Portadores de lípidos nanoestructurados híbridos liofilizados para mejorar la absorción celular de verapamilo:optimización estadística y evaluación in vitro

Resumen

El verapamilo es un bloqueador de los canales de calcio y muy eficaz en el tratamiento de la hipertensión, la angina de pecho y otras enfermedades. Sin embargo, el fármaco tiene una baja biodisponibilidad del 20 al 35% debido al efecto de primer paso. El objetivo principal de este estudio fue desarrollar portadores de lípidos nanoestructurados híbridos de verapamilo-dextrano (HVD-NLC) en un intento por aumentar la captación celular de verapamilo. Las formulaciones se prepararon con éxito mediante un método de homogeneización de alto cizallamiento y se optimizaron estadísticamente utilizando 2 ⁴ diseño factorial completo. Las formulaciones de HVD-NLC se liofilizaron usando trehalosa como crioprotector. Los resultados mostraron que la fórmula optimizada (VER-9) poseía un tamaño de partícula (PS), índice de polidispersidad (PDI) y el porcentaje de eficiencia de atrapamiento (% EE) de 192.29 ± 2.98, 0.553 ± 0.075 y 93.26 ± 2.66% , respectivamente. La incorporación de sulfato de dextrano en la formulación había prolongado la liberación de verapamilo (~ 85% en 48 h) en el fluido gástrico simulado (pH 1,2) y el fluido intestinal simulado (pH 6,8). El análisis de calorimetría diferencial de barrido no mostró interacción química entre el verapamilo y los excipientes en la formulación. Mientras que los estudios de dispersión de rayos X de gran angular demostraron el fármaco en forma amorfa después de la incorporación en las NLC. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión y microscopía electrónica de barrido revelaron que las nanopartículas tenían forma esférica. El estudio de captación celular utilizando la línea celular Caco-2 mostró una mayor captación de verapamilo de HVD-NLC en comparación con la solución de verapamilo y el complejo verapamilo-dextrano. La formulación optimizada (VER-9) almacenada en condición refrigerada (5 ° C ± 3 ° C) fue estable durante 6 meses. En conclusión, los HVD-NLC eran portadores potenciales de verapamilo, ya que mejoraron significativamente la captación celular del fármaco.

Antecedentes

El verapamilo es un agente bloqueador de los canales de calcio de tipo L de la clase fenilalquilamina y un antagonista del receptor adrenérgico α. Se utiliza ampliamente para el tratamiento de la hipertensión, la taquiarritmia supraventricular, la angina de pecho y los dolores de cabeza en racimo. Según el sistema de clasificación biofarmacéutica, el verapamilo se clasifica como fármaco de clase I. Se sabe que los fármacos de esta clase tienen una buena absorción a través de la membrana intestinal (≤ 90%) tras la administración oral. Sin embargo, sólo del 20 al 35% de la dosis oral de verapamilo pasa a la circulación sanguínea debido al rápido metabolismo de primer paso a través de la circulación portal [1]. Por lo tanto, es importante desarrollar vehículos adecuados que puedan mejorar la captación celular de verapamilo y posiblemente mejorar su biodisponibilidad.

La segunda generación, las nanoformulaciones basadas en lípidos, como los portadores de lípidos nanoestructurados (NLC), exhibieron un gran potencial para su uso en la administración de agentes terapéuticos [2, 3]. Los NLC tienen una mayor estabilidad química y física en comparación con las nanopartículas de lípidos sólidos (SLN), y también tienen propiedades de liberación controlada. Además, las NLC exhiben una alta capacidad de carga de moléculas de fármaco al formar una red cristalina menos ordenada de matriz lipídica, que podría minimizar la expulsión del fármaco durante el almacenamiento. Los NLC se preparan a partir de lípidos, que aceleran la formación de quilomicrones dentro de los intestinos y facilitan la absorción de NLC que pueden aumentar la biodisponibilidad de los fármacos [4]. Por lo tanto, el presente estudio desarrolló transportadores de lípidos nanoestructurados híbridos de verapamilo-dextrano (HVD-NLC) para mejorar la captación celular del fármaco que puede conducir a aumentar su biodisponibilidad.

La mayoría de los fármacos lipofílicos se pueden incorporar fácilmente a los NLC, pero es bastante difícil atrapar fármacos hidrofílicos como el verapamilo en una nanoformulación basada en lípidos. Por tanto, en el presente estudio, se prepararon NLC híbridos que utilizan un contraión dextrano sulfato de sodio para mejorar la encapsulación de verapamilo y prolongar su liberación de los NLC (Fig. 1). Las formulaciones de HVD-NLC se prepararon mediante el método de homogeneización en caliente y de alto cizallamiento y se optimizaron estadísticamente utilizando un 2 ⁴ diseño factorial completo. En el estudio se utilizaron dos tipos de lípidos, el lípido sólido Compritol 888 ATO® y el lípido líquido ácido oleico. Los HVD-NLC preparados se caracterizaron por su tamaño de partícula (PS), potencial zeta (ZP), índice de polidispersidad (PDI) y el porcentaje de eficacia de atrapamiento del fármaco (% EE). Los HVD-NLC optimizados se liofilizaron usando trehalosa como crioprotector. Los perfiles de liberación in vitro se realizaron en ambientes alcalinos y ácidos. El estudio de captación celular in vitro de verapamilo de las HVD-NLC seleccionadas se realizó utilizando líneas celulares Caco-2. El estudio de estabilidad de la formulación optimizada se realizó durante 6 meses en tres condiciones diferentes (5 ° C ± 3 ° C, 25 ° C ± 2 ° C / 60% RH ± 5% RH y 40 ° C ± 2 ° C / 75% de humedad relativa ± 5% de humedad relativa).

Formación de un complejo electrostático de un fármaco catiónico soluble en agua, clorhidrato de verapamilo y polímero de contraión, sulfato de dextrano sódico

Métodos

Material

Verapamil HCl se compró en la fábrica farmacéutica de Wenzhou (Wenzhou, China). Compritol 888 ATO® (dibehenato de glicerol EP-behenato de glicerilo NF) se obtuvo de Gattefosse (Saint-Priest, Francia). El ácido oleico se obtuvo de productos químicos R &M (Essex, Reino Unido). Tween 80® (Polysorbate 80) se adquirió de Euro chemo-pharma Sdn. Bhd. (Penang, Malasia). El poloxamer 188 (Pluronic® F-68) se adquirió de Molekula (Dorset, Reino Unido). Se obtuvieron trehalosa, Sephadex® G-25 y suero fetal bovino (FBS) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La línea celular Caco-2 se obtuvo de ATCC (Virginia, EE. UU.). La solución de penicilina-estreptomicina 100 X se obtuvo de Biowest (Nuaillé, Francia). La tripsina al 0,25% y el medio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) se obtuvieron de GE healthcare life sciences, laboratorios Hyclone (Utah, EE. UU.). El tampón de lisis pasivo, 5X se compró a Promega (Wisconsin, EE. UU.).

Métodos

Preparación de HVD-NLC

Los HVD-NLC se prepararon mediante el método de homogeneización en caliente de alto cizallamiento. La fase lipídica consistía en Compritol ATO 888® y el ácido oleico se fundió calentando a 85 ° C (10 ° C por encima del punto de fusión del lípido sólido). Se pesó la cantidad requerida de verapamilo y se disolvió en la fase acuosa que contenía una mezcla de Tween 80® y poloxámero 188 en una proporción de 1:1 w / w . La fase acuosa se calentó a la misma temperatura que la fase lipídica. La fase acuosa se vertió en la fase lipídica y se homogeneizó usando un homogeneizador digital T25 Ultra-Turrax®, IKA® (Staufen, Alemania) a 24.000 rpm, 85ºC. Posteriormente, la solución acuosa de sulfato de dextrano (relación 1:1 a verapamilo) se añadió lentamente a la mezcla durante el proceso de homogeneización. Los HVD-NLC preparados se dejaron enfriar a temperatura ambiente (25 ± 2 ° C).

Optimización estadística de los parámetros de formulación usando 2 ⁴ Enfoques completos de diseño factorial y función de deseabilidad

Se realizó un diseño factorial completo con dos niveles y cuatro variables para optimizar y evaluar el efecto de las variables independientes de la formulación (factores) sobre las características (variables dependientes o respuestas) (Cuadro 1). Los verdaderos niveles altos y bajos para cada variable independiente se seleccionaron en base a los estudios preliminares.

Las respuestas experimentales obtenidas de las variables dependientes fueron los resultados de los efectos individuales y combinados de las cuatro variables independientes. Este diseño experimental de dos niveles proporciona datos suficientes para ajustarse a la siguiente ecuación polinomial.

$$ X ={\ upbeta} _0 + {\ upbeta} _1A + {\ upbeta} _2B + {\ upbeta} _3C + \ upbeta 4D + {\ upbeta} _ {12} AB + {\ upbeta} _ {13} \ mathrm {AC} + {\ upbeta} _ {14} \ \ mathrm {AD} + {\ upbeta} _ {23} \ mathrm {BC} + {\ upbeta} _ {24} \ mathrm {BD} + {\ upbeta} _ {34 } \ mathrm {CD} $$ (1)

Donde X es una variable dependiente; β ₀ es una intersección; β ₁ , β ₂ , β ₃ y β ₄ son los coeficientes de las variables independientes A , B , C y D respectivamente. Mientras que β ₁₂ , β ₁₃ , β ₁₄ , β ₂₃ , β ₂₄ y β ₃₄ son las interacciones respectivas (es decir, AB, AC, AD, BC, BD y CD). Los resultados experimentales se analizaron mediante un software Design-Expert® versión 6.0.10 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.) Seguido de un análisis de varianza (ANOVA) para determinar la importancia de los factores y sus interacciones. El análisis estadístico se consideró significativo cuando el p los valores eran <0,05.

Las formulaciones finales se seleccionaron sobre la base del enfoque de la función de deseabilidad. La función de deseabilidad combina todas las respuestas en una variable para predecir los niveles óptimos de los factores estudiados. Por lo tanto, se determinó la conveniencia de seleccionar las formulaciones optimizadas con el tamaño de partícula (PS) y el índice de polidispersidad (PDI) más bajos y los valores más altos de potencial zeta (ZP) y porcentaje de eficiencia de atrapamiento (% EE). La función de deseabilidad convierte todas las respuestas en una escala común (0, 1) y las combina por media geométrica para la optimización de la métrica general. El valor de deseabilidad 1 denota un valor aceptable (el valor más deseado) para las respuestas, mientras que el valor de deseabilidad 0 indica un valor inaceptable.

Medidas de tamaño de partículas, índice de polidispersidad y potencial zeta

El PS y PDI de las nanopartículas preparadas se midieron usando un espectrómetro de correlación de fotones (Zetasizer 1000HS / 3000HS, Malvern Instrument, Malvern, Reino Unido). La ZP se determinó utilizando un analizador de potencial zeta (serie Zetasizer nano, placa Nano Z-red, Malvern Instrument, Malvern, Reino Unido). Todas las muestras se diluyeron con agua destilada filtrada (filtro de nailon de 0,45 μm) y las mediciones se realizaron por triplicado.

Determinación del porcentaje de eficiencia de atrapamiento

La muestra preparada que contenía el complejo libre de verapamilo-dextrano y HVD-NLC se separó mediante el método de centrifugación en minicolumna utilizando Sephadex® G25. Se colocó un volumen de 1 mL de la muestra en la parte superior de la columna y luego se centrifugó durante 2 min a 2000 rpm. El eluyente que contenía HVD-NLC se recogió y liofilizó utilizando un liofilizador (Labconco, Free Zone Freeze Dry Systems, Kansas City, EE. UU.).

Los HVD-NLC liofilizados (10 mg) se disolvieron en cloroformo y se evaporaron bajo nitrógeno gaseoso a 40ºC. Después, la muestra seca se disolvió en 1 ml de agua destilada, se agitó en vórtex durante 2 min y se centrifugó (Eppendorf, Alemania) a 12.000 rpm durante 5 min. Se recogió el sobrenadante y se determinó la cantidad de verapamilo utilizando un método validado de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El% EE se calculó mediante la siguiente ecuación:

$$ \% \ mathrm {EE} =\ frac {\ mathrm {Peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {encapsulado} \ \ mathrm {verapamil}} {\ mathrm {Inicial} \ \ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {verapamil}} \ kern0.5em \ times \ kern0.75em 100 $$ (2)

El análisis por HPLC para la cuantificación de verapamilo se realizó utilizando un sistema cromatográfico Shimadzu equipado con una bomba de suministro LC 20AD (Kyoto, Japón) y una columna Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm). La fase móvil consistió en acetato de amonio 20 mM y acetonitrilo en una proporción de 40:60 ( v / v ). El pH de la fase móvil se ajustó a pH 6,5 con ácido acético glacial. El volumen de inyección fue de 20 μL y la longitud de onda de detección del verapamilo se estableció en 278 nm y la velocidad de flujo se fijó en 1,5 ml / min.

Estudio de liofilización

La liofilización se realizó a -40 ° C durante 24 h usando un Labconco, FreeZone Freeze Dry Systems (Kansas City, EE. UU.). Se seleccionaron cinco tipos de azúcares de uso común, incluidos manitol, fructosa, sacarosa, lactosa y trehalosa en una relación lípido:crioprotector de 1:1, con el fin de seleccionar un crioprotector adecuado para la liofilización de las HVD-NLC. El crioprotector que produjo PS y PDI promedio más bajos de la formulación liofilizada después de la reconstitución en agua destilada se seleccionó para un estudio adicional.

En el siguiente estudio, la formulación de HVD-NLC se mezcló con el crioprotector seleccionado utilizando dos métodos. En el primer método, el crioprotector se añadió después de la preparación de la formulación de HVD-NLC y se denominó "después del proceso de homogeneización". Mientras que en el segundo método, el crioprotector se agregó durante la preparación de la formulación de HVD-NLC y se nombró como "durante el proceso de homogeneización". En el primer método, se prepararon y liofilizaron varias proporciones de lípidos y crioprotectores de 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 y 1:8. Las formulaciones liofilizadas de HVD-NLC se redispersaron en agua destilada filtrada (filtro de nailon de 0,45 µm) y las muestras se evaluaron para determinar el PS medio, el PDI y el% de EE. Las proporciones lípido:crioprotector que produjeron el PS y el PDI más bajos y el% EE más alto se seleccionaron para estudios adicionales en el segundo método de mezcla.

Estudio de lanzamiento in vitro

El estudio de liberación in vitro de verapamilo de NLC se llevó a cabo utilizando una bolsa de diálisis colocada en un medio de fluido intestinal simulado (pH 6,8) o fluido gástrico simulado (pH 1,2). En este estudio, se llenaron 2 ml de dispersión de HVD-NLC en la bolsa de diálisis (corte de PM de 12.000 Da). La bolsa se selló y luego se sumergió en 150 ml de medio de liberación precalentado. El estudio de liberación se realizó en un agitador magnético de placa caliente a una velocidad de agitación de 100 rpm y 37 ° C. A intervalos de tiempo programados de 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 y 72 h, se extrajo 1 mL de muestra y se reemplazó con el mismo volumen de medio fresco. La concentración de verapamilo liberada se determinó mediante HPLC.

Calorimetría diferencial de barrido

El análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) se llevó a cabo utilizando un Perkin-Elmer Pyris 6 DSC (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Reino Unido). Las muestras se pesaron (5-7 mg) en una bandeja de aluminio y se sellaron usando una prensa de engarzadora de bandejas de muestras estándar (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Reino Unido). Las curvas de DSC se registraron a una velocidad de 10 ° C / min de 0 a 260 ° C.

Dispersión de rayos X de gran angular

El análisis de dispersión de rayos X de gran angular (WAXS) θ / 2θ se realizó a temperatura ambiente usando un PANalytical X’Pert PRO MRD PW3040 (Almelo, Holanda) aplicando radiación Cu Kα. Las muestras se analizaron en un rango de temperatura de 2 a 60 ° C con una velocidad de exploración de 5 ° C / min.

Microscopio electrónico de transmisión y microscopio electrónico de barrido

La morfología (es decir, la forma y el tamaño) de las HVD-NLC se observó mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM) utilizando (Philips CM12, Eindhoven, Países Bajos). Se colocó una gota de dispersión de HVD-NLC diluida sobre una rejilla de cobre de malla 400 seguida de una tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 2%. La muestra preparada se secó al aire antes del examen TEM.

La morfología de las HVD-NLC liofilizadas se observó utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM) (Leo Supra 50 VP field Emission SEM, Oberkochen, Alemania). La muestra liofilizada de HVD-NLC se fijó en un talón de aluminio y luego se revistió con oro (10 nm de espesor) en un dispositivo de pulverización catódica a 15 mA durante 15 min. La muestra se visualizó utilizando un sistema de microanálisis de rayos X de dispersión de energía Oxford INCA con un voltaje de aceleración de 10 kV.

Captación celular de HVD-NLC

El estudio de captación celular in vitro de verapamilo de la formulación de HVD-NLC se investigó utilizando una línea celular Caco-2. Las células se cultivaron en medio de crecimiento DMEM complementado con una solución de penicilina-estreptomicina al 1% y FBS al 10% en un matraz de cultivo de tejidos T-25. Luego, las células Caco-2 se recolectaron y se sembraron en placas de 48 pocillos, a una densidad celular de 60.000 por pocillo con medio completo DMEM hasta que las células se volvieron confluentes y formaron una monocapa en el fondo de la placa de pocillos. Se prepararon varias soluciones que contenían la misma concentración de verapamilo diluyendo HVD-NLC, solución de verapamilo y complejo de verapamilo-dextrano con medio DMEM solamente. Se utilizaron como controles solución de verapamilo y complejo de verapamilo-dextrano. Posteriormente, los medios completos DMEM de la monocapa de células Caco-2 en placas de 48 pocillos se intercambiaron con diferentes diluciones de HVD-NLC, solución de verapamilo y complejo de verapamilo-dextrano y se incubaron a 37 ° C durante 6 h. Después de completar el período de incubación, las muestras de HVD-NLC, solución de verapamilo y complejo de verapamilo-dextrano se retiraron de los pocillos. El residuo de las muestras de prueba y las células muertas se eliminaron de las monocapas lavando tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células de la monocapa se lisaron añadiendo tampón de lisis pasivo (200 μl) a cada pocillo de muestra. Las muestras se extrajeron con pipeta y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 min para extraer el verapamilo de las células. Se recogieron los sobrenadantes y se cuantificó la concentración de verapamilo mediante HPLC.

Estudio de estabilidad a corto plazo

El estudio de estabilidad a corto plazo de la formulación optimizada de HVD-NLC se realizó de acuerdo con las directrices Q1A (R2) del consejo internacional para la armonización de requisitos técnicos para productos farmacéuticos para humanos (ICH). La formulación de HVD-NLC liofilizada recién preparada (VER-9) se colocó en tres condiciones diferentes (5 ± 3 ° C, 25 ± 2 ° C / 60 ± 5% de humedad relativa (RH) y 40 ± 2 ° C / 75 ± 5% RH) durante 6 meses. La estabilidad de la formulación optimizada de HVD-NLC se examinó midiendo PS, PDI, ZP y el contenido total de fármaco a los 0, 1, 3 y 6 meses.

Análisis estadístico

Los resultados se analizaron utilizando un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y seguido de un Tukey-HSD post-hoc. El análisis estadístico se realizó con el software estadístico IBM® SPSS® (Versión 22, NY, EE. UU.). Todos los valores se expresaron como media y desviación estándar (media ± DE). La diferencia fue estadísticamente significativa cuando p <0.05.

Resultados y discusión

Análisis con 2 ⁴ Diseño factorial completo

Los valores de las variables independientes seleccionadas, es decir, tiempo de homogeneización (A), concentración de lípidos sólidos (B), concentración de lípidos líquidos (C) y concentración de tensioactivo (D) y los resultados obtenidos de las respuestas seleccionadas, es decir, PS, PDI , ZP y% EE se muestran en la Tabla 2. Cada variable independiente y sus interacciones se evaluaron estadísticamente usando el ANOVA. El coeficiente de polinomio para cada variable dependiente fue generado por el software Design-Expert® para cuantificar el efecto de cada variable independiente, como se muestra en las Ecs. 3, 4, 5 y 6. Las ecuaciones solo representan los factores significativos y sus interacciones.

$$ \ mathrm {PS} =185.73-7.64A-2.13C-12.03D-2.15 \ mathrm {AC} +2.16 \ mathrm {BD} -3.53 \ mathrm {CD} $$ (3) $$ \ mathrm {PDI } =0.48-0.060C-0.029 \ mathrm {AC} +0.039 \ mathrm {CD} $$ (4) $$ \ mathrm {ZP} =- 45.94-2.06C-1.41D + 0.91 \ mathrm {BD} -1.09 \ mathrm {CD} $$ (5) $$ \% \ mathrm {EE} =81.40-4.31A + 8.45D-2.13 \ mathrm {AD} +1.90 \ mathrm {BD} $$ (6)

donde A es el tiempo de homogeneización (min), B es la concentración de lípidos sólidos (mg), C es la concentración de lípidos líquidos (mg) y D es la concentración de tensioactivo (mg). Los signos positivos y negativos antes de cada factor o factores de interacción en las ecuaciones representan un efecto sinérgico o antagonista, respectivamente. Las gráficas de superficie de respuesta se generaron para observar el efecto concurrente de cada factor o interacciones de factores en los parámetros de respuesta.

Efectos de las variables en el tamaño medio de las partículas

Como se muestra en la ecuación. 3, factores A , C y D tienen efectos antagónicos sobre el tamaño de partícula (PS). Se podría concluir que aumentando el tiempo de homogeneización (factor A ) se asocia simultáneamente con una disminución significativa en el PS de los NLC ( p <0,05). Esto probablemente se deba a la alta fuerza de cizallamiento de la homogeneización que rompe de manera eficiente los glóbulos de lípidos en partículas más pequeñas. Del mismo modo, aumentar la concentración de lípidos líquidos ( C ) se encontró que simultáneamente disminuía el PS de los NLC. Esto podría atribuirse a la capacidad del ácido oleico para disminuir la viscosidad del sistema, así como la tensión superficial cuando se combina con Compritol 888 ATO®, por lo que produce partículas de menor tamaño de NLC. La capacidad del lípido líquido para disminuir la viscosidad del sistema cuando se combina con el lípido sólido también fue informada por Jenning et al. cuando prepararon una dispersión de SLN [5]. Los autores observaron que aumentar la concentración de lípidos líquidos de 0 a 38% en la composición de la matriz lipídica reduciría el tamaño de las partículas. Además, el aumento de la concentración de tensioactivo ( D ) disminuiría el PS, porque una mayor cantidad de surfactante presente en el sistema emulsionaría fácilmente el contenido total de lípidos en la formulación y, por lo tanto, formaría nanopartículas más pequeñas.

La Figura 2 muestra el significativo ( p <0,05) efecto de las interacciones de los factores (AC, BD y CD) sobre el PS del NLC. El impacto positivo del factor (BD) y el impacto negativo de los factores (interacción AC y CD) mostraron un efecto significativo sobre el tamaño de partícula de las NLC. El impacto negativo del factor (AC) mostró que a mayor tiempo de homogeneización y mayor concentración de lípidos líquidos provocó una disminución en PS. La interacción entre concentraciones más altas de lípido sólido y tensioactivo en la formulación de NLC (interacción BD) mostró un impacto positivo significativo en el tamaño de partícula, lo que resultó en un tamaño de partícula más grande. En contraste, la interacción entre concentraciones más altas del lípido líquido y el surfactante (interacción CD) mostró un impacto negativo significativo en el tamaño de partícula donde se produjo un tamaño más pequeño.

Gráfico de superficie de respuesta que representa la importancia ( p <0.05) efecto del tiempo de homogeneización, concentración de lípidos líquidos, concentración de surfactante e interacción entre a AC, b BD y c CD en la PS de HVD-NLC. A tiempo de homogeneización, B lípido sólido, C lípido líquido, D tensioactivo

Efectos de las variables en el PDI

Como se ilustra en la ecuación. 4, se ha demostrado que el ácido oleico tiene un impacto negativo en el PDI, lo que significa que el aumento de la concentración de ácido oleico reduciría los valores de PDI y conduciría a una mejor distribución de las partículas de NLC. Algunas investigaciones también observaron un efecto similar del ácido oleico sobre la NLC [6]. La Figura 3 representa la interacción entre el tiempo de homogeneización y la concentración de lípidos líquidos (interacción AC). Esta interacción mostró un efecto negativo significativo sobre el PDI. Significa que un tiempo de homogeneización más prolongado y una mayor concentración de lípidos líquidos conducirían a una disminución de los valores de PDI. Además, la interacción entre las concentraciones de lípidos líquidos y tensioactivos (interacción CD) mostró un efecto sinérgico sobre los valores de PDI. Por tanto, el aumento simultáneo de las concentraciones de lípidos y tensioactivos líquidos aumentaría los valores de PDI y produciría partículas de HVD-NLC menos homogéneas. Esto podría deberse a que un aumento adicional de la concentración de tensioactivo más allá del valor optimizado puede provocar una acumulación del tensioactivo en las superficies externas de las nanopartículas, lo que a su vez aumenta los valores de PDI. El mismo patrón también fue observado por Shamma et al., Por lo que el aumento de la concentración de surfactante provocó un aumento en los valores de PDI de los NLC [7].

Gráfico de superficie de respuesta que representa el significativo ( p <0.05) efecto de la concentración de lípidos líquidos e interacciones entre a AC y b CD en PDI de HVD-NLC. A tiempo de homogeneización, C lípido líquido, D tensioactivo

Efectos de las variables en ZP

Las formulaciones de HVD-NLC tenían carga negativa debido a la ionización de behenato de glicerilo (un ácido graso en Compritol 888 ATO®), ácido oleico y residuo de sulfato de dextrano. Basado en Eq. 5, el aumento de la cantidad de ácido oleico tuvo un impacto negativo en las nanopartículas y, como resultado, aumentó la carga negativa de las nanopartículas, por lo que aumentó la ZP de HVD-NLC. Esto posiblemente se deba a la ionización excesiva de abundantes grupos carboxílicos en el ácido oleico (lípido líquido) [8]. Además, el behenato de glicerilo (lípido sólido) también mostró un efecto negativo sobre los valores de ZP, donde al aumentar su concentración aumenta la ZP de las nanopartículas. Esto se debe a una mayor ionización del carboxílico en el behenato de glicerilo que conduce a mayores cargas negativas en la superficie exterior de las nanopartículas.

La interacción BD tuvo un efecto positivo significativo sobre la ZP de las NLC, mientras que la interacción CD mostró un efecto negativo (Fig. 4). Aumentar la concentración de lípidos sólidos y disminuir la concentración de tensioactivo reduce la carga negativa de las nanopartículas y disminuye los valores de ZP. Probablemente, en esta etapa, una menor concentración de tensioactivo no sería capaz de ionizar la cantidad total de lípidos sólidos, lo que llevaría a reducir las cargas negativas en la superficie de las nanopartículas, reduciendo así la ZP de HVD-NLC. Además, el aumento simultáneo de la concentración de lípidos líquidos y tensioactivos (interacción CD) aumentaría significativamente el valor ZP de HVD-NLC. Esto se debe a que se ionizaría más ácido carboxílico en presencia de una mayor concentración de tensioactivo en la formulación.

Gráfico de superficie de respuesta que representa el significativo ( p <0.05) efecto de la concentración de lípidos líquidos, la concentración de surfactante y las interacciones entre a BD y b CD en el ZP de HVD-NLC. B lípido sólido, C lípido líquido, D tensioactivo

Efectos de las variables en% EE

La ecuación 6 mostró que aumentar el tiempo de homogeneización significaría ( p <0.05) disminuyen el% EE del fármaco. Un tiempo de homogeneización más prolongado podría despojar o despegar las moléculas del fármaco adheridas a la superficie exterior de las nanopartículas, lo que resultó en un menor% de EE del fármaco en las HVD-NLC. Por el contrario, el aumento de la concentración de tensioactivo dio como resultado un mayor% de EE del fármaco en las HVD-NLC. Esto podría deberse a que una mayor concentración de tensioactivo aumentaría su recubrimiento de la superficie exterior de NLC, donde parte del fármaco quedaría atrapado en él. Zhuang y col. y Das et al. sugirió que una concentración adecuada de tensioactivo es esencial para la solubilización de las moléculas del fármaco dentro de la red lipídica y en la superficie exterior de las nanopartículas [9, 10].

Como se muestra en la Fig.5, la interacción AD tuvo un significativo ( p <0,05) impacto negativo, por lo que el aumento del tiempo de homogeneización y la disminución de la cantidad de tensioactivo reduce el% de EE del fármaco en los HVD-NLC. Por el contrario, la interacción entre las concentraciones de lípidos sólidos y tensioactivos (interacción BD) mostró un efecto positivo sobre el% de EE del fármaco. Por lo tanto, aumentar la concentración de lípidos sólidos y tensioactivos aumentará el% de EE del fármaco en las HVD-NLC. Esto probablemente se deba a la mayor concentración de tensioactivo que solubilizaría el exceso de moléculas de fármaco y, al mismo tiempo, una mayor cantidad de presencia de lípidos sólidos en el sistema ha acomodado el exceso de moléculas de fármaco, por lo que aumenta el% de EE del fármaco en el HVD. NLC.

Gráfico de superficie de respuesta que representa el significativo ( p <0.05) efecto del tiempo de homogeneización, concentración de lípidos líquidos, concentración de surfactante e interacciones entre a AD y b BD sobre EE de verapamilo en HVD-NLC. A tiempo de homogeneización, B lípido sólido, D tensioactivo

Selección de HVD-NLC optimizados mediante la función de deseabilidad

Las formulaciones de HVD-NLC con el número de código VER-9, VER-11, VER-13 y VER-15 tenían valores de deseabilidad más altos de 0,863, 0,852, 0,811 y 0,840, respectivamente. Estas formulaciones se seleccionaron para un estudio adicional porque los valores de deseabilidad estaban más cerca de 1. La función de deseabilidad individual y combinada de todas las respuestas para las formulaciones seleccionadas se muestra en la Fig. 6. La media de PS, PDI, ZP y% EE de estas Las formulaciones estaban en el rango de 173,46 ± 0,757 a 190,3 ± 8,22, 0,451 ± 0,033 a 0,501 ± 0,019, - 46,73 ± 1,13 a - 49,16 ± 1,55 y 93,95 ± 4,10 a 98,81 ± 1,01, respectivamente.

Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. un VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15

Lyophilization Study

Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.

In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.

The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)₄ ^- ) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.

In Vitro Release of HVD-NLCs

The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.

Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h

DSC Study

The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].

DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)

WAXS Study

The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.

X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO

Electron Microscopic Examinations

The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).

TEM image of VER-9 before lyophilization

SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; b with trehalose

Cellular Uptake Study of HVD-NLCs

Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].

In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n =3)

Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.

Stability Study

The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.

Conclusion

The lyophilized HVD-NLCs formulation was successfully developed and optimized. The lipid carriers had prolonged the release of verapamil from the HVD-NLCs formulation. The formulation was in the nano size range and stable for 6 months at 5 ± 3 °C. The cellular uptake of verapamil lipid formulation (NLCs) was found higher than the non-lipid formulations. This suggested that the NLCs as a lipid carrier for verapamil may play an important role in improving the absorption of the drug.

Abreviaturas

%EE:: Percentage of entrapment efficiency
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagles medium
DSC:: Calorimetría diferencial de barrido
FBS:: Suero fetal bovino
HVD-NLCs:: Hybrid verapamil-dextran nanostructured lipid carriers
ICH:: The international council for harmonization of technical requirements for pharmaceuticals for human
IDL:: Intermediate density lipoproteins
LDL:: Low density lipoproteins
NLCs:: Nanostructured lipid carriers
PBS:: Solución salina tamponada con fosfato
PDI:: Índice de polidispersidad
PD:: Particle size
RH:: Relative humidity
SEM:: Microscopio electrónico de barrido
TEM:: Microscopio electrónico de transmisión
VLDL:: Very low-density lipoproteins
WAXS:: Wide-angle X-ray scattering
ZP:: Zeta potential