistema NP. Los resultados mostraron claramente que el fármaco ingresó a las células cancerosas a través de una vía específica en lugar de la simple difusión. La captación celular se controló adicionalmente mediante FACS. Como se ve, se observó una captación notable de NP después de 1 h de incubación y la captación celular aumentó con el aumento del tiempo de incubación (2 h). La mayor captación celular de NP aumentará la concentración intracelular de fármacos anticancerosos encapsulados que incrementarán aún más la eficacia terapéutica en ESCC.

Efecto anticáncer in vitro

El efecto citotóxico de formulaciones individuales se estudió mediante ensayo MTT (Fig. 5). Como se muestra, los fármacos libres así como el NP combinatorio exhibieron un efecto citotóxico dependiente de la concentración típico en ESCC. El 5-FU exhibió un efecto anticanceroso relativamente mayor en comparación con el de LY en las células cancerosas. La combinación de 5-FU y LY dio como resultado un mayor efecto citotóxico en comparación con el de los fármacos individuales. Lo más importante es que FLNP mostró un efecto anticanceroso significativamente mayor en las células cancerosas en comparación con las combinaciones de cócteles libres. El valor de CI50 de 5-FU, LY, 5-FU + LY y FLNP se mantuvo en 2,68 µg / ml, 5,98 µg / ml, 1,54 µg / ml y 0,58 µg / ml, respectivamente. Esto podría atribuirse al hecho de que LY puede inhibir la autofagia en las células cancerosas y hacerlas más sensibles al 5-FU. Cabe señalar que el FLNP fue más eficaz que las combinaciones de cócteles gratuitos debido a una liberación de fármacos más programada de manera controlada. La liberación más rápida de LY de FLNP conduce a la inhibición de la autofagia que mejora la sensibilidad de las células cancerosas hacia el 5-FU, lo que resulta en una mayor muerte celular [19]. Se ha informado que el 5-FU después de ingresar a las células cancerosas se convirtió en fluorouridina trifosfato (FUTP) a través del fluorouridina monofosfato (FUMP) o se metabolizó en fluorodesoxiuridina trifosfato (FdUTP) a través de dos vías diferentes. El FdUTP actúa como sustrato de la timidilato sintasa (TS) y bloquea la síntesis de nucleótidos. El metabolito 5-FU se une al sitio de unión de nucleótidos del TS e inhibe la síntesis de nucleótidos. Este ciclo conduce al agotamiento del trifosfato de desoxitimidina (dTTP) que evitará la síntesis de ADN y dará como resultado una mayor muerte de las células cancerosas [20, 21].

Ensayo sobre apoptosis

El efecto de apoptosis de la formulación se evaluó mediante el método de tinción de Anexina-V / PI (Fig. 6a, b). Esto permitirá determinar el efecto de apoptosis del individuo así como el sistema de combinación de fármacos. De acuerdo con el ensayo MTT, el 5-FU (~ 20%) resultó en una mayor apoptosis de las células cancerosas en comparación con la de LY (~ 12%), mientras que la combinación de 5-FU + LY indujo una mayor muerte celular apoptótica (~ 30%). En comparación con cualquier otro grupo, el FLNP indujo una mayor apoptosis (~ 48%) de las células cancerosas, lo que sugiere que la captación celular mediada por receptores aumentó en gran medida la concentración intracelular de fármacos contra el cáncer, lo que resultó en un mayor efecto terapéutico. Una razón importante del mayor efecto anticanceroso de FLNP se atribuyó principalmente a la liberación secuencial de fármacos encapsulados en los que LY sensibilizará las células tumorales y el 5-FU inducirá sus potentes efectos citotóxicos. Las terapias contra el cáncer funcionan induciendo la apoptosis en las células cancerosas sin dañar las células normales circundantes. La apreciable actividad apoptótica de FLNP se atribuyó principalmente a la mayor acumulación de nanopartículas en las células a través de la absorción de endocitosis y la liberación secuencial de fármacos en el entorno intracelular que resultó en un efecto terapéutico sinérgico. Se esperaba que una liberación temprana del inhibidor de la autofagia (LY) interrumpiera el mecanismo protector de las células cancerosas y, posteriormente, el 5-FU actuará de manera más fuerte en las células cancerosas.

Análisis de Western Blot

El mecanismo de acción de las formulaciones se determina mediante análisis de transferencia Western (Fig. 7). La expresión de los niveles de proteínas proapoptóticas y antiapoptosis tras la exposición a las respectivas formulaciones se presenta en la Fig. 8. p53 es uno de los reguladores importantes del ciclo celular, y su regulación a la baja está asociada con el aumento de la supervivencia de las células cancerosas. Se puede ver que las formulaciones redujeron significativamente los niveles de expresión de p53, lo que indica el notable efecto sobre las células ESCC. Se ha informado de que el daño del ADN da como resultado la activación de la cascada de caspasas que da como resultado la escisión de PARP-1, que se considera un sello distintivo de la apoptosis celular [22, 23]. Nuestros resultados mostraron claramente que 5-FU y LY aumentaron individualmente la expresión de caspasa-3 y PARP, mientras que, como era de esperar, FLNP indujo una expresión notable de estos marcadores proteicos, lo que indica un efecto anticanceroso superior. De manera consistente, FLNP redujo significativamente la expresión de la proteína antiapoptótica (Bcl-2), lo que indica su eficiencia para mejorar la eficacia terapéutica en ESCC.

Análisis de inhibición del crecimiento tumoral in vivo

A los ratones se les inyectaron las respectivas formulaciones en ratones y se anotó el volumen del tumor hasta los 20 días. Como se ve (Fig. 8), el grupo de control mostró un aumento constante en el volumen del tumor con cada punto de tiempo hasta el día 18. En comparación con el control, los fármacos libres controlaron el crecimiento del tumor; sin embargo, no fue satisfactorio. La mezcla de cóctel de dos fármacos fue relativamente más eficaz que los fármacos individuales para controlar el volumen del tumor. Es importante destacar que FLNP mostró significativamente ( p <0,05; p <0,0001) mayor eficacia antitumoral en comparación con cualquier otro grupo. El volumen final del tumor fue de ~ 500 mm ³ en comparación con ~ 1400 mm ³ para ratones no tratados. El efecto antitumoral significativamente mayor en el modelo tumoral se atribuyó al tamaño nanométrico de la partícula que podría acumularse en los tejidos tumorales debido al efecto mejorado de permeación y retención. La liberación controlada de fármacos en los tejidos tumorales también contribuyó a su mayor eficacia [24].

Conclusiones

En conclusión, el nanoliposoma PEGilado cargado con 5-fluorouracilo (5-FU) y LY294002 (LY) se preparó con éxito para atacar el carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC). FLNP mostró una captación celular mediada por receptores que permitirá la liberación gradual del fármaco en el entorno ácido. La combinación de 5-FU y LY dio como resultado un mayor efecto citotóxico en comparación con el de los fármacos individuales. Lo más importante es que FLNP mostró un efecto anticanceroso significativamente mayor en las células cancerosas en comparación con las combinaciones de cócteles libres. La liberación más rápida de LY de FLNP conduce a la inhibición de la autofagia que mejora la sensibilidad de las células cancerosas hacia el 5-FU, lo que resulta en una mayor muerte celular. De manera constante, FLNP indujo una mayor apoptosis (~ 48%) de las células cancerosas en comparación con la de cualquier otro grupo. El análisis de transferencia de Western mostró claramente que 5-FU y LY aumentaron individualmente la expresión de caspasa-3 y PARP, mientras que, como se esperaba, FLNP indujo una expresión notable de estos marcadores proteicos que indicaban un efecto anticanceroso superior. Creemos que la liberación programada de un inhibidor de la autofagia y un fármaco quimioterapéutico de un solo nanoportador aumentará las perspectivas de la terapia contra el cáncer en ESCC. Un estudio más amplio sobre diferentes carcinomas de células escamosas y el desarrollo del modelo ortotrópico y el modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) serán objeto de investigación futura.

Abreviaturas

5-FU:: 5-fluorouracilo
EPR:: Efecto de penetración y retención mejorado
ESCC:: Carcinoma de células escamosas de esófago
FLNP:: Nanopartículas lipídicas cargadas con 5-FU y LY

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