Células madre mesenquimales marcadas con nanopartículas de azul de Prusia:evaluación de la viabilidad celular, proliferación, migración, diferenciación, citoesqueleto y expresión de proteínas in vitro

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) se han utilizado para el tratamiento de diversas enfermedades humanas. Para comprender mejor el mecanismo de esta acción y el destino de estas células, se ha utilizado la resonancia magnética (IRM) para el seguimiento de las células madre trasplantadas. Se ha demostrado que las nanopartículas de azul de Prusia (PBNP) tienen la capacidad de marcar las células para visualizarlas como un agente de contraste de resonancia magnética eficaz. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar la eficiencia y los efectos biológicos de las MSC etiquetadas utilizando PBNP. Primero sintetizamos y caracterizamos las PBNP. Luego, el sistema de análisis celular en tiempo real iCELLigence reveló que las PBNP no alteraron significativamente la viabilidad celular, la proliferación y la actividad de migración en las MSC marcadas con PBNP. La tinción de Oil Red O y la tinción de Alizarin Red revelaron que las MSC marcadas también tienen una capacidad de diferenciación normal. La tinción con faloidina no mostró ningún efecto negativo de las PBNP en el citoesqueleto. El análisis de transferencia Western indicó que las PBNP tampoco cambiaron la expresión de β-catenina y vimentina de las MSC. En la resonancia magnética in vitro, los sedimentos de las MSC incubadas con PBNP mostraron un claro efecto de oscurecimiento de la señal de resonancia magnética. En conclusión, las PBNP se pueden utilizar de forma eficaz para el etiquetado de las MSC y no influirán en las características biológicas de las MSC.

Antecedentes

Las células madre mesenquimales, un tipo de célula madre adulta, tienen la capacidad de tener un potencial antiinflamatorio y regenerativo y pueden migrar a los tejidos lesionados para ayudar a la recuperación de la función dañada [1]. Pueden diferenciarse en múltiples tipos de células bajo el microambiente específico y se recolectan fácilmente de tejido adulto y fetal [2]. Por lo tanto, las células madre mesenquimales (MSC) se han utilizado para la medicina regenerativa y la terapia oncológica como una herramienta prometedora debido a estas excelentes propiedades [3, 4]. Sin embargo, el destino de las CMM después del trasplante en el cuerpo sigue sin estar claro, y el seguimiento no invasivo de las CMM es necesario in vivo para evaluar la eficacia del trasplante y su destino, propiedades y localización [5]. Recientemente, la resonancia magnética (MRI) como tecnología eficaz se ha obtenido ampliamente para investigar la información estructural y funcional de las células madre mesenquimales in vitro e in vivo [6].

En los últimos años, se utilizaron múltiples nanopartículas para etiquetar las CMM como una herramienta prometedora para la obtención de imágenes no invasivas de células para registrar su distribución y destino in vivo e in vitro, e incluso se utilizaron para el tratamiento de tumores [7]. Por ejemplo, las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) y los puntos cuánticos (QD) se han utilizado para etiquetar células durante muchos años [8, 9]. Y se utilizaron nanopartículas magnéticas fluorescentes (FMNP) para etiquetar las CMM con el fin de realizar la obtención de imágenes específicas y la terapia sinérgica de las células de cáncer gástrico in vivo [10]. Para estas etiquetas novedosas, se necesita un análisis cuidadoso y completo de la toxicidad celular porque todo tiene una dosis tóxica y puede perturbar la función celular aguas abajo [11]. Por ejemplo, las nanopartículas de óxido de hierro de contraste de resonancia magnética se atribuyeron a la generación de ROS y pueden causar la muerte celular [12].

Recientemente, se ha demostrado que las nanopartículas de azul de Prusia (PBNP) tienen potencial para ser un agente de contraste de resonancia magnética [13, 14, 15]. El azul de Prusia, considerado como un fármaco práctico, económico, seguro y respetuoso con el medio ambiente, ha sido aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) en la clínica para tratar la exposición radiactiva. Es importante destacar que los PBNP eran altamente dispersables y estables tanto en el agua como en entornos biológicos como el suero sanguíneo sin la aparición de agregación en 1 semana [16], y tenían una buena estabilidad fototérmica que podría reutilizar los PBNP durante aplicaciones prácticas [17]. Por ejemplo, Liang et al. [13] demostró en primer lugar que los PBNP con una fuerte absorción en la región NIR se pueden utilizar como un excelente agente de contraste para mejorar la formación de imágenes fotoacústicas. Los PBNP con tamaño uniforme y buena estabilidad coloidal se pueden fabricar a partir de agentes químicos de bajo costo de una manera fácil.

Los PBNP se han utilizado para etiquetar algunas células tumorales como agente de resonancia magnética en la investigación [18], pero se informaron pocos estudios sobre la aplicación de PBNP en las MSC. Aquí, informamos que las células madre mesenquimales marcadas con PBNP exhibieron viabilidad celular normal, proliferación, migración, citoesqueleto, diferenciación y expresión de proteínas in vitro. Se necesita más trabajo si esto es una realidad in vivo y para asegurarse de que la administración intralesional dirigida de MSC marcadas con PBNP sea tan crítica como se pensaba en el seguimiento celular.

Métodos

Cultivo celular

Las MSC de ratón C3H10T1 / 2 se obtuvieron de Nanjing KeyGen Biotech. Inc. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Hyclone, EE. UU.) Suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Israel) y penicilina-estreptomicina al 1% (Hyclone, EE. UU.) A 37 ° C con 5% de CO ₂ saturación, y el medio se cambió cada 3 días. Después de cuatro pases, las células se utilizaron para experimentos.

Preparación de PBNP

En una síntesis típica, primero se agregaron 2,5 mmol de ácido cítrico (490 mg) a 20 ml de FeCl ₃ acuoso 1,0 mM solución con agitación a 60 ° C. A esta solución se le añadió gota a gota 20 ml de K ₄ acuoso 1,0 mM. [Fe (CN) ₆ ] solución que contiene 0,5 mmol de ácido cítrico (98 mg) a 60 ° C. Inmediatamente se formó una clara dispersión azul brillante. Después de 30 min, se dejó enfriar la solución a temperatura ambiente y se continuó agitando durante otros 5 min a temperatura ambiente. Luego, se añadió un volumen igual de alcohol etílico a la dispersión y se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 min para dar como resultado la formación de un sedimento de nanopartículas. Este último se separó nuevamente mediante la adición de igual volumen de alcohol etílico y centrifugación.

Caracterización de PBNP

La espectroscopia de infrarrojos de los PBNP sintetizados se midió utilizando un espectrofotómetro de infrarrojos (IR; Thermo Fisher Nicolet IS10). La morfología de los PBNP sintetizados se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM; JEM 2100F). La magnetización dependiente del campo de los PBNP se investigó utilizando un magnetómetro de muestra vibrante (VSM; Lakeshore 7307). El análisis de difracción de rayos X (XRD) se realizó usando Bruker D8 ADVANCE A25X (XRD). El índice de polidisperistía de los PBNP fue determinado por Zetasizer Nano ZS.

Distribuciones intracelulares de PBNP y ultraestructura de células C3H10T1 / 2 etiquetadas

Se realizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para evaluar las distribuciones intracelulares de PBNP. Una vez eliminado el medio, las células se aclararon con PBS y luego se digirieron con tripsina al 0,25%. Luego, las células se transfirieron a un tubo EP de 1,5 ml para centrifugarlas (2000 rpm, 5 min). Luego, se eliminó el sobrenadante y las células se fijaron con glutaraldehído al 0,25% y ácido de osmio al 1%. Después de enjuagar las células de nuevo, las células se deshidrataron en etanol al 50%, etanol al 70%, etanol al 90%, acetona al 90% y acetona al 100% durante 20 min cada una. Luego, las células se incrustaron a 4 ° C durante la noche. A continuación, se realizó una doble tinción con acetato de uranio-citrato de uranio al 3% en las secciones. Finalmente, TEM recopiló las imágenes.

Se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para evaluar la ultraestructura de las células C3H10T1 / 2 marcadas. Una vez eliminado el medio, las células se aclararon con PBS y se fijaron con glutaraldehído al 3%, enfriando previamente a 4ºC durante la noche. Luego, las células se enjuagaron dos veces con PBS y se fijaron con ácido ósmico al 1% a 4 ° C durante 1 h. Después de enjuagar nuevamente las células C3H10T1 / 2, las células se deshidrataron en alcoholes graduados ascendentes (etanol al 30%, etanol al 50%, etanol al 70%, etanol al 80%, etanol al 90%, etanol al 95% y etanol al 100%) durante 2 × 10 min cada uno. Luego, las células se sumergieron en una solución de acetonitrilo al 70%, 80%, 90%, 95% y 100% durante 15 min cada una. Luego, se realizó el secado al vacío y el recubrimiento por pulverización de oro. Finalmente, las imágenes fueron recolectadas por SEM.

Análisis de viabilidad celular de los PBNP

La viabilidad celular se evaluó utilizando MTT (Sigma, EE. UU.). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 1 x 10 ³ células por pocillo a 37 ° C con 5% de CO ₂ atmósfera. Después de la incubación durante la noche, el medio de cultivo se reemplazó por 100 μL de medio fresco que contenía diferentes concentraciones de PBNP (0, 5, 10, 20, 40 y 80 μg / mL), y luego las células se cultivaron durante otros 1 a 3 días. Se retiró el medio de cultivo y las células se incubaron con 20 μL de MTT (5 mg / mL) a 37 ° C durante 4 h. Los cristales de tinte violeta precipitados se disolvieron en 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, EE. UU.) Durante 10 minutos agitando suavemente. El valor de densidad óptica (DO) se midió a una longitud de onda de 490 nm utilizando un lector de microplacas. Los resultados de las células se expresaron como porcentaje de células viables.

Ensayo de proliferación

En comparación con MTT, MTS, WST-1 y XTT, RTCA permite el análisis de todo el período del experimento y no requiere el etiquetado que afecta negativamente a los experimentos de cultivo celular [19]. Por tanto, se utilizó el sistema xCELLigence (Roche / ACEA Biosciences) para medir la proliferación celular en tiempo real. Brevemente, las células se sembraron en E-Plate-16 (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, EE. UU.) A 5 × 10 ³ células por pocillo con 150 μL de medio completo. Después de crecer 24 h, el medio se reemplazó por medio fresco que contenía varias concentraciones de PBNP y se incubó durante otras 96 h. Este sistema midió la impedancia eléctrica, que fue creada por la unión de las células en las placas de cultivo celular integradas con microelectrodos [20], para proporcionar la información cuantitativa sobre el número de células y la viabilidad en tiempo real mediante el instrumento RTCA-DP [21]. La proliferación celular se midió periódicamente cada 15 minutos durante los siguientes 4 días.

Monitoreo en tiempo real de la migración celular

La migración de células C3H10T1 / 2 se midió usando un sistema de ensayo de invasión y migración celular en tiempo real (RT-CIM) (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, EE. UU.). Las células tienen la capacidad de aumentar la impedancia para, por lo tanto, lecturas de "índice de células" cuando entran en contacto con los sensores y se adhieren a ellos debido a la migración de las células desde la cámara superior a la cámara inferior a través de la membrana. Simplemente, las células se sembraron en la cámara superior a una densidad de 4 × 10 ⁴ por pocillo en medio sin suero en presencia de diversas concentraciones de PBNP. Las cámaras inferiores de las placas CIM se llenaron con 165 μl de medio completo que contenía FBS al 10%. La migración celular se controló mediante un instrumento RTCA DP cada 10 min durante un período de 100 h. Se utilizó el índice celular (IC) para reflejar los resultados. El valor de CI se derivó del cambio en la impedancia eléctrica a medida que las células vivas interactúan con la superficie del microelectrodo biocompatible en el pozo de la microplaca para medir eficazmente el número, la forma y la adherencia de las células. Cuanto mayor sea el número de células migradas, mayor será el índice de células.

Investigación de migración celular a través del ensayo Transwell

Después de ser cultivadas con diferentes concentraciones de PBNP durante 48 h, las células con una densidad de 2 × 10 ⁶ celda / cm ² se cultivaron en una cámara Transwell (tamaño de poro de 8 μm; BD FalconTM, EE. UU.) durante 24 ha 37 ° C y 5% de CO ₂ . Después del cultivo, se limpió la cámara interior y las células migradas en el fondo de la cámara se fijaron y tiñeron con violeta cristal al 0,1%. A cada paso le siguió un lavado con PBS durante 5 min tres veces. Las células migradas se fotografiaron en diferentes campos de visión utilizando un microscopio de contraste de fase invertido (CK2, Olympus, Japón).

Diferenciación celular in vitro

Se indujeron las PBNP marcadas con células C3H10T1 / 2 o sin marcar para que se diferenciaran en dos linajes celulares de adipocitos u osteocitos aguas abajo. Una vez que las células alcanzaron la confluencia en una placa de seis pocillos, las células se cultivaron en medio de inducción osteogénica (FBS / DMEM al 10% que contenía dexametasona 10 nM, ácido ascórbico 50 μM, glicerofosfato β 10 mM, Sigma) o medio de inducción adipogénica (10% FBS / DMEM que contiene dexametasona 1 μM, isobutilmetilxantina 0,5 mM, insulina 10 μM, Sigma). Después de 3 semanas, las células se lavaron con PBS, se fijaron con polioximetileno al 4% y se tiñeron con rojo de alizarina o rojo de aceite O (Sigma). Las células inducidas se fotografiaron en diferentes campos de visión utilizando un microscopio de contraste de fase invertido (CK2, Olympus, Japón).

Ensayo de inmunofluorescencia para visualización de F-actina

Las MSC se cultivaron con diversas concentraciones de PBNP en una placa de 24 pocillos durante 48 h. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 min, se permeabilizaron con Triton-100 al 0,2% durante 5 min, se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente y luego se cultivaron con faloidina (1:100, Thermo Fisher Scientific , EE. UU.) Y DAPI (1:800, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) Durante 30 minutos a temperatura ambiente. La microscopía de fluorescencia se realizó en un microscopio Nikon eclipse Ti-S con software NIS Elements

Expresión de proteínas mediante análisis de transferencia Western

La expresión de proteínas de las células se evaluó mediante análisis de transferencia Western. Las MSC se cultivaron con el medio que contenía diferentes concentraciones de PBNP (0, 25, 50 μg / mL) en placas de seis pocillos durante 24 h, se lavaron dos veces con PBS helado y se rasparon en 100 μl de tampón PIPA (Beyotime) que contenía inhibidores de proteasa y ortovanadato de sodio (Beyotime, China). Después de 30 min, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min a 4 ° C, luego se determinaron las concentraciones de proteína de las muestras usando el kit BCA (Beyotime, China). La misma cantidad de proteínas se sometió a electroforesis en geles SDS-PAGE al 10% (Beyotime, China) y se transfirió a una membrana de PVDF (GE Healthcare). Las membranas se bloquearon con leche al 5% en solución salina tamponada con Tris con Tween20 (TBST) a temperatura ambiente durante 2 hy luego se incubaron con anti-β-catenina (1:1000, CST, EE. UU.), Anti-vimentina (1:1000 , Abiocode) y anti-β-actina (1:1000, CST, EE. UU.) Durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron tres veces durante 5 min cada una y luego se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados durante 2 ha temperatura ambiente. Las señales se detectaron con ECL y ECL-plus (Beyotime, China) y se expusieron al sistema Molecular Image® ChemiDoc ™ XRS + (Bio-Rad Inc., EE. UU.) Con el software Image Lab ™ utilizando quimioluminiscencia mejorada.

Investigación de imágenes celulares de la eficiencia del etiquetado celular mediante resonancia magnética

Las MSC se trataron con diferentes concentraciones (25 y 50 μg / mL) de PBNP, y las células de control se cultivaron con medio completo sin PBNP durante 48 h, se lavaron tres veces con tampón PBS, se tripsinizaron, recolectaron y luego se incrustaron en 1 mL 1 % ( w / v ) solución de agarosa para estudios de imágenes. Además, las MSC marcadas con 50 μg / ml de PBNP se indujeron a la diferenciación osteogénica durante 14 días, luego se examinó el efecto de la señal de resonancia magnética. Las imágenes ponderadas en T2 se realizaron utilizando una secuencia de eco de gradiente de recuperación de inversión con TE =23 ms, TR =400 ms, NEX =2,0, un grosor de corte de 2 cm, un FOV de 20 × 20 cm y un tamaño de matriz de 384 × 256.

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como media ± DE de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. Los grupos de tratamiento se compararon mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la t de Student se utilizó la prueba. p <0.05 fue aceptado como una diferencia significativa.

Resultados y discusión

Caracterización PBNP

Se realizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para caracterizar las PBNP (Fig. 1a), que tienen un diámetro de 20-25 nm. Para la morfología, los PBNP mostraron una estructura cuboidal. La Figura 1b muestra la espectroscopia infrarroja de los PBNP sintetizados. Las PBNP exhibieron un pico de absorción típico de Fe ³⁺ -CN en torno a 2085,23 nm, lo que coincide con el de los PBNP. La medición de magnetización dependiente del campo se utilizó además para estudiar las propiedades magnéticas de los PBNP. La Figura 1c muestra las curvas de magnetización de los PBNP a temperatura ambiente, lo que demuestra el superparamagnetismo de los PBNP. La Figura 1d muestra los picos de difracción a 200, 220, 400 y 420, que corroboraron con el patrón XRD de PBNP. Además, el índice de polidisperistía de los PBNP fue de 0,16, lo que indicó una distribución uniforme del tamaño de partículas.

Captación celular y citotoxicidad de PBNP

Para confirmar adicionalmente la captación celular de las PBNP a las MSC, se estudió la micromorfología celular de las células C3H10T1 / 2 anteriores tratadas con y sin las PBNP. La Figura 2 muestra imágenes SEM y TEM de células C3H10T1 / 2 después de la incubación durante 48 h con y sin PBNP. A partir de las imágenes SEM, la ultraestructura de las células C3H10T1 / 2 marcadas no tuvo cambios obvios en comparación con las células C3H10T1 / 2 de control. A partir de las imágenes TEM, las células C3H10T1 / 2 de control sin la incubación con las PBNP exhibieron una micromorfología celular típica con microestructuras celulares obvias. Sin embargo, después de la incubación con las PBNP, se observó claramente una distribución aleatoria de las PBNP en el citoplasma de las células C3H10T1 / 2. Y algunas PBNP parecían estar localizadas en vesículas dentro del citoplasma de las células. Aunque se observó la distribución aleatoria de las PBNP en el citoplasma de las células C3H10T1 / 2, el mecanismo exacto de captación intracelular no estaba claro. Proponemos que la internalización de las PBNP en las células C3H10T1 / 2 puede ocurrir a través de un mecanismo similar al demostrado en el estudio anterior, que informó que diferentes nanopartículas inorgánicas, incluido el azul de Prusia, poli (l-lisina), oro, plata y metaloxidos, pueden ser captado fácilmente por las células a través de la endocitosis [15, 22, 23].

Para evaluar la citotoxicidad y el ensayo de viabilidad celular en MSC, se realizó el método MTT. Las células se incubaron durante 1 a 3 días a 37 ° C bajo 5% de CO ₂ con diversas concentraciones de PBNP suspendidas en DMEM. Se realizaron tres ensayos independientes y se informaron los promedios y las desviaciones estándar. La Figura 3 muestra que la viabilidad de las MSC tratadas con PBNP (5, 10, 20, 40, 80 μg / mL) fue relativa a las células de control a las 24 a 72 h, respectivamente. Los resultados indicaron que las PBNP no eran tóxicas para las células tratadas con la misma cantidad de PBNP que MTT. Además, se utilizó un ensayo de proliferación en tiempo real utilizando el instrumento xCELLigence para investigar las curvas de crecimiento de las MSC. Los resultados mostraron que las curvas de crecimiento de las MSC no se vieron significativamente influenciadas por estas concentraciones de PBNP (Fig. 4a), y las viabilidades celulares se contaron y se mostraron en la Fig. 4b después del tratamiento en 24, 48, 72 y 96 h. Estos resultados sugieren que los PBNP no tienen ningún efecto sobre la proliferación de MSC.

Capacidad de migración celular

La migración de las MSC tratadas con diversas concentraciones de PBNP se probó utilizando el ensayo Transwell y una nueva técnica, el sistema de ensayo RT-CIM. A partir del ensayo de Transwell, las células marcadas no mostraron cambios obvios en la migración. Mediante el uso del sistema de ensayo RT-CIM, la migración celular se monitoreó en tiempo real, lo que reflejaba datos más precisos y podía predecir la capacidad de migración celular con mayor precisión. Desde el sistema de ensayo RT-CIM, aunque al comienzo del marcaje, las células marcadas migraron lentamente que las células no marcadas. Pero a las 72 y 96 h, no hubo una diferencia significativa en la migración celular entre las células marcadas y las no marcadas, lo que indica que las concentraciones altas de PBNP no afectaron la motilidad de las MSC (Fig. 5).

Diferenciación celular in vitro

La pluripotencia de las MSC marcadas y no marcadas se investigó mediante tinción con rojo de alizarina y rojo de aceite O. La Figura 6 muestra que las MSC marcadas se pueden diferenciar con éxito en adipocitos y osteocitos como lo hicieron las MSC no marcadas. Estos resultados sugieren que las PBNP no interfirieron con la capacidad de diferenciación de las células, lo que mantuvo la pluripotencia de las MSC marcadas.

Influencia de los PBNP de etiquetado en el citoesqueleto

Para investigar el efecto de las PBNP en el citoesqueleto de las MSC, se utilizó un ensayo de inmunofluorescencia de F-actina. La tinción con faloidina no muestra alteración de los filamentos rojos de actina del citoesqueleto después del marcaje durante 48 h en comparación con las MSC no marcadas. Una comparación de la integridad y distribución de los filamentos de actina en las células marcadas y no marcadas durante 48 h no reveló alteraciones (Fig. 7).

Análisis de Western Blot

Las vías de señalización Wnt desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, la formación de tejidos y el destino de las células madre [24]. Entonces, la β-catenina es la proteína funcional de las MSC. Además, la vimentina es el biomarcador mesenquimatoso y también es la proteína funcional de las CMM [25]. Estas dos proteínas se relacionan con la función biológica de las MSC. Las expresiones de β-catenina y vimentina se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. La Figura 8 muestra que la expresión de β-catenina y vimentina de las MSC tratadas con diversas concentraciones de PBNP durante 48 h no tuvo cambios significativos en comparación con la expresión de las MSC tratadas sin PBNP. Estos resultados indicaron que los PBNP no pueden cambiar la expresión de β-catenina y vimentina de las MSC, lo que mostró la estabilidad de la función biológica de las MSC después del tratamiento con PBNP.

Resonancia magnética in vitro

Las MSC, al igual que otras células madre, tienen el potencial de diferenciar células óseas, cartilaginosas, grasas, musculares y cardíacas, que se han convertido en una fuente importante para la medicina regenerativa. Y el seguimiento de la migración y el resultado de las CMM es muy importante para evaluar el papel y el resultado de las CMM exógenas en la reparación de defectos. La resonancia magnética (MRI) ayudó a observar las CMM después de la administración clínica, y es necesario un agente de contraste para MRI. Se ha demostrado el potencial de los PBNP utilizados como un agente de contraste de resonancia magnética celular ponderada en T2 eficaz [14], y algunos otros estudios también demostraron que la modificación de la superficie de los PBNP mejora su rendimiento en la resonancia magnética [17, 26]. Actualmente, el marcado de PBNP se ha utilizado en una variedad de células. Dumont y col. describió las PBNP como agentes para la resonancia magnética y la obtención de imágenes basadas en fluorescencia de tumores cerebrales pediátricos [27]; Perera et al. desarrolló los PBNP con gadolinio para la detección temprana de tumores en el tracto gastrointestinal [28]; y Cano-Mejia et al. terapia fototérmica (PTT) combinada basada en nanopartículas de azul de Prusia (PBNP) con inhibición del punto de control anti-CTLA-4 para tratar el neuroblastoma [29]. Sin embargo, rara vez hay informes relacionados sobre MSC marcadas con PBNP. Además, no está claro si existe alguna influencia negativa sobre la función celular y la viabilidad de las CMM después de etiquetar las PBNP

Para investigar si los PBNP tienen la capacidad de mejorar el contraste de las células por resonancia magnética ponderado en T2, incubamos las MSC con o sin PBNP y examinamos el efecto de la señal de resonancia magnética. Para monitorear la estabilidad temporal del etiquetado e investigar si las PBNP perderían su capacidad de formación de imágenes cuando las MSC se diferenciaran, incubamos las MSC con PBNP e inducimos a las MSC a la diferenciación osteogénica durante 14 días y luego examinamos el efecto de la señal de resonancia magnética. Como se muestra en la Fig. 9, los sedimentos de las MSC incubadas con PBNP mostraron un claro efecto de oscurecimiento de la señal de MRI y el valor de SI de las MSC marcadas tuvo una diferencia obvia con las MSC no marcadas. En particular, las MSC marcadas también mostraron un claro efecto de oscurecimiento de la señal de resonancia magnética cuando se induce la diferenciación. Estos resultados demostraron que los PBNP tenían el potencial de usarse como un agente de contraste T2 eficaz para la formación de imágenes celulares de las CMM y pueden ofrecer retención a largo plazo del agente de contraste incluso después de la diferenciación celular.

Hay muchos datos publicados de MSC marcadas con nanopartículas magnéticas (MNP), pero la aplicación de las MNP se vio limitada por su citotoxicidad. Cuando se administran MNP al tejido diana, la mayoría de las MNP se distribuyen a menudo en el hígado y el bazo, por lo que no se puede descuidar la toxicidad de las MNP [30]. Por ejemplo, Costa C descubrió que las SPION podrían producir citotoxicidad en células neuronales y células gliales [31]. Como mencionamos anteriormente, las PBNP no mostraron citotoxicidad detectable y no tuvieron efectos sobre las características celulares de las MSC, incluido el citoesqueleto, la morfología celular y la proteína funcional. Por lo tanto, la fuerza del uso de PBNP como un agente de contraste de resonancia magnética celular ponderada en T2 eficaz se demostraría en términos de citotoxicidad.

Conclusiones

En resumen, presentamos las PBNP al seguimiento de las células madre mesenquimales y estudiamos la supervivencia, el potencial de migración y las características celulares de las MSC después de haber sido etiquetadas con las PBNP. Además, también demostramos el potencial de las PBNP como un agente de contraste de resonancia magnética ponderada en T2 eficaz para la resonancia magnética celular de las CMM. Las PBNP se pueden utilizar de forma eficaz para el etiquetado de las MSC y no influirán en las características biológicas de las MSC. Esta conclusión allanó un nuevo camino para la etiqueta de MSC.

Abreviaturas

DMEM:: Medio Eagle modificado de Dulbecco
DMSO:: Dimetilsulfóxido
FBS:: Suero fetal bovino
IRM:: Imágenes por resonancia magnética
MSC:: Célula madre mesenquimal
NIR:: Infrarrojo cercano
OD:: Densidad óptica
PBNP:: Nanopartícula de azul de Prusia
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión
VSM:: Magnetómetro de muestra vibrante

Nanopartículas de quitosano-albúmina de suero bovino cargadas con curcumina potencialmente mejoraron la fagocitosis de Aβ 42 y la polarización de macrófagos modulada en la enfermedad de Alzheimer Propiedades de microestructura y reflectancia difusa mejoradas del revestimiento de nanocompuesto de dióxido de titanio híbrido

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