Evaluación de nuevas nanoprobes a base de gadolinio teranósticas marcadas con 64Cu en ratones desnudos portadores de tumores HepG2

Métodos

Información general

Se obtuvieron nanopartículas de gadolinio deshidratadas, esféricas y de menos de 5 nm (AGuIX) de Nano-H (Lyon, Francia) y se usaron sin purificación. Las nanopartículas consisten en átomos de gadolinio unidos a una capa de polisiloxano a través de quelantes DOTA incorporados. Las nanopartículas se rehidrataron en agua estéril tratada con DEPC (Invitrogen, EE. UU.) Y se almacenaron a 4 ° C hasta su uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El acetato de megestrol se adquirió de Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, EE. UU.). La línea celular humana de HCC, HepG2, se obtuvo de American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Universidad de Virginia, VA, EE. UU.). ⁶⁴ El isótopo Cu se compró en la Universidad de Wisconsin. Se adquirieron otros productos químicos y reactivos de Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, EE. UU.) Y se usaron sin purificación ni procesamiento adicionales. Se compraron ratones desnudos atímicos BALB / c macho de seis semanas de edad que pesaban entre 16 y 18 g en Charles River. El estudio con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Virginia.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las nanopartículas AGuIX a una concentración de 0,5 mM en las soluciones anteriores se incubaron con células HepG2 durante 1 h [10]. Luego, las nanopartículas residuales se lavaron con 0,1 M de solución salina tampón fosfato y se purificaron por centrifugación. Los sedimentos celulares con nanopartículas se tiñeron con formaldehído al 4% y glutaraldehído al 1% en Pb 0,1 M para obtener imágenes.

⁶⁴ Radiomarcaje de Cu

Las nanopartículas AGuIX se marcaron radiactivamente con ⁶⁴ Isótopo Cu. Primero mezclamos 200 μl de solución de nanopartículas AGuIX (10 μmoles de AGuIX) con 100 μl de 0,5 M de NH ₄ Tampón OAc (pH =5,5). Después de la incubación durante 5 min, 1-3 mCi de ⁶⁴ CuCl ₂ en 0,1 N de HCl y la mezcla de reacción se incubó a 37 ° C durante 1 h. Después, la mezcla de reacción se esterilizó mediante filtración a través de un filtro ultra centrífugo Amicon de 3 k (Merck Millipore). La pureza radioquímica se determinó mediante iTLC utilizando 20 mM de ácido cítrico como fase móvil, como se describió anteriormente [11].

Modelos de tumores

Se cultivaron células HepG2 en MEM que contenía 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de aminoácidos no esenciales y FCS al 10% (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, EE. UU.). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada de aire / CO ₂ (19/1) y se subcultivaron cada 2-3 días.

Células HepG2 (5 × 10 ⁶ ) se recogieron en 0,1 ml de HBSS, y estas suspensiones celulares se inyectaron luego por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón desnudo usando una aguja de calibre 27. Las orejas de los ratones desnudos que recibieron inyecciones de células se marcaron para su identificación. Generalmente, los tumores sólidos comenzaron a ser visibles 2 semanas después de la inyección de células HepG2.

Biodistribución en ratones portadores de tumores de ⁶⁴ Cu-AGuIX

Se dividieron aleatoriamente ratones desnudos portadores de tumores (5 machos y 4 hembras) en tres grupos y se les inyectó intraperitonealmente el ⁶⁴ Cu-AGuIX, con una actividad de aproximadamente 0,9 MBq, en un volumen de 0,2 mL. Los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical bajo anestesia con inhalación de isofluorano a las 9, 21 y 40 h después de la inyección. Se disecaron y pesaron los órganos de interés (corazón, músculo, pulmón, riñón, bazo, hígado y tumor, etc.) y se extrajeron 100 µL de sangre de la cavidad ventricular. La actividad de cada muestra se determinó utilizando un contador γ (CRC-7, Capintec Inc., NJ, EE. UU.). La distribución de la radiactividad en diferentes tejidos y órganos se calculó y expresó como el porcentaje de la dosis de inyección por gramo (% DI / g).

Imágenes de micro-PET de ⁶⁴ Cu-AGuIX en ratones desnudos

El ⁶⁴ Se inyectó por vía intraperitoneal Cu-AGuIX (22,2 MBq) en 0,2 ml de solución salina en cada uno de los ratones desnudos portadores de tumor. Cada animal se colocó boca abajo sobre el lecho de un sistema PET (SuperArgus, Sedecal, España). Las imágenes de PET se adquirieron para diferentes períodos de tiempo a las 9 y 21 h posteriores a la inyección de ⁶⁴ Cu-AGuIX bajo anestesia de 4 a 5% de isoflurano para inducción y 1 a 2% para mantenimiento, ambos equilibrados con oxígeno.

Configuración de irradiación y ¹⁸ Evaluación de xenoinjertos por PET con F-FDG

Para los estudios de imágenes de PET para evaluar la radiosensibilización de AGuIX durante la radioterapia, se dividieron 12 ratones desnudos con tumores HepG2 en tres grupos, con cuatro ratones asignados al azar por grupo. Para las imágenes de PET de referencia, los ratones se inyectaron con ¹⁸ F-FDG (16,4 ± 4,7 MBq) a través de la vena de la cola y se mantuvo bajo anestesia general durante 10 min de imágenes estáticas de PET a 30 min p.i. (postinyección) con un escáner PET para animales pequeños (Madiclab, Shandong, CN). Las imágenes de PET se reconstruyeron utilizando el algoritmo 3D OSEM, un tamaño de vóxel de 0,91 × 0,90 × 0,90 mm y una resolución espacial en el centro del campo de visión de 1,3 mm.

Para el estudio de irradiación, cada grupo recibió inyecciones en la vena de la cola con 0,1 ml de solución salina normal, 1 mg (0,1 ml) de AGuIX y 10 mg (0,1 ml) de AGuIX. 1 h después de la inyección, estos ratones desnudos se irradiaron utilizando una fuente de rayos X (X-RAD 320, Precision X-Ray, North Branford, CT, EE. UU.), Que se operó a 250 kV y 8 mA, con un 2- Filtro de mm Al a una tasa de dosis de 1,2 Gy / min para una dosis total de 6 Gy. Al día siguiente, se repitió el mismo protocolo de irradiación con los ratones. Un día después de dos tratamientos de irradiación, se tomaron imágenes de estos ratones con ¹⁸ PET con F-FDG (11,1 ± 1,0 MBq) utilizando el mismo protocolo que la primera exploración PET. El valor máximo de absorción estándar (SUVmáx) se determinó dibujando regiones de interés (ROI) en las áreas tumorales (Madiclab, Shandong, CN).

Análisis estadístico

Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se expresaron como la media ± error estándar (EE). Las diferencias estadísticamente significativas se calcularon utilizando un t no apareado de dos colas prueba o análisis de varianza unidireccional; p los valores de <0.05 (*) y <0.01 (**) se consideraron significativos.

Resultados y discusión

Si bien la resonancia magnética con contraste se ha utilizado ampliamente en la radioterapia guiada por imágenes basada en AGuIX, el límite de detección de la concentración de nanopartículas es una preocupación debido a la medición de tiempo más largo de la farmacocinética de las nanopartículas. Con una capacidad cuantitativa mucho más sensible y más alta, el PET extiende el rango dinámico de concentraciones a concentraciones nanomolares mucho más bajas que son indetectables por resonancia magnética con contraste. En este informe, describimos el etiquetado y la evaluación de la biodistribución y la farmacocinética de AGuIX con ⁶⁴ Cu para una posible radioterapia guiada por imágenes de PET.

Estudio TEM

Para los estudios de incubación de células, se eligió una concentración de 0,5 mM de nanopartículas AGuIX en función de los datos publicados y las nanopartículas AGuIX se incubaron con células HepG2 durante 1 h [10]. Se observó captación en el citoplasma de las células HepG2 (Fig. 1). Este resultado está de acuerdo con estudios publicados anteriormente en los que se incubaron nanopartículas AGuIX con otros tipos de líneas celulares [12, 13]. También observamos que AGuIX mostró una excelente forma de dispersión en las células HepG2, lo que sugiere que AGuIX era estable en las células.

Localización de AGuIX dentro de las células HepG2. un . Las imágenes TEM (× 6500) representan la captación de AGuIX en las células HepG2. b . La imagen TEM ampliada (× 52000) muestra la distribución de nanopartículas AGuIX en el citoplasma

Radiomarcaje

El marcaje se llevó a cabo convenientemente con la forma actual de AGuIX con el quelante incorporado DOTA en un solo paso para un rendimiento radioquímico> 98%. Utilizando la prueba iTLC para identificar las nanopartículas marcadas radiactivamente que se retuvieron en las manchas originales, el etiquetado dio como resultado una actividad específica y una pureza radioquímica de aproximadamente 3 a 10 MBq / μmol y 98%, respectivamente. Por cada síntesis se obtuvo un promedio de 50 a 100 MBq del producto final.

Estudios de biodistribución

⁶⁴ Se inyectaron nanopartículas de Cu-AGuIX por vía intraperitoneal, se determinó la biodistribución en ratones desnudos portadores de tumores HepG2 y se comparó con los reportados previamente. Como se muestra en la Fig. 2, la biodistribución en cada órgano / tejido se presenta como el porcentaje de actividad administrada (dosis inyectada) por gramo de tejido (% ID / g). Los resultados mostraron claramente que ⁶⁴ Cu-AGuIX acumulado en el tumor con excelente retención a las 9, 21 y 40 h p.i. con la absorción de 7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6,23 y 6,84 ± 1,40% ID / g, respectivamente. Esta retención a largo plazo puede atribuirse a la absorción de las nanopartículas AGuIX dentro de las células y, por lo tanto, está relacionada con ⁶⁴ Cu residencia en las celdas. De acuerdo con otros informes [11, 14], aunque se utilizaron diferentes rutas de inyección y marcaje radiactivo de isótopos, el ⁶⁴ Las nanosensas marcadas radiactivamente con Cu exhibieron una captación mucho menor (inferior al 1% ID / g) en otros órganos y tejidos normales y un aclaramiento rápido. En conjunto, estos datos sugieren el uso potencial de ⁶⁴ AGuIX marcado con Cu como herramienta para medir la biodistribución y farmacocinética de AGuIX para ayudar a orientar el plan de radioterapia en el que estas nanopartículas se utilizan como radiosensibilizadores. En este estudio, la captación renal es mucho menor de lo que otros han informado porque este estudio usó inyección intraperitoneal [11, 14].

Biodistribución de ⁶⁴ Cu-AGuIX en ratones desnudos portadores de tumores HepG2. La captación de radiactividad en cada tejido / órgano se presentó en% ID / ga 9, 21 y 40 h después de la inyección intraperitoneal de ⁶⁴ Cu-AGuIX (media ± DE, n =3)

Imágenes de micro-PET en ratones desnudos

Las imágenes de micro-PET mostraron que la alta captación de ⁶⁴ Se observó Cu-AGuIX en tumores, riñones e hígado en ratones desnudos portadores de tumores (Fig. 3). El tumor era claramente visible después de la administración de ⁶⁴ Cu-AGuIX a las 9 hy será aún más claro hasta las 21 h posteriores a la inyección a medida que disminuya el fondo.

Imágenes de micro-PET de ratones con tumor. Imágenes de PET (vista superior, coronal; inferior, vista transversal) de ratones desnudos con tumores ( flecha roja ) se adquirieron a las 9 h (izquierda) y 21 h (derecha) después de la inyección intraperitoneal de ⁶⁴ Cu-AGuIX

¹⁸ Evaluación de F-FDG PET / CT de xenoinjertos irradiados con o sin AGuIX

Para evaluar las diferentes respuestas a la radioterapia con o sin la administración de AGuIX, ¹⁸ Se realizaron imágenes de PET / CT con F-FDG para monitorear los cambios metabólicos después de la irradiación con o sin inyección de AGuIX en dos dosis diferentes. La disminución de ¹⁸ Se observó la captación de F-FDG en los xenoinjertos en todos los ratones irradiados (Fig. 3). SUVmax (B / A), el indicador principal de la efectividad de la radiosensibilización, fue 1.03 ± 0.03, 1.04 ± 0.04 y 1.24 ± 0.02 para los ratones que recibieron solución salina normal, 1 mg de AGuIX y 10 mg de AGuIX, respectivamente (Fig. 4). Para el grupo de 10 mg de AGuIX, T / L (B / A) aumentó significativamente en comparación con el grupo de 1 mg de AGuIX ( p <0,001, prueba de muestra independiente) y con el grupo de solución salina normal ( p <0,001, prueba de muestra independiente). No hubo diferencias significativas para T / L (B / A) entre los grupos que recibieron 1 mg de AGuIX y solución salina normal ( p =0,83, prueba de muestra independiente) (Fig.5). Estos resultados sugieren que el metabolismo de la glucosa de los xenoinjertos se suprimió principalmente en los ratones irradiados que recibieron una inyección de 10 mg de AGuIX; aunque la radioterapia puede inducir inflamación que también puede conducir a la captación de FDG. En este estudio, elegimos la misma dosis de radiación y el mismo punto de tiempo después de la terapia de RT para todos los grupos para compensar cualquier error sistémico. Por lo tanto, la extensión de la inflamación causada por la RT debe ser aproximadamente la misma para los tres grupos y la contribución a la captación de FDG inducida por la inflamación también debe ser aproximadamente el mismo. Se pueden usar otras sondas de imagenología PET para evitar este problema. No obstante, estos hallazgos proporcionan una prueba de concepto de que AGuIX puede usarse como un sensibilizador de radiación tumoral en ratones portadores de tumores HepG2.

¹⁸ Imágenes de PET con F-FDG de los ratones antes y después de la radiación. ¹⁸ Las imágenes de PET con F-FDG se compararon en cada panel antes (izquierda) y 1 día (derecha) después de la irradiación, y los tres paneles mostraron las imágenes de ratones inyectados mediante inyección en la vena de la cola de solución salina normal (panel izquierdo), 1 mg de AGuIX ( panel central) y 10 mg de AGuIX (panel derecho), respectivamente. Se aplicó la misma escala de color a cada una de las imágenes

¹⁸ Evaluación cuantitativa de PET con F-FDG antes y después de la irradiación. T / L (B), la relación de SUVmax (tumor) a SUVave (hígado) antes de la irradiación; T / L (A), la relación de SUVmax (tumor) a SUVave (hígado) después de la irradiación; T / L (B / A), la relación de T / L (B) a T / L (A); AGuIX (1 mg), 1 mg de AGuIX inyectado; AGuIX (10 mg), 10 mg AGuIX inyectado

Por último, la dosis de radiación absorbida de la propia sonda de imágenes nucleares también es una preocupación fundamental cuando se considera un cambio hacia el uso clínico. La forma actual de las nanopartículas AGuIX ha sido investigada a fondo para determinar su metabolismo y toxicidad in vivo y la FDA ha aprobado estudios en humanos [15]. Al etiquetar ⁶⁸ Ga (~ 1 h de semivida de desintegración) o ⁸⁹ Zr (78 h de vida media de desintegración), los resultados del estudio de biodistribución en ratones mediante inyección intravenosa mostraron una captación extremadamente alta en los riñones a más del 20% ID / g desde tan solo 30 min por ⁶⁸ Ga hasta 72 h antes de ⁸⁹ Zr [11, 14]. Aunque la excreción rápida por los riñones es generalmente beneficiosa, debido a la sensibilidad de los riñones a la radiación, se desconoce si los riñones pueden tolerar esta alta captación y el mecanismo de retención durante un período de tiempo tan largo. En este estudio, la captación renal fue de ~ 5% DI / g, menor que la del hígado y el tumor durante todo el período de la investigación. Se puede suponer que esta diferencia se debe a las diferentes rutas de inyección. Por inyección intraperitoneal, las nanopartículas de AGuIX fueron absorbidas continuamente por el peritoneo, mientras que por inyección intravenosa, las nanopartículas fueron excretadas rápidamente por los riñones. Debido a que la sensibilidad a la radiación de cada órgano y tejido es diferente, la determinación final de las sondas teranósticas radiactivas para su traducción al uso clínico requiere estudios de dosimetría más detallados.

Conclusiones

Las nanopartículas AGuIX se han etiquetado correctamente con ⁶⁴ Cu con un alto rendimiento. Los estudios de biodistribución indicaron que el radiotrazador ⁶⁴ Cu-AGuIX mostró una alta acumulación en tumores y se retuvo durante un largo período en el xenoinjerto de HepG2 de los ratones desnudos, lo que sugiere que son posibles nanosensas teranósticas para la radioterapia guiada por imágenes en el HCC. La reducción significativa de ¹⁸ La captación de F-FDG después de la radioterapia en el grupo de ratones desnudos tumorales inyectados con AGuIX proporcionó evidencia de que AGuIX puede usarse como un sensibilizador de radiación tumoral para mejorar la radioterapia en ratones portadores de tumores HepG2. Se necesitan más investigaciones sobre la dosimetría para determinar la toxicidad de la radiación para su posible traducción en aplicaciones clínicas.

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