Estudio de toxicidad de nanopartículas de perovskita en células epiteliales de las vías respiratorias

Resumen

La investigación sobre la toxicidad de las nanopartículas se ha desarrollado en los últimos años debido a su creciente prevalencia en materiales cotidianos comunes. Se ha informado que varias nanopartículas promueven e inducen la secreción de moco, lo que podría conducir a daños en las vías respiratorias y complicaciones respiratorias. La manganita de estroncio de lantano (LSM) es una nanopartícula ampliamente utilizada en celdas de combustible oxidadas por energía solar (SOFC) debido a su alta conductividad eléctrica y alta actividad electroquímica para O ₂ reacción de reducción, alta estabilidad térmica y compatibilidad de electrolitos SOFC y, lo más importante, su estabilidad microestructural y rendimiento a largo plazo. Se han realizado muy pocos estudios sobre la toxicidad del LMS, por lo que en este estudio se investigó su efecto sobre las células de las vías respiratorias. Después de tratar las células de la tráquea con concentraciones crecientes de LSM que van hasta 500 μg / ml, encontramos que tiene un efecto moderado sobre la viabilidad celular, la producción de ROS, el citocromo C y la expresión de caspasa 3. A pesar de su impacto mínimo en las características inductoras de apoptosis declaradas, LSM mostró un efecto inhibidor sobre la secreción de moco. Obtuvimos una tendencia decreciente en la secreción de moco con una mayor concentración del tratamiento LSM. En general, el avance de LSM en las SOFC requirió un estudio de toxicidad y, aunque no muestra una toxicidad significativa para las células de la tráquea, LSM reduce la secreción de moco y puede interferir potencialmente con la limpieza de las vías respiratorias.

Introducción

La manganita de estroncio de lantano (LSM) es una nanopartícula equipada con una estructura cristalina a base de perovskita. Toma la forma general de "ABO3", donde el lantano y el estroncio están en el sitio A y el manganeso en el B. Esto conduce a su fórmula general de La _{1 - x} Sr _x MnO ₃ , en el que x representa los niveles de dopaje de estroncio que dependen de la aplicación de la nanopartícula. LSM se puede utilizar en forma de polvo como cinta de fundición, pulverización de aire / térmico / plasma y para aplicaciones de pilas de combustible [1, 2, 3, 4].

En el reciente esfuerzo por reducir la contaminación y crear una economía basada en el hidrógeno, muchas investigaciones se han centrado en las pilas de combustible de óxido sólido (SOFC) [5, 6]. A su vez, las perovskitas LSM han atraído la atención de la investigación debido a su importante papel en las SOFC como uno de sus materiales de electrodos más importantes [4, 7]. Las nanopartículas de LSM son partículas metálicas esféricas de gran superficie que aparecen como un polvo cristalino marrón o negro. Aunque se han realizado numerosos estudios sobre las propiedades mecánicas y eléctricas de LSM [1, 3, 8, 9], muy poca investigación se ha centrado en sus efectos biológicos [10, 11, 12]. Numerosas nanopartículas han ilustrado tendencias para promover la secreción y acumulación de moco, por lo que están relacionadas con enfermedades respiratorias [13, 14]. La investigación sobre nanopartículas de LSM muestra ideas prometedoras para aplicaciones biomédicas [15,16,17]. Recientemente, la investigación sobre LSM ha demostrado su potencial para la terapia contra el cáncer [12, 18, 19]. Con los procedimientos de síntesis correctos y las modificaciones de la superficie, LSM tiene la capacidad de ser un agente de contraste e hipertermia de resonancia magnética, así como un portador de fármacos [20,21,22]. Sin embargo, se debe evaluar la posibilidad de toxicidad antes de otras aplicaciones médicas. Solo hay estudios limitados sobre el efecto de toxicidad de la perovskita [10, 23], y hasta ahora no se ha informado ningún efecto de toxicidad significativo.

En este estudio, investigamos la toxicidad de las nanopartículas de LSM, mientras estábamos expuestos a células epiteliales traqueales primarias para determinar el rango de concentración de toxicidad. Luego, analizamos la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el daño de las mitocondrias junto con la respuesta de secreción de moco con microscopía fluorescente [24]. El nivel de progresión de la apoptosis con o sin nanopartículas de LSM se examinó con ensayos de citocromo C y caspasa 3 [25].

Resultados y discusiones

Ensayo de viabilidad celular y caracterización de NP

La toxicidad de las nanopartículas depende de sus propiedades físicas, como la geometría, la distribución del tamaño y el área de la superficie. Antes de los experimentos de toxicidad, estas características se analizaron mediante SEM. Las nanopartículas de LSM ilustraron una rugosidad superficial significativa y se distribuyeron en agregados de varios tamaños, aproximadamente de 35 nm a 200 nm de diámetro (Fig. 1).

Imagen SEM de las características físicas del LSM. El tamaño de partícula individual fue de alrededor de 35 nm de diámetro y la agregación del tamaño de LSM varió de 200 nm a unos pocos μm

Hemos realizado numerosos experimentos de toxicidad en las células de las vías respiratorias de la tráquea con una variedad de NP en nuestro estudio anterior [26, 27], por lo tanto, esta línea celular fue elegida para este estudio biológico. Con el fin de evaluar la toxicidad general de LSM en las células de la tráquea, se realizó el ensayo colorimétrico de viabilidad celular CCK8 [25, 27]. Como se ve en la Fig. 2; ensayo de viabilidad celular, hubo un cambio dramático en la población que se produjo desde concentraciones de 50 a 100 μg / ml de LSM. Sin embargo, a concentraciones de LSM superiores a 100 μg / ml, la población se mantuvo en un rango relativamente estable, sin mostrar cambios significativos.

Viabilidad de las células de la tráquea después de aumentar la concentración de LSM, que se muestra aquí como Log [ng / ml]. Se utilizó el ensayo colométrico de viabilidad celular CCK8 para medir y se calculó su promedio por incremento de concentración. ( n > 6)

Producción de ROS y liberación de mucina

La producción de ROS provoca la apoptosis, por lo que contribuye a la citotoxicidad de las nanopartículas. Según la Fig. 3; La producción de ROS, el aumento de la concentración de LSM no afecta en gran medida la producción de ROS. La concentración de LSM de 250 μg / ml fue la que más difirió del control, pero su desviación no fue significativa, lo que indica que el LSM no tiene un efecto notable en la producción de ROS.

Producción de ROS de las células de la tráquea después de aumentar las concentraciones de LSM. Las proporciones de producción de ROS por cada tratamiento de concentración de LSM se calcularon comparándolas con el grupo de control. ( n > 100)

De la Fig. 4; mucus bata, después de un tratamiento de 15 minutos, no hubo un efecto significativo sobre la viabilidad celular y, a medida que aumentaron las concentraciones de LSM, disminuyó la secreción de mucina. La liberación de mucina se redujo hasta un 40% cuando las células se trataron con 500 μg / ml de LSM, y podría reducirse potencialmente aún más con concentraciones aún más altas de LSM. Esta reducción sugiere que LSM tiene un efecto inhibidor sobre la liberación de moco.

La secreción de mucina se produce después de tratamientos de 15 minutos de concentraciones crecientes de LSM. Las proporciones se calcularon para cada concentración de LSM comparándola con el grupo de control. La evaluación de las secreciones de mucina de la superficie celular se realizó mediante ELLA (ensayo de lectina unida a enzima). (*: n > 6, p <0.05)

Procesos de apoptosis y daño mitocondrial

La etapa inicial de la apoptosis está típicamente representada por daño mitocondrial. Para analizar este fenómeno, se utilizó el colorante JC-1 como indicador del potencial de la membrana mitocondrial. La relación de intensidad inducida por el colorante JC-1 se correlaciona con la pérdida de la integridad mitocondrial y, de acuerdo con la figura 5, a medida que aumentaron las concentraciones de LSM, el daño mitocondrial aumentó significativamente después de 100 μg / ml de tratamiento con LSM. Aunque los resultados muestran que el daño de las mitocondrias es significativo después de 100 μg / ml de tratamiento con LSM, la caspasa3 y el citocromo C muestran ligeras disminuciones, como se detalla a continuación. Este resultado sugiere que LSM podría causar daño a las mitocondrias, pero las células aún tienen la capacidad de permanecer en un nivel bajo en la progresión de la apoptosis y reducir la expresión del marcador de apoptosis.

Resultados de la intensidad fluorescente del colorante indicador JC-1 en cuatro condiciones diferentes de tratamiento en la célula de la tráquea para indicar la integridad mitocondrial. (*, **, ***: n > 100, p <0.05)

La apoptosis también se puede medir mediante la expresión del citocromo C y la caspasa 3. Como se muestra en la Fig. 6a; Como resultado de la apoptosis en el citocromo C, hubo una disminución moderada en las tasas de apoptosis entre las diferentes concentraciones de LSM y el grupo de control. Esta misma tendencia se puede ver en la Fig. 6b; la apoptosis resulta en la caspasa 3, lo que indica una toxicidad mínima debida a LSM. En general, los resultados de daño mitocondrial y apoptosis en las células de la tráquea de las vías respiratorias debido a LSM fueron muy bajos, lo que sugiere que LSM no tiene un efecto tóxico significativo sobre las células epiteliales de la tráquea.

Resultados de apoptosis medidos a través de a expresión del citocromo C, b Expresión de caspasa 3. Las proporciones se obtuvieron por tratamiento de concentración de LSM en comparación con el grupo de control (HBSS). (*: n > 100, P <0.05)

Conclusiones

Los estudios recientes de nanotoxicidad han atraído mucha atención sobre los efectos tóxicos de los NP debido a su amplio uso en productos industriales y comerciales. La principal preocupación de la nanotoxicidad se debe a la generación de ROS. Por ejemplo, TiO ₂ Los NP se consideran un tipo de material carcinogénico debido a la gran cantidad de ROS generados que podrían provocar la muerte celular y mutaciones [28]. Existen diferentes tipos de materiales y compuestos clasificados como perovskita que se han reportado en los últimos años en una variedad de aplicaciones diferentes. Este es el primer estudio para determinar la toxicidad del LSM en las células epiteliales de las vías respiratorias, que son una de las vías principales para que las células capten NP. Este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de LSM en las células de la tráquea en un esfuerzo por evaluar su toxicidad. Los resultados mostraron que LSM no tiene ningún efecto significativo sobre la progresión de la apoptosis medida por las expresiones del citocromo C y caspasa 3, la integridad de las mitocondrias medida por la fluorescencia de JC-1, la supervivencia celular y la producción de ROS. Sin embargo, el tratamiento mostró un efecto supresor sobre la secreción de moco, disminuyendo la producción de moco a medida que aumentaban las concentraciones de LSM. En última instancia, a través de los resultados obtenidos de este estudio, se descubrió que LSM no es tóxico para las células epiteliales de las vías respiratorias, lo que no provoca cambios significativos en las etapas de apoptosis, además de reducir la secreción de moco que puede poner en peligro la viabilidad celular. Esto sugiere el potencial de LSM para interferir con la eliminación del moco de las vías respiratorias. En nuestro estudio, demostramos el potencial de toxicidad de los NP LSM y los resultados muestran que el riesgo potencial del efecto tóxico es relativamente menor que otros NP que se habían utilizado para aplicaciones industriales y comerciales. Sin embargo, se deben realizar más investigaciones para determinar si LSM se puede incorporar de manera segura como ingrediente activo en productos comerciales de almacenamiento de energía y energía solar.

Materiales y métodos

Cultivo de células primarias de tráquea

Las células epiteliales primarias de la tráquea se aislaron del epitelio bronquial bovino normal siguiendo protocolos previamente publicados [26]. Las células se cultivaron y se mantuvieron en medio sin suero (SFM) suplementado con factor de crecimiento epidérmico recombinante humano precalificado 1-53 (EGF 1-53) y extracto de pituitaria bovina (BPE) (Thermo Fisher). Las células primarias de la tráquea se cultivaron en placas Falcon de 15 cm recubiertas previamente con colágeno () y se incubaron en una incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO ₂ . Los recuentos de células se realizaron utilizando exclusión de azul tripán (Sigma) y un hemocitómetro Bright-Line. Las células pasaron cuando la confluencia alcanzó el 80%.

Preparación de la celda

Las células se sembraron a 5 × 10 ⁴ células por pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta de colágeno (75% de confluencia) para ensayos de viabilidad celular, 5 × 10 ⁵ células por pocillo en una placa de 4 pocillos recubierta de colágeno (75% de confluencia) para Ca ²⁺ señalización, ROS y análisis de mitocondrias. Después de la siembra, las células se incubaron durante 24 h en SFM suplementado con EGF 1-53 recombinante humano precalificado y BPE (Thermo Fisher). Después de 24 h de incubación, el medio se retiró de las células y el cultivo se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato. El lavado de PBS se reemplazó con nanopartículas sonicadas en Ca ²⁺ que contiene Hanks o Ca ^{2 +} -Hanks gratis.

Ensayo de viabilidad celular

La determinación fotocolorimétrica de la citotoxicidad se evaluó utilizando el colorante CCK-8 (Dojindo Laboratories, Tokio, Japón) [27, 25]. CCK-8, al no ser radiactivo, ofrece una determinación colorimétrica del porcentaje de células viables sometidas a concentraciones variables de NP. Este kit de ensayo mide la actividad metabólica de las deshidrogenasas dentro de las células viables para convertir la sal de tetrazolio WST-8 en formazán soluble en agua. Se preparó agregando CCK-8 en HBSS en una dilución 1:10. Las células se enjuagaron con HBSS y se cargaron 100 µl del tinte en cada pocillo. Luego, las células se incubaron a 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora durante 6 h. La absorbancia se midió usando un lector de placas Thermo Multiscan EX (lector de placas Thermo Multiskan EX, VWR, CA, EE. UU.) A la densidad óptica de 450 nm (referencia de 650 nm). Se calculó un promedio a partir de tres conjuntos de datos separados para cada concentración, incluido el control sin tratar, de tres experimentos independientes y se tabuló como un porcentaje del control sin tratar.

La viabilidad celular se calculó mediante \ (\ frac {OD_ {450 \ mathrm {tratamiento}} - {OD} _ {650 \ mathrm {tratamiento}}} {O {D} _ {450 \ mathrm {control}} - O {D} _ {650 \ mathrm {control}}} \ ast 100 \% \).

Nanopartícula de lantano estroncio manganita

Lantano estroncio manganita (La _0.15 Sr _0,85 MnO ₃ ) (LSM) nanopartículas (35 nm, 99,5%) (Nanotructured &Amorphous Materials Inc.) en este estudio. Todas las muestras de NP se sometieron a ultrasonidos antes de su uso. Las concentraciones utilizadas fueron 500 μg / ml, 250 μg / ml, 100 μg / ml y 50 μg / ml. El rango de concentraciones utilizado se decidió siguiendo las concentraciones de TiO ₂ NP encontrados en informes anteriores (Dowding et al. 2014; Dowding et al. 2012; Gurr et al. 2005; Hirst et al. 2009; Niu et al. 2011). Los NP de LSM se reconstituyeron con la solución de Hanks (Invitrogen, CA, EE. UU.) Antes de probarlos individualmente y sonicados durante aproximadamente 5 minutos inmediatamente antes de su uso.

Microscopio electrónico de barrido

Los NP de LSM se prepararon en 5 µg / ml y se vertieron gota a gota sobre una oblea de silicio limpia y se secaron al aire para eliminar el agua residual. El tamaño de las NP se confirmó de forma independiente mediante un microscopio electrónico de barrido (Gemini SEM, Zeiss).

Producción de especies reactivas de oxígeno intracelular

La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se evaluó mediante microscopía de fluorescencia utilizando la oxidación del colorante CM-H2DCFDA (Invitrogen, CA, EE. UU.) [24]. Las células (1 x 105 células / pocillo) se cultivaron durante 24 h antes de enjuagarlas con solución de PBS. Las muestras se tiñeron aplicando un tampón de carga que contenía tinte CM-H2DCFDA reconstituido 2 µM en medio durante 30 min. Las muestras teñidas se lavaron con PBS tres veces y se dejaron a un lado durante 5 minutos de tiempo de recuperación para que las esterasas celulares hidrolizaran los grupos AM o acetato y hagan que el tinte responda a la oxidación. A continuación, se incubó el tampón de Hanks, que contenía NP LSM en concentraciones que oscilaban entre 0 y 500 μg / ml en 50 μg / ml, con las células durante 15 min a 37 ° C seguido de lavado con PBS. Las imágenes fluorescentes de ROS generadas en las células se capturaron y analizaron calculando la proporción de aumento en la intensidad fluorescente entre diferentes tratamientos y grupos de control.

Medición del daño de las mitocondrias

El potencial transmembrana interno mitocondrial se evaluó utilizando yoduro policromático de 5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 ′, 3,3′-tetraetilbencimidoazolil-carbocianio (JC-1 Sigma) [25]. JC-1 es un catión fluorescente lipofílico que se puede incorporar a la membrana mitocondrial, donde depende de los agregados del estado de potencial de membrana. La agregación cambia las propiedades de fluorescencia de JC-1, pasando de la fluorescencia verde a la roja. Las membranas mitocondriales intactas teñidas con JC-1 exhiben una fluorescencia mitocondrial roja pronunciada que es detectable por microscopía de fluorescencia. Una ruptura del potencial de la membrana mitocondrial da como resultado una disminución posterior de la fluorescencia verde y un aumento de la fluorescencia roja. Antes de la estimulación de NP, las células se lavaron con PBS dos veces y se incubaron con reactivo de tinción JC-1 (1:1000) en medio a 37 ° C durante 30 min, seguido de lavado con PBS y tratamiento celular. El potencial de membrana mitocondrial se detectó mediante microscopía de fluorescencia a intervalos de tiempo de 10 minutos.

Medición de [Ca ²⁺ ] _c

Todos los experimentos se realizaron en condiciones de oscuridad. Las células se cargaron con un colorante Rhod-2 AM (1 μM) ( K _d =570 nM, λ _Ex =552 nm y λ _Em =581 nm) (Invitrogen, CA, EE. UU.) Durante 45 min. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS antes de incubarlas con tampón de Hanks y se trataron con la concentración apropiada de NP. Todo Ca ²⁺ Los experimentos de señalización se llevaron a cabo en un estado termorregulado a 37 ° C montado en un microscopio Nikon (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokio, Japón) [24, 25, 27] (Chen et al. 2011).

Secreción de mucina y ELLA

Las células se sembraron a 1 × 10 ⁶ células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h. Las células primarias de la tráquea se lavaron luego con PBS y se estimularon durante 15 min con las correspondientes concentraciones de NP de LSM (500 µg / ml, 250 µg / ml y 100 µg / ml) preparadas en PBS. Se recogió el sobrenadante que contenía mucina secretada y se centrifugó brevemente a 8000 rpm para eliminar las NP residuales. A continuación, se incubó el sobrenadante en una placa de 96 pocillos (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, EE. UU.) Durante la noche a 4ºC. Posteriormente, la placa de 96 pocillos se lavó con PBST (PBS + Tween-20 al 0,05%) y luego se bloqueó con BSA al 1%. La placa de 96 pocillos se lavó nuevamente con PBST y se incubó con lectina (aglutinina de germen de trigo, WGA) (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.), Conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP; 5 mg / ml) (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.), A 37 ° C durante 1 h. El sustrato, 3,3 ′, 5,5′-tetrametilbencidina (TMB; Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.), Se añadió a cada pocillo a temperatura ambiente, seguido de H ₂ SO ₄ (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) Para terminar la reacción. La densidad óptica se midió a 450 nm (Chen et al. 2011; Kemp et al. 2004).

Preparación del ensayo inmunoabsorbente (ELISA)

Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10 ⁶ densidad celular en una placa de 6 pocillos y se cultivó durante 24 h. A continuación, se aclararon las células de la tráquea con PBS. Las células se estimularon durante 2 h con las concentraciones apropiadas de NP de LSM (0-500 μg / ml) preparadas en PBS. El lisado celular se preparó mediante el reactivo de lisado celular Peirce RIPA, y el lisado se recogió y se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Las muestras se centrifugaron a ~ 14.000 × g durante 15 minutos para sedimentar los restos celulares y NP. A continuación, se incubó el sobrenadante en una placa de 96 pocillos durante la noche a 4ºC. Posteriormente, la placa de 96 pocillos se lavó con PBST (PBS + Tween-20 al 0,05%) y luego se bloqueó con BSA al 1%. La placa de 96 pocillos se lavó nuevamente con PBST y se incubó con anti-caspasa 3 de conejo, anticuerpo de forma activa (Millipore, anticuerpo policlonal) y anti-citocromo C de ratón (Invitrogen, anticuerpo monoclonal) a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación, utilice un anticuerpo secundario (peroxidasa de rábano picante conjugada anti-conejo y anti-ratón, HRP, Millipore) y siga el mismo procedimiento que ELLA para medir la intensidad de absorbancia [25].

Análisis de imagen

El análisis de imágenes se realizó con un microscopio fluorescente invertido Nikon Eclipse TE2000-U. Cada foto se tomó con un aumento de × 10 y se analizó utilizando Simple PCI (Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, EE. UU.). Los datos mostrados para las concentraciones de calcio citosólico están representados por la fluorescencia de Rhod-2. Las imágenes se tomaron cada 0,5 sy se convirtieron automáticamente a escala de grises para su análisis. PCI simple proporcionó las intensidades de píxeles (valor medio de gris) de las áreas seleccionadas, cada una con una fluorescencia media por fotograma para 200 células durante 100 s (~ 200 fotogramas) inmediatamente después de la estimulación de nanopartículas. Los datos mostrados para la tinción por inmunofluorescencia son una representación de la expresión de proteínas después de 1 a 2 h de tratamientos con grafeno. Todos los experimentos se llevaron a cabo y se corroboraron de forma independiente al menos tres veces.

Análisis estadístico

Los datos se presentaron como media ± DE. Cada experimento se realizó de forma independiente al menos tres veces. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de prueba ANOVA de una vía con p valores <0.05 (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.).