El miR-18b-3p exosomal de MSCs de cordón umbilical humano reduce el riesgo de preeclampsia al dirigirse a leptina

Resumen

Los exosomas derivados de células madre mesenquimales de cordón umbilical humano (hucMSCs) que expresan microRNAs se han destacado en enfermedades humanas. Sin embargo, el mecanismo molecular detallado del miR-18b-3p exosomal derivado de hucMSCs sobre la preeclampsia (PE) requiere mayor investigación. Nuestro objetivo fue investigar el efecto de los exosomas y el eje miR-18b-3p/leptina (LEP) en la ocurrencia de PE. Se identificó la morfología de hucMSC y exosomas hucMSC (Exos). Los exosomas se infectaron con diferentes lentivirus expresando miR-18b-3p para explorar su papel en PE. El modelo de rata PE se estableció por inyección intraperitoneal de éster metílico de N-nitro-L-arginina. Se analizó la expresión de LEP y miR-18b-3p en tejidos placentarios de ratas PE. También se detectó el efecto de los exosomas en la expresión de LEP y miR-18b-3p. Se midieron presión arterial sistólica (PAS), proteinuria, factores inflamatorios, peso de feto y placenta y apoptosis celular en ratas PE. Finalmente, la relación entre miR-18b-3p y LEP se verificó mediante ensayo reportero luciferasa dual y ensayo pull-down ARN. Exosomas, restaurando miR-18b-3p o inhibiendo LEP redujeron PAS y proteinuria en ratas PE, aumentaron peso de feto y placenta, disminuyeron niveles séricos de factores inflamatorios y suprimieron células apoptóticas, ejerciendo efecto supresor sobre progresión PE. miR-18b-3p disminuyó y LEP aumentó en tejidos placentarios de ratas PE. LEP fue gen diana directo de miR-18b-3p. La regulación al alza de miR-18b-3p o tratamiento con exosomas suprimieron expresión LEP y redujeron ocurrencia PE, mientras la regulación negativa de miR-18b-3p tuvo efectos contrarios. LEP regulada negativamente revirtió efecto de reducción miR-18b-3p en ratas PE. El miR-18b-3p exosomal derivado de hucMSCs dirige LEP para participar en ocurrencia y desarrollo PE. Este estudio puede proporcionar base teórica novedosa para mecanismo e investigación de PE.

Introducción

La preeclampsia (PE), caracterizada por proteinuria e hipertensión, es causa mayor de mortalidad y morbilidad fetal y materna en embarazo humano. La etiología y patogénesis de PE no son claras, asociadas con invasión trofoblástica anormal resultando en disfunción endotelial materna, malperfusión placentaria crónica e hipertensión con resultados adversos. Excepto parto fetal y placentario, no hay terapia específica para PE. Por tanto, es urgente explorar dianas terapéuticas para mejorar pronóstico de esta enfermedad.

El cordón umbilical humano (huc) es fuente adecuada de células madre mesenquimales (MSCs) que secretan variedad de factores tróficos y citocinas y muestran fuertes capacidades antiinflamatorias e inmunomoduladoras. Un estudio verificó que PE acelera expresión marcadores neurogliales en MSCs derivadas de jalea Wharton de cordón umbilical. También se reportó efecto protector de exosomas hucMSCs (Exos) sobre morfología placentaria y angiogénesis en ratas PE. Los exosomas son vesículas secretoras pequeñas (50-100 nm) que median comunicación entre células en microambiente tumoral encapsulando y transmitiendo factores carcinogénicos a sitios distantes o células circundantes por circulación. Un estudio reveló daño funciones vasculares y complicaciones inducidas por transferencia efectiva de sFlt-1 y sEng a células endoteliales en pacientes PE por exosomas. Los microRNAs (miRNAs) son ARN endógenos no codificantes de 18-25 nucleótidos que regulan expresión génica a nivel post-transcripcional. Datos de un estudio reportaron que expresión miR-18b afecta invasión, viabilidad y migración células trofoblásticas en PE. Además, Wu et al. propusieron que miR-18b atenúa proliferación en células endoteliales retinianas humanas inducida por alta glucosa, ofreciendo nueva perspectiva para comprender mecanismo patogénesis retinopatía diabética. Sin embargo, el papel del miR-18b-3p exosomal derivado de hucMSC en PE permanece desconocido. La leptina (LEP) tiene efectos pleiotrópicos en diferenciación/proliferación celular e inmunidad de estados fisiológicos y surge principalmente de adipocitos, además de otros tejidos, incluyendo placenta. Un estudio verificó que metilación anormal promotor LEP involucrada en progresión PE. Otro estudio sugirió placenta como sitio principal de expresión LEP en embarazo. No obstante, la relación de unión entre miR-18b-3p y LEP sigue siendo elusiva. Por tanto, nuestro objetivo fue explorar papel del miR-18b-3p exosomal derivado de hucMSC en PE con participación de LEP, inferiendo que miR-18b-3p exosomal derivado de hucMSC puede inhibir progresión PE mediante dirigirse a LEP.

Materiales y Métodos

Aprobación Ética

El estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Hospital Popular de la Universidad de Wuhan. Todos los participantes firmaron documento de consentimiento informado. Todos los experimentos con animales se ajustaron a la Guía para Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por Comités Internacionales del Hospital Popular de la Universidad de Wuhan.

Aislamiento, Cultivo e Identificación de hucMSCs

Cordón umbilical fetal de parturienta sana recolectado, cortado en trozos pequeños, filtrado con tamiz y mezclado con solución fosfato-salino (PBS). Tejidos centrifugados 1500 rpm 5 min con radio centrífugo 10 cm. Tejidos suspendidos con medio DMEM/F12 conteniendo 10% suero fetal bovino (FBS) y transferidos a frasco cultivo. Líquidos cambiados tras 4 días y luego cada 3 días. Células subcultivadas cuando confluencia ~90%. Crecimiento adherente y morfología hucMSCs observados bajo microscopio óptico. Células teñidas con solución tinción rojo aceite O (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) para detectar diferenciación osteogénica hucMSCs y teñidas con solución tinción fosfatasa alcalina (ALP) (Beyotime) para detectar diferenciación adipogénica. Citómetro flujo (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, USA) para test CD73, CD166 (ambos 1:10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) y CD105 (1:20, AbD Serotec, Oxford, UK).

Extracción e Identificación de hucMSC-Exos

hucMSCs bien cultivados. Surnadante recolectado y centrifugado 28,500 rpm 1 h radio 10 cm. Surnadante descartado, células fijadas con 2% glutaraldehído y 1% ácido osmico, deshidratadas etanol, inmersas óxido propileno, secadas 2 h, incluidas Epon812 y seccionadas. Cortes teñidos uranio y plomo respectivamente. Finalmente, exosomas observados bajo microscopio electrónico. Detector Nanosight (Malvern Instruments, Malvern, UK) para detectar imagen movimiento browniano nanopartículas exosomas y tamaño. Marcadores superficie hucMSC-Exos identificados por western blot, resultados mostraron expresión CD9, CD81, CD63.

Método Infección Lentivirus

hucMSC infectado con lentivirus conteniendo vector baja expresión miR-18b-3p y vector control negativo (NC) baja expresión miR-18b-3p (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Shanghai, China). Finalmente, hucMSC-antagomir NC y hucMSC-miR-18b-3p antagomir expresados establemente obtenidos. Células cultivadas 48 h, surnadante recolectado y centrifugado con ultracentrifugación para obtener Exos-antagomir NC y Exos-miR-18b-3p antagomir correspondientes.

Animales Experimentales

Ratas Wistar (peso 200-250 g, edad 8 sem, independientemente género) nivel salud-limpio y madurez sexual seleccionadas (Centro Animal Experimental Universidad Wuhan, Wuhan, China). Ratas alimentadas en sistema barrera con temperatura 18-28 °C, humedad relativa 40-70% y dieta y agua adecuadas.

Establecimiento Modelos Rata PE

Modelo rata PE establecido por inyección intraperitoneal 50 mg/kg inhibidor sintasa óxido nítrico, N(G)-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, Beyotime) con referencia a artículo. Establecimiento exitoso modelo PE basado en presión arterial aumentada 20 mmHg y >115 mmHg y proteinuria aumentada.

Agrupamiento Animal

Rata hembra y macho cohabitadas aleatoriamente 1:1, mantenidas en jaula especial individual 5-6 pm día previo. Esperma en secreciones vaginales hembra observado por tapón vaginal y microscopio día siguiente. Si positivo simultáneamente, día registrado como día 0 gestación. Desde día 13 gestación, ratas divididas en 6 grupos (10 ratas cada grupo): grupo normal (misma cantidad suero salino normal inyectado intraperitonealmente día 13-20 gestación), grupo PE (L-NAME [50 mg/kg/día] inyectado intraperitonealmente día 13-20 gestación, 20 μL suero salino normal inyectado placenta día 16-19 gestación), grupo PE + miR-NC (L-NAME [50 mg/kg/día] día 13-20, 20 μL 4 nmol miR-NC inyectado placenta día 16-19), grupo PE + miR-18b-3p agomir (L-NAME [50 mg/kg/día] día 13-20, 20 μL 4 nmol miR-18b-3p agomir inyectado placenta día 16-19), grupo PE + miR-18b-3p antagomir (L-NAME [50 mg/kg/día] día 13-20, 20 μL 4 nmol miR-18b-3p antagomir inyectado placenta día 16-19), grupo PE + miR-18b-3p antagomir + si-LEP (L-NAME [50 mg/kg/día] día 13-20, 20 μL 4 nmol miR-18b-3p antagomir y si-LEP inyectado placenta día 16-19) y grupo PE + si-LEP (L-NAME [50 mg/kg/día] día 13-20, 20 μL 4 nmol si-LEP inyectado placenta día 16-19). Ratas tratadas con exosomas y exosomas portadores lentivirus. Ratas asignadas 5 grupos (10 cada grupo): grupo normal (misma cantidad suero salino normal inyectado intraperitonealmente día 13-20 gestación), grupo PE (L-NAME (50 mg/kg/día) inyectado intraperitonealmente día 13-20, 20 μL suero salino normal inyectado placenta día 16-19), grupo PE + Exos (L-NAME (50 mg/kg/día) día 13-20, 20 μL Exos (80 μg exosomas suspendidos en 20 μL suero salino normal) inyectado placenta día 16-19), grupo PE + Exos-antagomir NC (L-NAME (50 mg/kg/día) día 13-20, 20 μL Exos-antagomir NC (80 μg exosomas en 20 μL suero salino normal) inyectado placenta día 16-19) y grupo PE + Exos-miR-18b-3p antagomir (L-NAME (50 mg/kg/día) día 13-20, 20 μL Exos-miR-18b-3p antagomir (80 μg exosomas en 20 μL suero salino normal) inyectado placenta día 16-19).

Detección Presión Arterial Sistólica (PAS) y Determinación Proteinuria 24-h

Presión ratas medida por medición presión arterial cola-rata. PAS cola-cuff de todas ratas embarazadas medida días 10, 13, 16, 19 gestación usando detector presión arterial cola-rata (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, USA). Presión medida 3 veces corto tiempo; promedio tomado como presión arterial.

Con dieta y agua libres, orina 24-h ratas embarazadas recolectada días 10, 13, 16, 19 gestación, contenido proteico detectado en nefrología Hospital Popular Universidad Wuhan.

Recolección Muestras

Ratas embarazadas anestesiadas 3% pentobarbital sódico día 21 gestación. Sangre periférica preservada, centrifugada para tomar suero, almacenada -20 °C. Luego feto y placenta extraídos por cesárea, membrana fetal y cordón umbilical conectado removidos, cordón conectado a feto cortado. Placenta y feto colocados gasa estéril secar sangre y líquido amniótico, pesados en balanza analítica. Parte tejidos placentarios fijada 4% paraformaldehído, deshidratada etanol, clarificada xileno, incluida parafina, seccionada transversalmente continua (5 μm) para tinción HE y TUNEL. Resto almacenado -80 °C para RT-qPCR, Western blot, ELISA.

ELISA

Factor necrosis tumoral-α (TNF-α), interleucina (IL)-1β e IL-6 en suero testados por ELISA. Concentraciones TNF-α, IL-1β, IL-6 determinadas siguiendo instrucciones kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Valores densidad óptica (OD) (490 nm) testados lector microplacas (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Curva estándar obtenida usando OD como abscisa y concentración muestra estándar como ordenada. Concentraciones TNF-α, IL-1β, IL-6 calculadas desde curva estándar.

Tinción HE

Muestras parafina tejidos placentarios clarificadas xileno, deshidratadas alcohol gradiente convencional, teñidas hematoxilina, diferenciadas 1% alcohol ácido clorhídrico, retornadas azul 1% agua amoníaco. Luego contrateñidas 1% solución eosina, deshidratadas (75%, 90%, 95% etanol, alcohol absoluto) y clarificadas xileno, secadas, bloqueadas, observadas microscopio electrónico.

Tinción TUNEL

Secciones incluidas parafina desparafinadas y deshidratadas rutinariamente según instrucciones, apoptosis detectada por kit TUNEL (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, China). 4,6-Diamino-2-fenilindol (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) usado para observar células TUNEL-positivas usando microscopio fluorescencia (Nikon, Tokyo, Japan).

RT-qPCR

Tejidos placentarios pesados. Por 50-100 mg tejidos añadidos 1 mL TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) disueltos completamente. Añadidos 200 μL cloroformo, centrifugados 4 °C, 12,000 rpm extraer ARN total. Concentración y pureza ARN determinadas por espectrofotómetro proteínas ácidos nucleicos DU-800 (Beckman). U6 y β-actina usados como controles carga. Cebadores PCR diseñados y compuestos por Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China). Secuencias cebadores en Tabla 1. ARN revertido a cDNA según instrucciones kit transcripción reversa ARN (Sangon). PCR amplificado, productos verificados electroforesis gel agarosa. Datos computados método 2^(-ΔΔCt).

Ensayo Western Blot

Proteína total tejidos placentarios extraída por lisado radio-inmunoprecipitación (Beyotime). hucMSC-Exo usado para tampón extracción, centrifugado 14,000 rpm. Surnadante preservado para test expresión proteína marcador exosomal (CD81, CD63, CD9) en suero. Concentración proteica determinada kit ácido bicinconínico (Beyotime, P0010). Muestra cargada según resultados cuantitativos proteína, tratada electroforesis gel poliacrilamida SDS 10% y transferida membrana. Membrana bloqueada 5% leche descremada, sondada anticuerpos primarios LEP, CD63, CD81, CD9, β-actina (4 mL, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA), re-sondada 4 mL anticuerpo secundario cabra anti-conejo IgG/peroxidasa rábano, expuesta y desarrollada. β-Actina referencia interna. Valor gris analizado software Image Lab análisis gráfico gel.

Ensayo Reportero Luciferasa Dual

Software predicción online https://cm.jefferson.edu/ para predecir relación diana miR-18b-3p y LEP y sitio unión miR-18b-3p y LEP 3'región no traducida (UTR). Secuencia región promotor LEP 3'UTR conteniendo sitio unión miR-18b-3p compuesta. Plásmidos LEP 3'UTR tipo salvaje (WT) y LEP 3'UTR tipo mutante (MUT) construidos. Plásmidos recombinantes nombrados LEP 3'UTR-WT y LEP 3'UTR-MUT. Células 293T cultivadas co-transfectadas con mimic miR-18b-3p y LEP 3'UTR-WT, mimic miR-18b-3p y LEP 3'UTR-MUT, mimic NC y LEP 3'UTR-WT, mimic NC y LEP 3'UTR-MUT por 30 h. Luego células 293T recolectadas. Actividad luciferasa luciérnaga y renilla medida por mediciones luminiscencia según kit detección reportero luciferasa dual (Promega, Madison, WI, USA).

Ensayo Pull-Down ARN

Sondas ARN biotiniladas (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p, Bio-miR-18b-3p-Mut) incubadas con lisado células 293T y extraídas usando cuentas magnéticas conjugadas con estreptomicina antibiótico. Experimento realizado según instrucciones kits pull-down ARN magnético Pierce (Pierce, IL, USA). ARN eluido y purificado usando TRIzol (Pierce). Enriquecimiento LEP en complejo ARN cuantificado RT-qPCR como descrito previamente.

Análisis Estadístico

Todos datos explicados por software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Datos medición indicados media ± desviación estándar. Datos conducidos test t muestra independiente para comparaciones dos grupos, mientras comparaciones múltiples grupos evaluadas ANOVA unidireccional seguido test post-hoc Tukey. Criterio significancia estadística p < 0.05.

Resultados

Morfología e Identificación hucMSC y hucMSC-Exos

Masas tejido cordón umbilical observadas microscopio invertido. Día 3 células salieron masa tisular; células forma huso e hilos, crecieron como colonia ~5 días. Cultivo pasaje 3, morfología células fusiforme larga uniforme similar fibroblastos, disposición regular (Fig. 1a). Tras 2 sem diferenciación adipogénica hucMSC, gotas lípidas formadas citoplasma, estructura Kranz bajo microscopio invertido (Fig. 1b), sugiriendo hucMSC aisladas cultivadas capacidad diferenciación adipogénica. Tras 2 sem diferenciación osteogénica, numerosos nódulos calcio marrones visibles microscopio invertido (Fig. 1c), indicando capacidad diferenciación osteogénica. Citómetro flujo para test inmunofenotipo células, resultados: células sobreexpresaron marcadores superficie CD73, CD105, CD166 MSCs (Fig. 1d).

Morfología hucMSC-Exos observada TEM, resultados: exosomas redondos u ovales con densidad central baja y tinción gruesa ambos lados (Fig. 1e). Análisis Nanosight para analizar tamaño partícula exosomas, resultados: tamaño partícula distribuido principalmente entre 40-100 nm, más concentrado ~80 nm (Fig. 1f). Western blot reveló expresión todos marcadores superficie CD81, CD63, CD9 en hucMSC-Exos (Fig. 1g).

Restauración miR-18b-3p Alivia Características Patológicas Ratas PE

Resultados PAS y proteinuria 24-h: sin diferencia significativa PAS y proteinuria 6 grupos antes administración (día 10 gestación). PAS y proteinuria día 19 gestación sin diferencia obvia ratas normales. En ratas PE o ratas PE tratadas miR-NC, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir + si-LEP, si-NC o si-LEP, PAS y proteinuria comenzaron aumentar día 13 gestación. Sin diferencia distinta PAS y proteinuria día 16 y 19 gestación en ratas PE tratadas miR-18b-3p agomir y si-LEP. Ratas PE tuvieron PAS y proteinuria aumentadas día 19 gestación; aumento reducido por elevación miR-18b-3p pero potenciado por inhibición miR-18b-3p; reducción LEP abrogó papel regulación negativa miR-18b-3p en PAS y proteinuria día 19 gestación ratas PE (Fig. 2a, b).

Peso feto y placenta reducido en ratas PE; miR-18b-3p regulado al alza o LEP regulado negativamente aumentaron, mientras miR-18b-3p regulado negativamente disminuyó peso feto y placenta en ratas PE; silenciamiento LEP revirtió efecto inhibición miR-18b-3p en peso feto y placenta ratas PE (Fig. 2c, d).

Factores inflamatorios suero ratas PE detectados. TNF-α, IL-1β, IL-6 aumentaron en ratas PE; elevación miR-18b-3p o inhibición LEP suprimieron, mientras reducción miR-18b-3p promovió contenidos TNF-α, IL-1β, IL-6; efecto miR-18b-3p inhibido en TNF-α, IL-1β, IL-6 abrogado por depleción LEP (Fig. 2e).

miR-18b-3p Sobreexpresado Mejora Cambio Histopatológico Tejidos Placenta Ratas PE

En ratas normales, vellosidad placentaria rica vasos sanguíneos estructura clara, sincitiotrofoblastos principales trofoblastos vellosidades, menos citotrofoblastos. En ratas PE o ratas PE tratadas miR-NC, miR-18b-3p antagomir, si-NC o miR-18b-3p antagomir + si-LEP, número vellosidades placentarias disminuyó, estructura borrosa atrofiada, algunas vellosidades necrosis fibrinoide, nódulos sincitiotrofoblásticos vellosidades aumentados, mayoría vellosidades inmaduras. Número trofocitos reducido, cambios patológicos aliviados en ratas PE tratadas miR-18b-3p agomir y si-LEP (Fig. 3a).

Tinción TUNEL sugirió pocas células apoptóticas. Ratas PE tuvieron células apoptóticas aumentadas, reducidas por elevación miR-18b-3p y silenciamiento LEP, potenciadas por inhibición miR-18b-3p; silenciamiento LEP también revirtió efecto inhibición miR-18b-3p en número células apoptóticas ratas PE (Fig. 3b, c).

En conjunto, ratas con miR-18b-3p regulado al alza o LEP inhibido tuvieron grado reducido progresión PE en histología, y LEP silenciado pudo abolir efecto terapéutico miR-18b-3p inhibido.

miR-18b-3p Regulado Negativamente, LEP Regulado Positivamente en Tejidos Placentarios Ratas PE y miR-18b-3p Dirige LEP

Basado en resultados previos, regulación negativa LEP revirtió efecto terapéutico regulación negativa miR-18b-3p en ratas PE en patología e histología; hipotetizamos miR-18b-3p relacionado con LEP.

Western blot y RT-qPCR revelaron ratas PE tuvieron miR-18b-3p disminuido y LEP expresión aumentada; tratamiento miR-18b-3p agomir reguló al alza miR-18b-3p y reguló negativamente LEP en ratas PE, mientras tratamiento miR-18b-3p antagomir aumentó expresión LEP; silenciamiento LEP revirtió efecto promotor reducción miR-18b-3p en expresión LEP ratas PE (Fig. 4a-c).

Western blot y RT-qPCR para explorar papel exosomas en ratas PE. Resultados mostraron exosomas regularon al alza miR-18b-3p y regularon negativamente LEP en ratas PE, indicando efecto supresor exosomas en desarrollo PE. Además, exosomas transmitiendo miR-18b-3p antagomir indujeron regulación negativa miR-18b-3p y regulación positiva LEP en ratas PE (Fig. 4d-f).

Relación diana miR-18b-3p y LEP predicha software bioinformática online https://cm.jefferson.edu/ (Fig. 4g). Ensayo reportero luciferasa dual sugirió mimic miR-18b-3p disminuyó actividad luciferasa LEP 3'UTR-WT, sin impacto en LEP 3'UTR-MUT (Fig. 4h). Además, ensayo pull-down ARN reveló enriquecimiento LEP aumentado por miR-18b-3p biotinilado WT (Fig. 4i). Hallazgos indicaron LEP gen diana miR-18b-3p.

hucMSC-Exos Atenúan Características Patológicas Ratas PE

Resultados PAS y 24 h: sin diferencia significativa PAS y proteinuria 5 grupos antes administración (día 10 gestación). PAS y proteinuria día 19 gestación sin diferencia distinta ratas normales. En ratas PE, PAS y proteinuria comenzaron subir día 13 gestación. Sin diferencia distinta PAS y proteinuria día 16 y 19 gestación en ratas PE tratadas hucMSC-Exos y hucMSC-Exos transmitiendo antagomir NC. PAS y proteinuria aumentaron día 19 gestación ratas PE, mientras aumento reducido por inyección hucMSC-Exos. Inhibición miR-18b-3p revirtió efecto hucMSC-Exos en PAS y proteinuria día 19 gestación ratas PE (Fig. 5a, b).

Peso feto y placenta medido: ratas PE tuvieron peso feto y placenta disminuido; regulación negativa miR-18b-3p abolió papel hucMSC-Exos en peso feto y placenta ratas PE (Fig. 5c, d).

Factores inflamatorios suero detectados ELISA. TNF-α, IL-1β, IL-6 aumentaron notablemente ratas PE. Tratamiento exosomas disminuyó TNF-α, IL-1β, IL-6 suero ratas PE, aumentados por inyección exosomas inhibiendo miR-18b-3p (Fig. 5e).

Exosomas Alivian Cambio Patológico e Inhiben Apoptosis Tejidos Placenta Ratas PE

En ratas normales, vellosidad placentaria abundante vasos sanguíneos estructura clara, sincitiotrofoblastos principal trofoblasto vellosidades, menos citotrofoblastos. En ratas PE y ratas PE tratadas hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, número vellosidades placentarias reducido, estructura borrosa atrofiada, algunas vellosidades necrosis fibrinoide, nódulos sincitiotrofoblásticos vellosidades aumentados, mayoría vellosidades inmaduras. Cambio patológico mejorado ratas PE tratadas hucMSC-Exos o hucMSC-Exos-antagomir NC vs ratas PE y ratas PE tratadas hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir (Fig. 6a).

Tinción TUNEL indicó: ratas normales, pocas células apoptóticas. Ratas PE tuvieron células apoptóticas aumentadas, reducción miR-18b-3p revirtió impactos hucMSC-Exos en número células apoptóticas tejidos placenta ratas PE (Fig. 6b, c).

Discusión

PE es trastorno embarazo multisistémico caracterizado por proteinuria y presión arterial alta u otras condiciones adversas, vinculado a amplia gama disfunción endotelial materna. Reportado hucMSC-Exo mejoró morfología tejido placentario ratas PE suprimiendo apoptosis celular y facilitando angiogénesis tejido placentario manera dosis-dependiente. Estudio reportó expresión miR-18b afectó migración, viabilidad, invasión células PE. Además, verificado concentración LEP materna aumentada e hipometilación LEP placenta PE temprano. Estudio actual diseñado explorar efecto exosomas y miR-18b-3p dirigido LEP en ocurrencia PE. Hallazgos revelaron miR-18b-3p exosomal derivado hucMSC inhibió progresión PE reduciendo LEP.

Basado en hallazgos, miR-18b-3p reducido y LEP elevado tejidos placentarios ratas PE. Similar a nuestro estudio, expresión ARNm miR-18b marcadamente suprimida tejidos placentarios PE vs tejidos placentarios normales. Además, estudio reveló contenido miR-18b dramáticamente reducido tejidos melanoma maligno vs tejidos adyacentes no tumorales pareados. Otro estudio verificó expresión placentaria LEP elevada PE pretérmino vs controles. Además, estudio mostró expresión LEP obviamente aumentada placentas preeclámpticas. Literatura base teórica explorar expresión anormal miR-18b-3p y LEP en PE. Además, predicho software bioinformático LEP dirigido por miR-18b-3p, relación diana confirmada ensayo reportero luciferasa dual. Estudio reportó LEP diana tres miRNAs (miR-1301, miR-223, miR-224) PE temprano. Otro estudio mostró LEP disminuyó expresión miR-93 osteoartritis y artritis reumatoide. Sin embargo, unión miR-18b-3p y LEP en enfermedades humanas, especialmente PE, escasamente estudiada, novedad este estudio. Además, resultado nuestro estudio: exosomas aumentaron miR-18b-3p y disminuyeron LEP tejidos placentarios PE. Documentado previamente expresión miR-18b-5p notablemente elevada exosomas plasma cáncer colorrectal, mientras relación hucMSC-Exos y miR-18b-3p/LEP en PE necesita más estudio.

Adicionalmente, hallazgo investigación: miR-18b-3p restaurado redujo PAS y proteinuria 24-h ratas PE, aumentó peso placenta, disminuyó TNF-α, IL-1β, IL-6 suero y tejidos placentarios, suprimió apoptosis celular. Datos indicaron elevación miR-18b-3p contribuye aliviar síntomas y cambios patológicos PE. Demostrado regulación al alza estable miR-18b produjo actividad inhibidora tumoral efectiva, inhibiendo viabilidad células melanoma, induciendo apoptosis, reduciendo crecimiento tumoral in vivo. Otro resultado: hucMSC-Exos redujeron PAS y proteinuria 24-h ratas PE, aumentaron peso placenta, disminuyeron TNF-α, IL-1β, IL-6 suero y tejidos placentarios, suprimieron apoptosis. Hallazgos estudio actual revelaron exosomas trataron modelos rata PE presentaron aumento número y calidad fetos, calidad placenta, apoptosis celular significativamente reducida. Interesante, investigación previa demostró adición exosomas suero fetal bovino disminuyó contenidos macrófago TNF-α e IL-6. Estudio reveló exosomas purificados suprimieron producción IL-1β macrófagos estimulados lipopolisacárido/nigericina. Nong et al. sugirieron marcadores inflamatorios TNF-α, IL-6 dramáticamente disminuidos tras administración exosomas producidos MSCs derivadas células madre pluripotentes inducidas humanas. Artículo halló PAS marcadamente elevada grupo mujeres desarrollaron PE luego. Mostrado pacientes PE asociados positivamente PAS, presiones diastólicas y proteinuria. Estudio reciente: proteinuria aumentó con avance gestación mujeres PE. Hallazgo importante: ratas grupo PE tuvieron TNF-α aumentado vs grupo normal embarazado. Otro estudio verificó IL-6 e IL-1β sérico obviamente elevados mujeres PE vs controles. Hallazgos sugirieron pacientes PE usualmente mostraron PAS alta, proteinuria, niveles factores inflamatorios. Así, inferido de nuestros resultados que miR-18b-3p exosomal derivado hucMSC tuvo efecto terapéutico PE.

Conclusiones

En conclusión, nuestro estudio proporciona evidencia que exosomas derivados hucMSCs regulan al alza miR-18b-3p, que dirige LEP para suprimir contenidos factores inflamatorios y reducir tasa apoptosis celular en tejidos placentarios ratas PE, inhibiendo ocurrencia PE. Así, miR-18b-3p exosomal puede ser candidato potencial tratamiento PE vía dirigirse LEP. Esta investigación identificó papel miR-18b-3p exosomal derivado hucMSC dirigiendo LEP durante desarrollo PE por primera vez, proporcionando nueva perspectiva para tratamiento PE. Sin embargo, debido a limitación investigaciones conocidas, estudio necesita monitoreo riguroso e informe apropiado futuros ensayos clínicos.