El microARN-124-5p mediado por HDAC1 regula el NPY para afectar las capacidades de aprendizaje y memoria en ratas con depresión

Materiales y métodos

Declaración de ética

Los experimentos con animales involucrados en este estudio se adhirieron a los requisitos de la ética animal experimental del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin. Los experimentos se optimizaron para mejorar las condiciones de alimentación de los animales experimentales, reducir la cantidad de animales utilizados y aliviar el sufrimiento de los animales.

Animales experimentales

El Centro de Investigación Animal, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin (Harbin, China) proporcionó ratas macho Sprague-Dawley (SD) de grado libre de patógenos específicos (SPF), con un peso de 200 a 220 g. Las ratas se mantuvieron en un ambiente de grado SPF (22-24 ° C, 60-64% de humedad, ciclos de luz y oscuridad de 12 h). Excepto por el período durante el modelado y otros momentos específicos, las ratas tenían libertad para obtener agua y comida.

Agrupación de ratas y establecimiento modelo

Las ratas modeladas se dividieron aleatoriamente en 8 grupos ( n =10):grupo normal (ratas sin ningún tratamiento), grupo CUMS (ratas con depresión inducida por CUMS), grupo de control sh-negativo (NC) (ratas con depresión inducida por CUMS inyectadas con lentivirus sh-HDAC1 NC), grupo sh-HDAC1 (Ratas con depresión inducida por CUMS inyectadas con lentivirus sh-HDAC1), grupo anti-miR-NC (ratas con depresión inducida por CUMS inyectadas con lentivirus NC anti-miR-124-5p), grupo anti-miR-124-5p (CUMS- ratas con depresión inducida inyectadas con lentivirus anti-miR-124-5p), grupo anti-miR-124-5p + sh-NC (ratas con depresión inducida por CUMS inyectadas con lentivirus anti-miR-124-5p y lentivirus sh-NPY NC) y grupo anti-miR-124-5p + sh-NPY (ratas con depresión inducida por CUMS inyectadas con lentivirus anti-miR-124-5p y lentivirus sh-NPY).

Los modelos de ratas con depresión inducida por CUMS se establecieron mediante el método de Willner [18]. Las ratas del grupo normal fueron alimentadas con comida y agua sin ningún estímulo, mientras que las ratas de los otros 7 grupos recibieron CUMS durante 35 días en jaulas independientes. Estas ratas fueron estimuladas nadando en agua helada a 4 ° C durante 5 min en un recipiente (30 cm de profundidad del agua), inversión diurna y nocturna (las ratas permanecían en la oscuridad durante 12 h durante el día y en un espacio luminoso iluminado por lámparas incandescentes durante 12 h durante la noche), sujeción de la cola con un clip de cola de golondrina durante 30 s, agitación de 1 min, ayuno de 24 h y privación de agua, estimulación ultrasónica de 30 min (50 Hz), acolchado húmedo y aire acondicionado a los 17 ℃. Las ratas fueron estimuladas al azar por uno de estos estímulos diariamente, y el mismo estímulo se aplicó no más de 5 veces en total.

Las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico al 2% (50 mg / kg) y se inyectaron lentivirus en el hipocampo bilateral (diámetro anteroposterior =4,8 mm, distancia mediolateral =± 2,5 mm, distancia entre la cavidad posterior y la fontanela anterior =- 3,5 mm) con lentivirus a 1 μL / min mediante una micro-jeringa Hamilton con una aguja 26-G. La aguja se mantuvo en el lugar de la inyección durante 5 min para prevenir el reflujo. Los cráneos se sellaron con cera para huesos y las incisiones se suturaron, y las ratas se recuperaron durante 7 días [19]. lentivirus sh-HDAC1 y su NC, lentivirus anti-miR-124-5p y su NC, así como sh-NPY y su NC (título:10 ⁸ TU / mL) se compraron a GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Pruebas de función de comportamiento

Las ratas se pesaron el día anterior al modelado CUMS (el día 0), después del modelado CUMS (el día 36) y después de la interferencia del lentivirus (el día 52).

La prueba de campo abierto (OFT) podría detectar los comportamientos autónomos y exploratorios de las ratas en un nuevo entorno, que se usaba comúnmente para evaluar los comportamientos depresivos. Esta prueba se llevó a cabo en una caja de campo abierto de madera negra (100 cm x 100 cm x 50 cm) con un sistema de seguimiento de video colocado encima de la caja de campo abierto para registrar las actividades de las ratas. El fondo de la caja abierta se dividió en 25 rejillas (20 cm x 20 cm) con líneas blancas. Las ratas se colocaron en la cuadrícula central en un orden aleatorio predefinido y la cantidad de cruce de la cuadrícula (ratas que ingresan a una cuadrícula con extremidades o extremidades anteriores dobles con una extremidad trasera) y la incidencia de crianza (ratas levantando las extremidades anteriores y de pie con una miembros posteriores) fueron registrados por el sistema de seguimiento de vídeo. Esta prueba se realizó en un ambiente interior silencioso y oscuro. Después de cada prueba, la caja de campo abierto se limpió con alcohol al 75% para eliminar los olores.

La anhedonia fue uno de los síntomas cruciales de la depresión. La prueba de preferencia de sacarosa (SPT) podría evaluar los comportamientos depresivos de las ratas. Antes de la SPT, cada rata recibió 2 botellas de agua azucarada (sacarosa al 1%, p / p) durante 24 h, y 1 botella de agua esterilizada y 1 botella de agua azucarada durante otras 24 h. Después de eso, el porcentaje de preferencia de sacarosa (SPP) de las ratas se detectó de la siguiente manera:después de 23 h de ayuno y privación de agua, se permitió a las ratas 1 botella de agua esterilizada y 1 botella de agua azucarada (sacarosa al 1%) durante 30 min. Después de 1 h, la ubicación de las dos botellas se invirtió y las ratas estuvieron libres de estas dos botellas durante otros 30 minutos. Durante esta 1 h, se midió el consumo (mL) de estas dos botellas de agua esterilizada y agua azucarada (sacarosa al 1%) y se calculó la SPP. SPP =consumo de agua azucarada / (consumo de agua azucarada + consumo de agua esterilizada) × 100%.

La prueba del laberinto de agua de Morris (MWM) se aplicó ampliamente para evaluar el aprendizaje espacial y las habilidades de memoria de las ratas. La prueba de MWM se realizó en un tanque de agua circular (150 cm de diámetro y 60 cm de altura) con una profundidad de agua de 40 cm. La temperatura del agua se mantuvo a 22 ± 1 ° C y el agua se tiñó de negro con un tinte no tóxico y fácil de limpiar. El tanque y la superficie del agua se dividieron en 4 cuadrantes (cuadrantes SE, SW, NW y NE) con cada cuadrante decorado con su icono correspondiente con color brillante y forma especial en la pared interior. La plataforma objetivo era una plataforma circular transparente (11 cm de diámetro), ubicada en el centro del cuadrante NE y sumergida 1,5 cm por debajo de la superficie del agua. Se instaló un sistema de seguimiento de video sobre el centro del tanque para registrar la velocidad de nado, la trayectoria y el tiempo que dedican las ratas a entrar en la plataforma objetivo y nadar en cuadrantes. Las ratas se colocaron en el agua de 4 cuadrantes en un orden aleatorio y se les permitió explorar y abordar la plataforma objetivo en 60 s. El tiempo que tardaban las ratas en subir a la plataforma se registró como latencia de escape. Si las ratas no lograban abordar la plataforma objetivo en 60 s, se las guiaba y la latencia de escape se registraba como 60 s. Después de cada prueba, se permitió que las ratas permanecieran en la plataforma objetivo durante 15 sy se entrenó a las ratas 4 veces al día durante 5 días. La latencia de escape final fue el promedio de la latencia de escape del 3 al 5. En el sexto día de la prueba MWM, se realizó la prueba de exploración espacial. La plataforma objetivo se retiró del tanque de agua y las ratas entraron al agua desde el cuadrante SO. El tiempo de las ratas nadando en el cuadrante NE en 60 s se registró como tiempo de exploración espacial.

La línea de tiempo de este experimento se muestra en la Fig. 1.

Cronología del presente estudio

Colección de muestras

Un día después de la última prueba de MWM, las ratas se sacrificaron y se inyectaron intraperitonealmente con pentobarbital sódico al 2% (50 mg / kg). Se abrió la cavidad torácica para obtener sangre del corazón con una jeringa, la cual se centrifugó 3 veces a 3500 r / min durante 15 min, y el sobrenadante se almacenó a -20 ° C. Después de la extracción de sangre, se insertó un catéter desde el ventrículo izquierdo hasta la aorta y se perfundieron 500 ml de solución salina normal para lavar toda la sangre. Los tejidos del hipocampo se separaron y se colocaron en tubos de centrífuga de 1,5 ml, se pesaron y se almacenaron a -80 ° C. Una parte del hipocampo se fijó con paraformaldehído al 4% durante 2 h, se deshidrató con gradiente de sacarosa y se incrustó en parafina.

Detección de índices inflamatorios y relacionados con el estrés oxidativo

El suero se calentó para detectar la concentración de superóxido dismutasa (SOD), malondialquehyche (MDA), glutatión (GSH), interleucina (IL) -β, factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y óxido nítrico (NO). Los kits para la detección de SOD, MDA y GSH fueron proporcionados por el Instituto de Biotecnología Beyotime (Shanghai, China), mientras que los kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección de IL-β, TNF-α y NO por el Instituto de Bioingeniería NanJing JianCheng ( Nanjing, China).

Tinción con hematoxilina-eosina (HE)

Las secciones de parafina se desparafinaron, se hidrataron con etanol, se enjuagaron con agua destilada y se tiñeron con solución de tinción de hematoxilina durante 20 min. Después de eso, las secciones se enjuagaron con agua del grifo hasta que se volvieron azules. Luego, los cortes se colocaron en solución etanólica de ácido clorhídrico al 1% durante 10 s, se enjuagaron con agua del grifo y se deshidrataron con etanol, seguido de tinción en eosina durante 2 min, deshidratación con alcohol de alta concentración y permeabilización en xileno. Finalmente, las secciones se sellaron y se observaron bajo un microscopio biológico.

Detección de expresión de neurotransmisores

Los tejidos del hipocampo se pesaron y homogeneizaron por ultrasonido en solución salina normal (100 μL / 10 mg). El homogeneizado se mantuvo a 4 ° C durante 30 min, se centrifugó a 12.000 rpm (4 ° C) durante 3 min para recoger el sobrenadante. La concentración de proteína del sobrenadante se detectó mediante el kit de detección de proteínas del ácido bicinconínico (BCA) (CWBIO, Beijing, China) y los niveles de expresión de norepinefrina (NE), serotonina (5-HT) y dopamina (DA) mediante kits de ELISA. Los kits de ELISA NE, 5-HT y DA fueron proporcionados por Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China).

Reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR)

El ARN se extrajo de los tejidos del hipocampo mediante un kit de extracción de ARN (Promega, Madison, WI, EE. UU.), Y la concentración y pureza del ARN se detectaron mediante un espectrofotómetro ultravioleta. Seguido de las instrucciones del kit de transcripción inversa (DRR047S, Takara, Dalian, China), se realizó la transcripción inversa de ARN en ADN complementario (ADNc). El ARNm se transcribió a la inversa en ADNc mediante el kit de RT-PCR de un solo paso de GoldScript (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE. UU.) mientras que el miARN mediante el kit de detección cuantitativa de miARN Hairpin-it ™ (GenePharma). Se aplicó el kit de detección RT-qPCR (Promega) para detectar la expresión de HDAC1, miR-124-5p y NPY en tejidos. Se indicó U6 como control interno para miR-124-5p mientras que β-actina para HDAC1 y NPY. Los cebadores de PCR se obtuvieron de Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabla 1). La expresión relativa de los genes diana se calculó mediante 2 ^{- △△} Método CT.

Análisis de Western Blot

Los tejidos del hipocampo se cortaron en trozos sobre hielo y se lisaron mediante lisado de ensayo de radioinmunoprecipitación (Beijing Solarbio Science &Technology Co. Ltd., Beijing, China) para extraer proteína. La concentración de proteína se determinó mediante el método BCA. Se añadió proteína total (50 μg) con 5 x tampón de carga de dodecilsulfato de sodio (SDS) a 1:4 y se calentó en un baño de agua hirviendo durante 5 min. Luego, la proteína se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, se sometió a electrotransferencia sobre una membrana y se bloqueó con leche al 5% durante 1 h. Después de eso, la proteína se probó con los anticuerpos primarios contra HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU.), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, California, EE. UU.) Y β-actina (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, Reino Unido) durante la noche y se repitió con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante. La membrana se desarrolló mediante quimioluminiscencia mejorada y la densidad óptica se calculó mediante el software de análisis de grises Cantidad Uno. La expresión de la proteína del gen diana se expresó como la relación entre el valor de gris y el valor de gris de β-actina.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

El ensayo de ChIP se realizó de acuerdo con las instrucciones del kit EZ-ChIP (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Las células HEK293T se incubaron con formaldehído al 1% durante 10 min y se terminaron con glicina. Luego, las células se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min y se agregaron con tampón de lisis SDS para ultrasonidos. Se centrifugaron a 10.000 ga 4 ℃ durante 10 min, las células (100 μL) se hicieron reaccionar con 900 μL de tampón de dilución ChIP, 20 μL de 50 × PIC y 60 μL de ADN de proteína A agarosa / esperma de salmón a 4 ℃ durante 1 h, y se se deja reposar durante 10 min. Los precipitados se centrifugaron a 700 rpm durante 1 min con 20 μL como entrada. Se agregó un tubo con anticuerpo HDAC1 (1 μL) y anticuerpo de inmunoglobulina G y el otro tubo se agregó sin anticuerpo. Las muestras de los dos tubos se incubaron durante la noche, se eluyeron y se reticularon. Después de la recuperación del ADN, la muestra se analizó mediante RT-qPCR.

Ensayo génico indicador de luciferasa dual

El sitio web de bioinformática (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) analizó los sitios de unión de miR-124-5p y NPY. Los plásmidos NPY de tipo salvaje (WT) y NPY mutante (MUT) fueron generados por Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). Combinados con imitador NC o miR-124-5p imitador, los plásmidos se transfectaron en células HEK293T. La actividad de la luciferasa celular se determinó mediante el kit de detección de luciferasa (BioVision) y el luminómetro Glomax20 / 20 (Promega).

Análisis estadístico

Se utilizó el software estadístico SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EE. UU.) Para el análisis de datos. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. t probó las comparaciones entre dos grupos prueba. Las comparaciones entre múltiples grupos se evaluaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), después de lo cual se realizaron comparaciones por pares mediante la prueba post hoc de Tukey. P representaba pruebas de dos caras y P <0,05 se consideró de significación estadística.

Resultados

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p aumenta el peso de las ratas deprimidas

Las ratas se pesaron 1 día antes del modelado CUMS (día 0), 1 día después del cese del modelado (día 36) y 7 días después de la interferencia del lentivirus (día 52). No se detectó ninguna diferencia en el peso corporal de las ratas en cada grupo antes del modelado (todas las P > 0,05). Después del modelado, el peso de la rata disminuyó en el grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC y grupo anti-miR-124-5p en comparación con el grupo normal (todos P <0,05). No se notó ninguna discrepancia en cuanto al peso de la rata en el grupo CUMS, el grupo sh-NC, el grupo sh-HDAC1, el grupo anti-miR-NC y el grupo anti-miR-124-5p (todos P > 0,05). Después de la interferencia, el peso de la rata disminuyó en el grupo CUMS en comparación con el grupo normal (todos P <0,05). No se notó ninguna discrepancia en cuanto al peso de la rata en el grupo CUMS, el grupo sh-NC y el grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05). El peso de la rata aumentó en el grupo sh-HDAC1 y el grupo anti-miR-124-5p en relación con sus grupos NC (ambos P <0.05), lo que indica que la inhibición de HDAC1 o miR-124-5p aumentó el peso de las ratas deprimidas (Fig. 2a).

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p aumenta el peso y mejora la capacidad de aprendizaje y memoria de las ratas deprimidas. un Efectos de la inhibición con HDAC1 o miR-124-5p sobre el peso corporal de ratas deprimidas; b SPP antes y después de la inhibición con HDAC1 o miR-124-5p; c Frecuencia de cruce de la cintura en OFT antes y después de la inhibición con HDAC1 o miR-124-5p; d Incidencia de cría en OFT antes y después de la inhibición con HDAC1 o miR-124-5p; e Latencia de escape en la prueba de MWM antes y después de la inhibición con HDAC1 o miR-124-5p; f Tiempo de exploración espacial en la prueba MWM antes y después de la inhibición con HDAC1 o miR-124-5p; n =10; a P <0,05 en comparación con el grupo normal; b P <0,05 en comparación con el grupo sh-NC; c P <0,05 en comparación con el grupo anti-miR-NC. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía y las comparaciones por pares mediante la prueba post hoc de Tukey

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p mejora las habilidades de aprendizaje y memoria en ratas deprimidas

Se aplicaron pruebas SPT, OFT y MWM para detectar SPP, frecuencia de cruce de la red e incidencia de cría, así como latencia de escape y tiempo de exploración espacial. Se destacó que (Fig. 2b-f) antes de la interferencia, en comparación con el grupo normal, SPP, la frecuencia de cruce de la cuadrícula, la incidencia de cría y el tiempo de exploración espacial se redujeron, mientras que la latencia de escape se prolongó en el grupo CUMS, sh-NC grupo, grupo sh-HDAC1, grupo anti-miR-NC y grupo anti-miR-124-5p (todos P <0,05), lo que sugiere el desarrollo de comportamientos similares a la depresión en ratas. No hubo discrepancia en SPP, frecuencia de cruce de la red, incidencia de cría, tiempo de exploración espacial y latencia de escape entre el grupo CUMS, el grupo sh-NC, el grupo sh-HDAC1, el grupo anti-miR-NC y anti-miR-124 -Grupo 5p (todos P > 0,05). Después de la interferencia, en comparación con el grupo sh-NC y el grupo anti-miR-NC, SPP, la frecuencia de cruce de la red, la incidencia de cría y el tiempo de exploración espacial aumentaron mientras que la latencia de escape se acortó en el grupo sh-HDAC1 y anti-miR-124- Grupo 5p (todos P <0,05). No se observaron diferencias en SPP, frecuencia de cruce de la red, incidencia de cría, tiempo de exploración espacial y latencia de escape entre el grupo CUMS, el grupo sh-NC y el grupo anti-miR-NC (todos P > 0.05), lo que sugiere que el silenciamiento de HDAC1 o la supresión de miR-124-5p podría atenuar comportamientos similares a la depresión y mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria en ratas.

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p atenúa el daño patológico de las neuronas en ratas deprimidas

La observación de las lesiones del hipocampo mediante tinción con HE (Fig. 3a) reveló que las neuronas ordenadas en el hipocampo de las ratas del grupo normal mostraban una morfología clara, una estructura normal, capas densas, núcleos de células claras y nucléolos obvios. Las neuronas de las ratas en el grupo CUMS se encogieron, disminuyeron en número y se organizaron libremente con cromatina distribuida de manera desigual y una capa adelgazada. Las ratas de los grupos sh-NC y anti-miR-NC mostraron la misma situación que el grupo CUMS. Las ratas de los grupos sh-HDAC1 y anti-miR-124-5p mostraron un aumento de las neuronas en orden y un daño atenuado en comparación con sus grupos NC. Se indicó que la eliminación de HDAC1 o la inhibición de miR-124-5p alivió las lesiones del hipocampo en ratas deprimidas.

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p atenúa el daño patológico del hipocampo y regula al alza la expresión de neurotransmisores en ratas deprimidas. un Tinción HE de lesiones hipocampales de ratas deprimidas; b ELISA de expresión de NE en tejidos hipocampales; c ELISA de expresión de 5-HT en tejidos del hipocampo; d ELISA de expresión de DA en tejidos hipocampales; n =6; a P <0,05 en comparación con el grupo normal; b P <0,05 en comparación con el grupo sh-NC; c P <0,05 en comparación con el grupo anti-miR-NC. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía y las comparaciones por pares mediante la prueba post hoc de Tukey

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p regula al alza la expresión de neurotransmisores en ratas deprimidas

La depresión estaba relacionada con trastornos de neurotransmisores cerebrales. Por tanto, los niveles de neurotransmisores DA, NE y 5-HT en el hipocampo de rata se midieron mediante ELISA. Los resultados indicaron que (Fig. 3b-d) con el grupo normal en contraste, se encontraron niveles reducidos de DA, NE y 5-HT en ratas del grupo CUMS, grupo sh-NC, grupo sh-HDAC1, anti-miR -Grupo NC y grupo anti-miR-124-5p (todos P <0,05). No se observaron diferencias en la expresión de neurotransmisores en el grupo CUMS, el grupo sh-NC y el grupo anti-miR-NC (todos P > 0,05). En relación con los grupos sh-NC y anti-miR-NC, los niveles de DA, NE y 5-HT aumentaron en ratas de los grupos sh-HDAC1 y anti-miR-124-5p (todos P <0,05), lo que implica que la regulación a la baja de HDAC1 o la reducción de miR-124-5p podría regular al alza los niveles de DA, NE y 5-HT en el hipocampo de ratas deprimidas.

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p suprime el estrés oxidativo y la inflamación en ratas deprimidas

Se midió la expresión de factores inflamatorios y relacionados con el estrés oxidativo en suero. Con respecto al grupo normal, las actividades de SOD y GSH se vieron afectadas, mientras que los niveles de MDA, IL-1β, TNF-α y NO aumentaron en los otros grupos del modelo de depresión (todos P <0,05). Las actividades de SOD y GSH, y los niveles de MDA, IL-1β, TNF-α y NO entre el grupo CUMS, el grupo sh-NC y el grupo anti-miR-NC no mostraron diferencias (todos P > 0,05). En relación al grupo sh-NC y al grupo anti-miR-NC, se notó un aumento en las actividades de SOD y GSH y se observó una disminución en los niveles de MDA, IL-1β, TNF-α y NO en el sh- Grupo HDAC1 y grupo anti-miR-124-5p (todos P <0.05) (Fig. 4a-f), lo que indica que el agotamiento de HDAC1 o la regulación a la baja de miR-124-5p podría aliviar el estrés oxidativo y la inflamación en ratas deprimidas.

La inhibición de HDAC1 o miR-124-5p suprime el estrés oxidativo y la inflamación en ratas deprimidas. un - c Efecto de la inhibición de HDAC1 o miR-124-5p sobre la concentración de SOD, MDA y GSH en suero de ratas deprimidas; d - f Efecto de la inhibición de HDAC1 o miR-124-5p sobre la concentración de IL-1β, TNF-α y NO en el suero de ratas deprimidas; n =10; a P <0,05 en comparación con el grupo normal; b P <0,05 en comparación con el grupo sh-NC; c P <0,05 en comparación con el grupo anti-miR-NC. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía y las comparaciones por pares mediante la prueba post hoc de Tukey

HDAC1 media el miR-124-5p para regular NPY

Se adoptaron RT-qPCR y análisis de transferencia Western para la detección de HDAC1, miR-124-5p y NPY en el hipocampo. Se destacó que (Fig. 5a, b) versus el grupo normal, HDAC1 y miR-124-5p aumentaron y NPY disminuyó en el grupo CUMS (todos P <0,05). La expresión de HDAC1, miR-124-5p y NPY no mostró variaciones en el grupo CUMS y el grupo sh-NC (todos P > 0,05). En relación con el grupo sh-NC, el grupo sh-HDAC1 se reflejó en una disminución de HDAC1 y miR-124-5p y niveles elevados de expresión de NPY (todos P <0,05). Los hallazgos anteriores sugirieron la interferencia exitosa del lentivirus y la relación positiva entre miR-124-5p y la expresión de HDAC1.

HDAC1 media el miR-124-5p para regular NPY. un Expresión de ARNm de HDAC1, miR-124-5p y NPY en tejidos del hipocampo después de la inhibición de HDAC1 por RT-qPCR ( n =6); b Expresión de proteínas HDAC1 y NPY en tejidos del hipocampo después de la inhibición de HDAC1 mediante análisis de transferencia Western ( n =6); c Expresión de ARNm de MiR-124-5p y NPY en tejidos del hipocampo después de la inhibición de miR-124-5p por RT-qPCR ( n =6); d Expresión de la proteína NPY en tejidos del hipocampo después de la inhibición de miR-124-5p mediante análisis de transferencia Western ( n =6); a P <0,05 en comparación con el grupo normal; c P <0,05 en comparación con el grupo sh-NC. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía y las comparaciones por pares mediante la prueba post hoc de Tukey

Además, la expresión de miR-124-5p y NPY después de la supresión de miR-124-5p se detectó con los resultados (Fig.5c, d) demostrando que en relación con el grupo normal, miR-124-5p elevado y NPY reducido se presentaron en el grupo CUMS (ambos P <0,05). Por el contrario, el grupo anti-miR-124-5p tendió hacia una disminución de miR-124-5p y un NPY elevado en relación con el grupo anti-miR-NC (ambos P <0,05). No se reconoció ninguna discrepancia en la expresión de miR-124-5p y NPY en el grupo CUMS y el grupo anti-miR-NC (ambos P > 0,05). Los resultados fueron indicativos de la interferencia exitosa del lentivirus y la conexión negativa entre NPY y miR-124-5p.

El ensayo de ChIP fue para probar si HDAC1 podría unirse al promotor miR-124-5p, y los resultados mostraron que (Fig.6a, b) HDAD1 solo estaba relacionado con el promotor miR-124-5p ( P <0,001), lo que indica que HDAC1 podría regular directamente miR-124-5p.

HDAC1 se une al promotor de miR-124-5p. un Unión de abundancia de HDAC1 y la región promotora de miR-124-5p en células HEK293T mediante ensayo de ChIP ( n =3); b Unión de abundancia de HDAC1 y regiones intergénicas no relacionadas en células HEK293T mediante ensayo de ChIP ( n =3); c Sitio de unión de MiR-124-5p y NPY por el sitio web del software de información biológica; d Relación de orientación entre miR-124-5p y NPY mediante el ensayo del gen indicador de luciferasa dual ( n =3); t probó las comparaciones entre dos grupos prueba

La relación de dirección entre miR-124-5p y NPY se predijo y verificó mediante la herramienta RNA22 y el ensayo del gen indicador de luciferasa dual (Fig. 6c, d). With respect to the cells co-transfection with NPY-3′UTR-WT and mimic NC, the cells with co-transfection of NPY-3′UTR-WT and miR-124-5p mimic showed impaired luciferase activity (P <0,05). No difference was recognized in the luciferase activity in the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and mimic NC, and the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and miR-124-5p mimic (P> 0,05).

Knockdown of NPY Abolishes the Protective Effects of Inhibited miR-124-5p on Depressed Rats

Spontaneous depletion of NPY and miR-124-5p was programmed to explore their interplay in depressed rats. It was exhibited that (Fig. 7a, b) lower NPY expression level was noticed in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (P <0,05). Body weight and behavioral function tests illustrated that (Fig. 7c–f) by comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group presented reduced weight, SPP, frequency of crossing the grid, incidence of rearing and space exploration time with increased escape latency (all P <0,05). HE staining of the hippocampal lesions pictured that (Fig. 8a) in comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the number of hippocampal neurons was reduced, and hippocampal neurons were darkly stained, sparsely and disorderly arranged in an irregular shape with reduced cell layers in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group. Moreover, versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group was accompanied by reduced DA, NE and 5-HT (all P  < 0.05) (Fig. 8b). Besides, impaired SOD and GSH activities, and increased MDA, IL-1β, TNF-α and NO levels existed in the rats of the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (all P  < 0.05) (Fig. 8c, d). Collectively, knockdown of NPY abolished the protective effects of repressed miR-124-5p on depressed rat.

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. un MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); b NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); c Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); e Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); f Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); Comparisons between two groups were tested by t prueba

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. un HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); b ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n  = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n =10). Comparisons between two groups were tested by t prueba

Discussion

Depression is a type of psychiatric disorder comprising a variety of conditions with diverse symptoms [20]. Though emerging studies have implied the role of miRNAs in depression, the precise action of miR-124-5p has been rarely investigated. Hence, the present study is projected for better comprehension of the mechanism of miR-124-5p/HDAC1/NPY axis in depression with the major outcome elaborating that silencing of either HDAC1 or miR-124-5p up-regulated NPY to improve memory and learning abilities of depressed rats.

To begin with, this study discovered HDAC1 expression in hippocampal tissues with the findings suggesting the elevation in the HDAC1 expression. Subsequently, with the purpose to decipher the functional roles of HDAC1 in depressed rats, loss-of-function assays were performed and it was disclosed that knockdown of HDAC1 increased the body weight, improved learning and memory abilities, attenuated pathological damage, up-regulated neurotransmitter expression, and suppressed oxidative stress and inflammation in depressed rats. Currently, a study has implied an increment in the expression of HDAC1 in depressive-like and anxiety-like phenotypes resulted by stress-offspring [21]. Moreover, the expression of HDAC1 is documented to up-regulate in penumbra in photothrombotic stroke [22]. Besides that, the incremental HDAC1 mRNA expression is found in granule and pyramidal cells in temporal lobe epilepsy [23]. As to the functional role of HDAC1, it has been reported that virus-mediated overexpression of neuronal HDAC1 in the hippocampus of mice imposes influences on loss of contextual fear memory in particular [24]. Mechanically, HDAC inhibitors reverse cognitive deficits found in neurodegenerative diseases and age-related memory loss [25]. Actually, it is accepted that the HDAC1 suppression by tianeptinaline has advanced neuroplasticity and reinforced memory [26]. As mentioned in a prior study, it is concluded that repression of HDAC1 inhibits the pathogenic processes that lead to motor neuron degeneration in mitochondrial diseases [27]. Experimentally, the silencing of HDAC1 by 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type is partially involved in the prevention of neuronal cell death in Parkinson's disease models [28]. Further supported by those researches, the protective effects of silenced HDAC1 have been witnessed in brain diseases, including but not limited to depression.

Then, our study discovered a targeting relationship between HDAC1 and miR-124-5p, which was supported by a prior study which suggests miR-124 transcription is in the charge of EVI1, acting by connection with the deacetylase HDAC1 [29]. miR-124-5p was the overexpressed gene in depressed rats and knockdown of miR-124-5p had the similar functions of silenced HDAC1 in depressed rats. In fact, there is a study indicating that the expression of miR-124 in the hippocampus is up-regulated from 5 to 6 weeks in depression-like behavior phenotypes [7]. Another study has identified the increase in the miR-124 expression in female with cocaine use disorder [30]. Also, it is previously described that miR-124-3p is highly expressed in stressed rodents in major depressive disorder [31]. Regarding to the effects, knockdown of miR-124 in the prefrontal cortex is reported to attenuate depression-like behavior of mice [9]. Besides that, miR-124 knockdown is believed to serve as an antidepressant agent of chronic corticosterone-induced gypenosides in mice [32]. Drawn from a prior study, knockdown of miR-124 can result in improved behavioral susceptibility to a milder stress paradigm [33]. It is reported that suppression of miR-124 by lentivirus transfection in the hippocampus can protect ketamine-induced neurodegeneration in vivo and in vitro [34]. Anyway, miR-124-5p suppression is an active actor to attenuate depression.

Furthermore, NPY expression was verified to be regulated by HDAC1 and miR-124-5p. The deteriorated deficits associated with HDAC2 in histone acetylation may be related to the decreased expression of NPY and can used to control anxiety-like and drinking behaviors [14]. NPY was down-regulated in depressed rats and up-regulation of NPY promoted learning and memory ability recovery in depressed rats. In the development of depressive-like behaviors, the rat models are manifested with reduced NPY expression [17]. Academically, the expression of NPY is evidenced to decline in mice with depression [35]. Consistently, the above-mentioned study findings are as same as the previous literature to some extent.

The novel findings of study suggested that inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities and increased body weight of depressed rats. In addition, knockdown of miR-124-5p or inhibition of HDAC1 suppressed oxidative stress and inflammation and promoted neurotransmitter expression of depressed rats. Moreover, HDAC1 mediated miR-124-5p to regulate NPY. In the rescue experiments, knockdown of NPY abolished the protective effects of inhibited miR-124-5p on depressed rats.

Conclusion

In summary, this study highlighted the effect of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression with the major findings suggesting inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities, increased body weight, suppressed oxidative stress and inflammation, as well as promoted neurotransmitter expression in depressed rats. HDAC1/miR-124-5p/NPY axis may provide a reference to treat neurological disorder, which may also update the existed knowledge of depression. However, further studies are still required for thorough comprehension of the complex mechanism of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression.

Disponibilidad de datos y materiales

No aplica.

Abreviaturas

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

Histone deacetylase 1

NPY:

Neuropeptide Y

CUMS:

Chronic unpredictable mild stress

SD:

Sprague–Dawley

SPF:

Specific pathogen-free

NC:

Negative control

OFT:

Open field test

SPT:

Sucrose preference test

SPP:

Sucrose preference percentage

MWM:

Morris water maze test

SOD:

Superoxide dismutase

MDA:

Malondialchehyche

GSH:

Glutatión

IL-β:

Interleukin-β

TNF-α:

Tumor necrosis factor-α

NO:

Nitric oxide

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

HE:

Hematoxylin–eosin

BCA:

Bicinchoninic acid

NE:

Norepinephrine

5-HT:

Serotonin

DA:

Dopamina

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

cDNA:

Complementary DNA

SDS:

Dodecil sulfato de sodio

ChIP:

Chromatin immunoprecipitation

UTR:

Untranslated region

MUT:

Mutant type

WT:

Wild type

ANOVA:

One-way analysis of variance

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