Agentes teranósticos basados en nanoclústeres de magnetita para MRI ponderado en T2 y liberación de doxorrubicina sensible al pH

Resumen

Las nanoestructuras multifuncionales que combinan fármacos anticancerígenos con nanocristales inorgánicos emergen como plataformas poderosas para diagnóstico y terapia tumoral. En este estudio, fabricamos nanoclústeres (NC) de magnetita (Fe₃O₄) combinando microemulsión aceite-en-agua y ensamblaje capa-por-capa (LBL). Los NC Fe₃O₄ se ensamblaron primero a partir de nanopartículas (NP) Fe₃O₄ recubiertas con ácido oleico. La adsorción secuencial de polialilamina hidrocloruro (PAH), poli(sodio 4-estirensulfonato) (PSS) y clorhidrato de doxorrubicina (DOX) produjo nanoestructuras híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX. Estos portadores exhiben liberación DOX sensible al pH, citotoxicidad mejorada contra células carcinoma pulmonar A549, y contraste superior MRI ponderado T₂ (r₂ = 651 mM⁻¹ s⁻¹). La emisión fluorescente DOX (λ_ex = 490 nm) facilita imagen celular. Nuestro trabajo establece plataforma teranóstica robusta basada en Fe₃O₄ que integra MRI, imagen fluorescente y administración controlada fármacos.

Introducción

Avances recientes en sistemas multifuncionales administración fármacos han permitido imagen y terapia simultáneas, particularmente mediante diseños responsivos a estímulos que explotan señales microambientales tumorales como acidez (pH ≈ 6.5–6.8). Nanopartículas magnetita (Fe₃O₄) son especialmente atractivas para aplicaciones biomédicas debido a superparamagnetismo, biocompatibilidad y baja citotoxicidad. Sin embargo, NP Fe₃O₄ individuales a menudo sufren baja responsividad magnética y carga fármaco limitada. Ensamblaje NP Fe₃O₄ en nanoclústeres (NC) amplifica efectos magnéticos colectivos, mejorando relajividad T₂ y permitiendo mayores cargas fármaco combinadas con multicapas polielectrolíticas. A pesar de estas ventajas, pocos estudios reportan NC Fe₃O₄ funcionalizados con PAH/PSS para liberación fármaco gatillada por pH.

Aquí reportamos ruta fabricación escalable para nanoestructuras híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX, combinando autoensamblaje microemulsión y adsorción electrostática LBL. Los portadores resultantes entregan DOX con liberación controlada pH-dependiente, demuestran fuerte contraste MRI T₂ y matan eficientemente células A549 in vitro.

Materiales y Métodos

Materiales

FeCl₃·6H₂O (99.99%), FeCl₂·4H₂O (99.99%), ácido oleico (OA, 90%), 1-octadecen (ODE, 90%), oleato sódico (NaOA), etanol, hexano, ciclohexano, isopropanol, dodecilbencenosulfonato sódico (SDBS), fluoruro amonio (NH₄F), NaOH, DMSO, amoníaco comprados Alfa Aesar y Sinopharm. PAH (PM 15 kDa), PSS (PM 70 kDa), clorhidrato doxorrubicina (DOX, >98%) de Sigma-Aldrich y Shanghai Sangon Biotech. Medio APMI 1640 y suero fetal bovino (FBS) de Hyclone. Todos reactivos usados sin purificación adicional.

Preparación oleato férrico

FeCl₃·6H₂O (2.59 g), NaOA (14.6 g), etanol (32 mL), H₂O (24 mL), hexano (56 mL) mezclados en matraz 150 mL y reflujo 70 °C 4 h para formar solución transparente oleato férrico. Capa aceitosa separada, hexano removido evaporación rotatoria 70 °C, residuo almacenado vacío.

Síntesis NP Fe₃O₄

Oleato férrico (7.2 g), OA (1.28 mL), ODE (50 mL) calentados 300 °C 40 min bajo Ar; mezcla enfriada y oxidada aire >12 h. Nanocristales precipitados con isopropanol, lavados dos veces etanol-agua (1:1 v/v), dispersos 200 mL ciclohexano.

Preparación NC Fe₃O₄

200 µL NP Fe₃O₄ en ciclohexano añadidos a 4 mL SDBS acuoso (14 mg). Tratamiento ultrasónico (5 min × 4) formó emulsión sólido-en-aceite-en-agua. Agitación temperatura ambiente 6 h evaporó ciclohexano, permitiendo autoensamblaje en NC cuasi-esféricos. Producto lavado tres veces agua desionizada.

Preparación nanoestructuras híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX

NC Fe₃O₄ (3 mL) recubiertos primero PAH (10 g/L, 4 mM NaCl) adición gota a gota agitación 24 h; exceso PAH removido centrifugación. NC recubiertos PAH luego recubiertos PSS (10 g/L, 4 mM NaCl) condiciones idénticas, seguido centrifugación. DOX (5 mg/mL) añadido (60 µL) a solución Fe₃O₄ NC/PAH/PSS (3 mL) agitado 24 h oscuridad. Nanoestructuras híbridas finales Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX aisladas centrifugación.

Mediciones MRI

Nanoestructuras híbridas dispersas 1.2 mL agarosa (1% p/v) concentraciones Fe 0–0.065 mM. Imagen en sistema micro-MRI Bruker 11.7 T (TR = 300 ms, TE = 4.5 ms, matriz 128×128, corte 1.2 mm, FOV 2.0×2.0 cm, 2 promedios).

Captación celular e imagen MRI

Células A549 incubadas nanoestructuras híbridas (Fe = 0–13.5 µM) 2 h, lavadas, imagenadas MRI ponderado T₂.

Curva estándar DOX

Fluorescencia DOX (λ_ex = 490 nm) medida concentraciones 0–0.03 mg/mL. Regresión lineal dio Y = 447.44 + 69,745 X (R² = 0.9992).

Carga y liberación DOX

Eficiencia carga calculada diferencia masa inicial DOX (W₀) y masa sobrenadante (W_s) tras centrifugación. Liberación acumulada monitoreada PBS (pH 5.0 o 7.4) 37 °C usando bolsa diálisis, muestreo 100 µL cada 1–3 h.

Citotoxicidad in vitro

Células A549 sembradas placas 96 pozos (8×10³ células/pozo) tratadas DOX libre, Fe₃O₄ NC/PAH/PSS, o Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX (0.1–2.0 µM equivalentes DOX). Tras 24 h, MTT (5 mg/mL) añadido, incubado 4 h, absorbancia medida 490 nm.

Caracterización

Microscopía electrónica transmisión (TEM, 200 kV) evaluó morfología; dispersión luz dinámica (DLS) midió tamaño hidrodinámico y ζ-potencial; espectroscopía UV-vis determinó carga DOX; espectroscopía fluorescencia monitorizó liberación DOX; ICP-AES cuantificó contenido Fe.

Resultados y Discusión

Morfología y tamaño nanoestructuras

Imágenes TEM revelaron NC Fe₃O₄ son agregados cuasi-esféricos (~57 nm, DLS) formados por autoensamblaje NP primarias Fe₃O₄ 15 nm. Deposición capas (PAH, PSS, DOX) confirmada por cambios ζ-potencial: −19.7 mV (NC), +32 mV (NC/PAH), −34 mV (NC/PAH/PSS), +1.9 mV (NC/PAH/PSS/DOX). Nanoestructuras híbridas finales exhibieron tamaño monodisperso ~84 nm (DLS).

Contraste MRI T₂ mejorado

Relajividad transversal (r₂) 651.38 mM⁻¹s⁻¹, superando muchos agentes comerciales. Relación lineal 1/T₂ vs concentración Fe confirmó eficiente contraste T₂.

Carga DOX y liberación sensible pH

Espectros UV-vis y fluorescencia confirmaron adsorción DOX. Eficiencia carga alcanzó 24.4%. En PBS (pH 7.4) solo ~20% DOX liberado tras 30 h, mientras pH 5.0 ~80% liberado dentro 15 h, demostrando fuerte responsividad pH impulsada por protonación DOX y unión electrostática reducida.

Captación celular y citotoxicidad

Microscopía confocal mostró internalización dependiente tiempo híbridos cargados DOX, fuerte fluorescencia roja tras 24 h. Ensayos MTT revelaron citotoxicidad despreciable Fe₃O₄ NC/PAH/PSS solo (viabilidad >85% a 2 µM). DOX libre e híbridos cargados DOX exhibieron muerte dosis-dependiente células A549 (IC₅₀ ≈ 1–2 µM). Citotoxicidad mejorada híbridos atribuida a liberación sostenida DOX gatillada pH endosomal.

MRI celular

Híbridos Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX internalizados células A549 produjeron reducción significativa señal T₂, confirmando utilidad como agentes contraste MRI celular.

Conclusión

Hemos diseñado nanoestructuras híbridas Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX combinando alto contraste MRI T₂, liberación DOX gatillada pH y potente actividad antitumoral in vitro. Su diseño modular permite funcionalización adicional (ej. ligandos blanco) para aplicaciones in vivo, posicionándolas como plataformas teranósticas versátiles para imagen y terapia cáncer.