Modulación de mecánica celular inducida por nanopartículas: Análisis comparativo de efectos SiO₂ y TiO₂ en células Caco-2 y A549

Resumen

La creciente incorporación de nanopartículas (NPs) en productos de consumo ha superado evaluaciones de seguridad comprehensivas. Este estudio investiga cómo los atributos fisicoquímicos de NPs SiO₂ y TiO₂ influyen en captación celular, tráfico intracelular y perturbaciones mecánicas en dos modelos in-vitro clínicamente relevantes —Caco-2 (epitelio intestinal) y A549 (epitelio alveolar). Cuantificamos internalización NP via ICP-AES, evaluamos citotoxicidad con ensayos WST-8 y LDH, medimos estrés oxidativo (ROS, SOD, MDA) y evaluamos remodelación citoesqueleto actina mediante microscopía confocal. Microscopía de fuerza atómica (AFM) determinó cambios en módulo Young en compartimentos nuclear y citoplasmático. NPs TiO₂ mostraron mayor captación celular, generación pronunciada ROS y significativa reorganización actina, llevando a mayor rigidez en células A549 y menor rigidez en Caco-2. Estas alteraciones biomecánicas correlacionan con citotoxicidad inducida por NPs y destacan la importancia de integrar endpoints mecánicos en protocolos nanotoxicología.

Introducción

Nanopartículas ingenieradas (ENPs) son pervasivas en farmacéuticos, cosméticos, aditivos alimentarios y formulaciones industriales, generando preocupaciones sobre vías exposición humana y ambiental (ingestión, inhalación, dérmica). La toxicidad de ENPs es fuertemente modulada por su tamaño, forma, química superficial y estado cristalino, sin embargo métodos evaluación estandarizados permanecen limitados, contribuyendo a literatura conflictiva [1-5]. NPs óxido metálico, particularmente SiO₂ amorfo y TiO₂ cristalino, son ampliamente empleados debido a su estabilidad óptica y química, sin embargo evidencia sugiere pueden disrumpir funciones celulares, incluyendo liberación citocinas, integridad microvellosidades intestinales, producción ROS, inhibición síntesis ATP y genotoxicidad [15-26]. Sin embargo, su impacto en mecánica celular —determinante clave de migración, diferenciación y homeostasis tisular— ha recibido atención limitada [27, 28]. Este estudio cierra esa brecha evaluando sistemáticamente efectos biomecánicos de NPs SiO₂ y TiO₂ de 20 nm en células Caco-2 y A549.

Métodos

Síntesis de Nanopartículas SiO₂ y TiO₂

NPs SiO₂ se prepararon via microemulsión W/O usando TEOS, Triton X-100, ciclohexano y NH₄OH, produciendo partículas esféricas 20 ± 2 nm. NPs TiO₂ se sintetizaron por ruta sol-gel modificada desde TTIP bajo condiciones ácidas, calcinadas a 430 °C para producir fase mixta anatasa-rutilo con diámetro promedio 25 ± 5 nm. Ambos tipos NPs caracterizados por TEM, DLS, ζ-potencial y XRD para confirmar morfología, tamaño hidrodinámico, carga superficial y estructura cristalina (Fig. 1).

Cultivo Celular y Exposición

Células Caco-2 y A549 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10-20 % FBS, 100 U/mL penicilina y 100 µg/mL estreptomicina. Para estudios captación, células se expusieron a 15 o 45 µg/mL NPs por 48-96 h. Post-exposición, células se lavaron, tripsinizaron, contaron y lisaron en HCl/HNO₃ para análisis ICP-AES de contenido Si y Ti.

Citotoxicidad, Integridad Membrana y Estrés Oxidativo

Viabilidad se evaluó con ensayo WST-8; liberación LDH cuantificó daño membrana. Producción ROS se midió por fluorescencia DCF-DA, y respuesta antioxidante evaluada via actividad SOD y niveles MDA (peroxidación lipídica). Todos los ensayos se realizaron triplicado con controles apropiados.

Citoesqueleto Actina y Morfometría

Células se fijaron, permeabilizaron y tiñeron con Phalloidin-ATTO 488 y DAPI. Microscopía confocal láser (CLSM) capturó distribución actina cortical. ImageJ cuantificó densidad integrada y coherencia (plugin OrientationJ) para evaluar cantidad y alineación actina. Ratios área nuclear-citoplasmática (N/C) se calcularon para detectar cambios morfológicos.

Microscopía Fuerza Atómica

AFM en modo fuerza-volumen midió módulo Young en regiones nuclear y citoplasmática de células tratadas con 45 µg/mL NPs por 72 h. Curvas fuerza-distancia se ajustaron a modelo Sneddon modificado para extraer módulos elásticos (E). Datos de 20 células por condición se analizaron estadísticamente.

Análisis Estadístico

Resultados se expresan como media ± DE. Test t Student comparó grupos tratados versus control, con umbrales significancia p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,005 (***).

Resultados

Caracterización Nanopartículas

Imágenes TEM confirman NPs SiO₂ monodispersas esféricas (~20 nm) y NPs TiO₂ (~25 nm) con fases mixtas anatasa-rutilo (Fig. 1). DLS muestra diámetros hidrodinámicos 21 ± 7 nm (SiO₂) y 27 ± 12 nm (TiO₂) en agua; tamaños aumentan a 29 ± 9 nm y 41 ± 14 nm, respectivamente, en DMEM con 20 % FBS tras 96 h, indicando formación corona proteica. ζ-potenciales son -45 ± 3 mV (SiO₂) y -50 ± 3 mV (TiO₂) en agua, volviéndose más negativos en medios cultivo.

Captación NP

ICP-AES reveló internalización dependiente dosis y tiempo. NPs TiO₂ acumularon más fácilmente, alcanzando 8,2 ± 0,4 µg por 3,6 × 10⁵ células en Caco-2 tras 72 h y 9,7 ± 0,03 µg tras 96 h. En A549, captación fue 5 ± 0,6 µg (72 h) y 7,1 ± 0,1 µg (96 h). NPs SiO₂ mostraron menor acumulación, particularmente en A549 (2,6 ± 0,05 µg a 72 h). En general, NPs TiO₂ exhiben mayor captación celular en ambas líneas celulares.

Viabilidad Celular, Daño Membrana y ROS

Ensayo WST-8 mostró reducción modesta viabilidad en ambas líneas a 45 µg/mL. Viabilidad Caco-2 cayó ~40 % tras 72 h y ~50 % tras 96 h exposición TiO₂; A549 exhibió reducción ~30 % solo tras 96 h. Liberación LDH reflejó estas tendencias, pico ~160 % control tras 96 h en Caco-2. Generación ROS aumentó dosis-dependientemente, con NPs TiO₂ induciendo hasta 165 % fluorescencia DCF-DA en Caco-2 (Fig. 4).

Respuesta Antioxidante y Peroxidación Lipídica

Actividad SOD declinó manera dosis-y-tiempo-dependiente. En Caco-2, SOD disminuyó de 4,1 ± 0,2 U/mL (control) a 1,0 ± 0,3 U/mL tras 96 h 45 µg/mL TiO₂. Exposición SiO₂ redujo SOD a 1,4 ± 0,1 U/mL. Niveles MDA subieron correspondientemente en ambas líneas, indicando peroxidación lipídica增强.

Remodelación Citoesqueleto Actina

Imágenes confocal revelaron uniones estrechas disrumpidas y morfología elongada en Caco-2, y contactos célula-célula disminuidos en A549 tras tratamiento NPs. Análisis cuantitativo mostró no cambio significativo en densidad integrada (cantidad actina) pero disminución pronunciada en coherencia: coherencia Caco-2 cayó de 0,26 ± 0,03 (control) a 0,09 ± 0,02 (TiO₂). Coherencia A549 disminuyó de 0,40 ± 0,03 a 0,16 ± 0,04. Ratios N/C aumentaron en Caco-2 (0,40 → 0,62) y disminuyeron en A549 (0,55 → 0,23), reflejando respuestas morfológicas divergentes.

Propiedades Mecánicas (Módulo Young)

Medidas AFM indicaron cambios rigidez contrastantes. En Caco-2, módulo Young disminuyó de 105 ± 25 kPa (núcleo) a 27 ± 4 kPa tras exposición TiO₂; módulo citoplasmático cayó de 47 ± 21 kPa a 18 ± 4 kPa. Inversamente, rigidez A549 aumentó dramáticamente: módulo nuclear subió de 129 ± 24 kPa a 372 ± 60 kPa, y citoplasmático de 147 ± 26 kPa a 549 ± 40 kPa bajo tratamiento TiO₂.

Discusión

Nuestros hallazgos demuestran que NPs TiO₂, debido a su estructura cristalina y reactividad superficial, provocan respuestas celulares más fuertes que NPs SiO₂ amorfo. La captación mejorada, generación ROS y reorganización actina correlacionan con alteraciones significativas en elasticidad celular —ablandamiento células Caco-2 y endurecimiento células A549— sugiriendo vías mecanísticas distintas en contextos epitelial versus alveolar. Tales cambios biomecánicos pueden influir migración celular, integridad barrera y potencialmente progresión tumoral. Integrar endpoints mecánicos con ensayos citotoxicidad convencionales ofrece evaluación nanotoxicologica más comprehensiva.

Conclusiones

NPs SiO₂ exhiben menor citotoxicidad comparado con NPs TiO₂. Exposición TiO₂ induce remodelación actina, ratios N/C alterados y respuestas mecánicas divergentes: rigidez aumentada en A549 y reducida en Caco-2. Estas perturbaciones biomecánicas subrayan importancia de evaluar dinámica citoesqueleto y mecánica celular en estudios nanotoxicología para predecir resultados patológicos potenciales.

Abreviaturas

A549

Células epiteliales basales alveolares adenocarcinoma humano

AFM

Microscopía fuerza atómica

ATP

Adenosín trifosfato

Caco-2

Adenocarcinoma colorrectal epitelial humano

CLSM

Microscopía confocal láser

DAPI

4',6'-Diamidino-2-fenilindol

DCF-DA

2',7'-Diclorofluoresceína diacetato

DLS

Dispersión luz dinámica

DMEM

Medio Dulbecco modificado Eagle

ENPs

Nanopartículas ingenieradas

FBS

Suero fetal bovino

HCl/HNO₃

Ácido clorhídrico/nítrico

ICP-AES

Espectroscopía emisión atómica plasma acoplado inductivamente

LDH

Lactato deshidrogenasa

MDA

Malondialdehído

NH₄OH

Hidróxido amonio

NPs

Nanopartículas

PBS

Salino fosfato amortiguado

ROIs

Regiones interés

ROS

Especies reactivas oxígeno

SiO₂ NPs

Nanopartículas dióxido silicio

SOD

Superóxido dismutasa

TBA

Ácido tiobarbitúrico

TEM

Microscopía electrónica transmisión

TEOS

Ortosilicato tetraetilo

TiO₂ NPs

Nanopartículas dióxido titanio

TTIP

Isopropóxido titanio (IV)

XRD

Difracción rayos X