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Nanopartículas biocompatibles como plataforma para mejorar la eficacia antitumoral de la combinación cisplatino-tetradrina

Resumen

La terapia combinada ha sido una estrategia estándar en el tratamiento clínico de tumores. Hemos demostrado que la combinación de tetradrina (Tet) y cisplatino (CDDP) presenta una marcada actividad anticancerosa sinérgica, pero los efectos secundarios inevitables limitan su concentración terapéutica. Teniendo en cuenta las diferentes propiedades fisicoquímicas y farmacocinéticas de los dos fármacos, los cargamos juntos en un nanovehículo mediante el método mejorado de doble emulsión. Las nanopartículas (NP) se prepararon a partir de la mezcla de poli (etilenglicol) -policaprolactona (PEG-PCL) y policarprolactona (HO-PCL), por lo que CDDP y Tet se pueden ubicar en las NP simultáneamente, lo que da como resultado un bajo efecto de interferencia y una alta estabilidad. . Las imágenes del microscopio de fluorescencia revelaron la captación celular de agentes hidrofílicos e hidrofóbicos liberados por las NP. Los estudios in vitro en diferentes líneas de células tumorales y tejido tumoral revelaron un aumento de las tasas de apoptosis e inhibición tumoral. En cuanto a los estudios in vivo, se observó una eficacia antitumoral superior y efectos secundarios reducidos en el grupo de NP. Además, 18 Las imágenes de FDG-PET / CT demostraron que las NP reducen las actividades metabólicas de los tumores de manera más prominente. Nuestros resultados sugieren que los NP copoliméricos en bloque de PEG-PCL podrían ser un portador prometedor para la quimioterapia combinada con una eficacia sólida y efectos secundarios menores.

Introducción

Con el desarrollo de la terapia integral del tumor, los compuestos de platino juegan un papel importante en el tratamiento de varios cánceres, entre los cuales el cisplatino (CDDP) se usa ampliamente en la clínica [1, 2]. Hoy en día, el CDDP sigue siendo significativo cuando se combina con inmunoterapia tumoral, mostrando un efecto favorable sobre tumores malignos como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) [3]. Sin embargo, estos agentes quimioterapéuticos siempre logran una actividad antitumoral a expensas de una toxicidad indeseable [4], por lo que se han explorado incesantemente agentes terapéuticos que pueden reducir la toxicidad y mejorar la eficacia de la quimioterapia [5, 6]. La tetrandrina (Tet) es un miembro del alcaloide bis-bencilisoquinolina [7], que muestra un efecto satisfactorio en la sensibilización a la quimioterapia. Nuestro trabajo anterior ha demostrado que la combinación de Tet y CDDP tiene una marcada actividad anticancerígena sinérgica al inhibir la expresión de genes asociados a agentes quimioterapéuticos, incluido el grupo 1 de complementación cruzada de reparación por escisión (ERCC1), timidilato sintasa (TS), β- tubulina III, etc. [8]. Sin embargo, la aplicación clínica de Tet adolece de su escasa solubilidad en agua y su baja biodisponibilidad oral [7]. Además, el CDDP hidrófilo se distribuye más fácilmente en la matriz extracelular (MEC), mientras que el Tet hidrófobo que penetra en las membranas lipídicas puede transportarse a través de las células, por lo que los dos fármacos no pueden funcionar juntos. Por lo tanto, es esencial encontrar una manera que pueda administrar los dos medicamentos simultáneamente, mejorando el efecto antineoplásico con efectos secundarios reducidos.

Los avances recientes en el campo de la nanotecnología manejan enfoques novedosos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer [9, 10]. Las nanopartículas (NP) construidas con copolímeros anfifílicos, especialmente polietilenglicol (PEG), son conocidas por su capacidad para reducir la adherencia de proteínas séricas y prevenir la captación por el sistema reticuloendotelial (RES) [11]. Si se utilizan para transportar fármacos hidrófobos, los nanoportadores aumentan la solubilidad con tacto y prolongan y aumentan la residencia del fármaco en la circulación sanguínea y el tumor [12]. Con el uso clínico de los NP copoliméricos, la biocompatibilidad de los NP atrae cada vez más la atención. Por ejemplo, hallazgos recientes revelaron que algunas nanopartículas de dióxido de titanio, sílice y oro inyectadas aceleran la intravasación y extravasación de las células cancerosas en modelos animales [13]. Los NP preparados a partir de nanomateriales con buena biocompatibilidad y seguridad, especialmente los aprobados por la FDA, son mejores candidatos para portadores de fármacos.

De manera preliminar, hemos logrado construir NP cargadas con CDDP [14, 15] y NP cargadas con Tet utilizando polietilenglicol-poli (caprolactona) (PCL-PEG) [16], cuyos efectos antitumorales in vivo han sido demostrados. En este estudio, utilizamos PEG-PCL para la entrega conjunta de CDDP y Tet. Con una carga casi neutra, el PEG forma la capa hidrófila de una nanopartícula, que oculta los epítopos antigénicos y previene la reacción inmunológica [14]. Las imágenes del microscopio de fluorescencia demostraron que las células pueden absorber tanto agentes hidrófilos como hidrófobos suministrados por las NP. Los resultados de los estudios in vitro, no solo en diferentes líneas de células tumorales, sino también en tejidos tumorales, revelaron que las NP CDDP-Tet inhiben el crecimiento tumoral de manera más efectiva que los medicamentos libres. Cuando se investigó in vivo, se observó una mayor eficacia antitumoral y una disminución de los efectos secundarios en el grupo de NP. Además, 18 Las imágenes de FDG-PET / CT mostraron la tasa de metabolismo más pobre del tumor en el grupo de NP, lo que indica la capacidad de las NP de CDDP-Tet para retardar el crecimiento del tumor.

Métodos

Materiales

Reactivos y células

CDDP (fórmula molecular PtCl 2 (NH 3 ) 2 ) se compró a Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan China) [15]. Tetrandrina (fórmula molecular C 38 H 42 N 2 O 6 ) se obtuvo en forma de polvo con una pureza> 98% de Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China) [16]. Metoxipolietilenglicol [MePEG; peso molecular promedio en peso (Mw =4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China) se deshidrató mediante destilación azeotrópica con tolueno y luego se secó al vacío a 50 ° C durante 12 h antes de su uso. ε-Caprolactona (ε-CL; Aldrich , EE. UU.) Se purificó secando sobre CaH 2 a temperatura ambiente seguida de destilación a presión reducida. Se utilizaron alcohol polivinílico (PVA; grado de polimerización =500, grado de alcoholización =88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., China) y octoato estannoso (fórmula molecular SnCl2) (Sigma) tal como se recibieron. Se utilizaron medio RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.), Suero sanguíneo de ternero (Lanzhou Minhai Bioengineering, China) y bromuro de dimetiltiazolio-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Amersco, EE. UU.) Tal como se recibieron.

Línea celular de cáncer gástrico bien diferenciado humano MKN 28 , línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano LoVo, línea celular de cáncer de cuello uterino humano Hela y línea celular de hepatoma murino H 22 se obtuvieron del Instituto de Biología Celular de Shanghai (Shanghai, China). Todas las líneas celulares se propagaron en medio RPMI 1640, suplementado con suero bovino al 10%, penicilina (100 U / mL) -estreptomicina (100 g / mL), piruvato, glutamina e insulina a 37 ° C en una atmósfera saturada de agua con 5% CO 2 .

Síntesis de los copolímeros

Como describimos anteriormente [16, 17], los copolímeros mPEG-PCL y HO-PCL se sintetizaron mediante una copolimerización de apertura de anillo. Brevemente, se añadió una cantidad predeterminada de ε-CL a un tubo de polimerización que contenía PEG y una pequeña cantidad de octoato estannoso (0,1% p / p). Luego, el tubo se conectó a un sistema de vacío, se selló y se colocó en un baño de aceite a 130 ° C durante 48 h. Para la síntesis de copolímeros HO-PCL, se añadió una cantidad predeterminada de ε-CL y octoato estannoso en un tubo de polimerización sin secar. Una vez completada la polimerización, los copolímeros brutos se disolvieron con cloroformo y se precipitaron en una cantidad en exceso de metanol frío para eliminar el monómero y el oligómero sin reaccionar. Luego, los precipitados se filtraron y lavaron con agua varias veces antes de secarlos completamente a presión reducida.

Preparación de nanopartículas cargadas con CDDP-Tet

Se prepararon cantidades predeterminadas de nanopartículas cargadas con CDDP y Tet mediante el método de doble emulsión (DE) [14, 18]. Se emulsionó CDDP y Tet con 1 mL de solución de diclorometano (DCM) que contenía 5 mg de mPEG-PCL y 15 mg de HO-PCL, mediante sonicación durante 15 s (15 W) en un baño de hielo (solución W1). Luego, se añadieron 4 ml de solución W2 de PVA al 3% (p / v) y se sonicó durante 30 s para preparar una emulsión W1 / O / W2. La emulsión doble se diluyó en 50 ml de una solución acuosa de PVA al 0,3% (p / v) y el DCM se evaporó al vacío. Las nanopartículas obtenidas se recolectaron, lavaron y liofilizaron (Fig. 1).

El esquema de preparación de NP CDDP-Tet

Contenido de carga de fármacos y eficacia de encapsulación

Para determinar el contenido de carga del fármaco, se disolvió el polvo de NP cargado con CDDP-Tet liofilizado en dimetilformamida (DMF) y se mezclaron 30 L de esta solución con 30 L de HCL 2 mmol / L seguido de la adición de 2,94 ml de 0,2 mmol / L de SnCl 2 solución en 2 mmol / L de HCL. La absorbancia a 403 nm se midió después de 1 h con referencia a una curva de calibración usando un espectrofotómetro Shimadzu UV-1205 (Kyoto, Japón). A continuación, se podría calcular la cantidad total de fármaco en los NP. El contenido de carga de fármaco y la eficiencia de encapsulación se obtuvieron, respectivamente, mediante las Ecs. (1) y (2):

$$ {\ text {Contenido de carga del fármaco}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {Peso del fármaco en nanopartículas}}}} {{{\ text {Peso de las nanopartículas}}}} \ times 100 \, (\%) $$ (1) $$ {\ text {Eficiencia de encapsulación}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {Peso del fármaco en nanopartículas}}}} { {{\ text {Peso del medicamento para la alimentación}}}} \ veces 100 \, (\%) $$ (2)

Citotoxicidad in vitro de las nanopartículas y estudio de biocompatibilidad

Estudios de captación celular

Sobre la base de nuestro trabajo anterior [15], las células LoVo se colocaron en la cubierta de una placa de 6 poros con aproximadamente 5 × 10 5 células en cada poro y se incubaron durante 24 h (37 ° C, 5% CO 2 ). Se agregaron NP con rodamina B (21 μg / mL) en los poros. Después de 2 h de incubación, el paté se lavó con 4 ° C y 37 ° C de PBS de 3 a 4 veces cada uno. Las células LoVo de los cubreobjetos se sometieron luego a un microscopio de fluorescencia.

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad in vitro de los fármacos se determinó mediante ensayos MTT estándar utilizando MKN28 y H 22 líneas celulares. Brevemente, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5000 células por pocillo 24 h antes del ensayo. Luego, las células se expusieron a una serie de dosis de CDDP libre, Tet libre, CDDP libre más Tet y nanopartículas cargadas con CDDP-Tet. Después de la incubación, se agregaron 20 μL de solución de MTT 5 mg / mL a cada pocillo y la placa se incubó durante 4 h, permitiendo que las células viables transformaran el MTT amarillo en cristales de formazán azul oscuro, que se disolvieron en 200 μL de dimetil sulfóxido (DMSO). La densidad óptica (DO) de cada pocillo se midió con un lector ELISA (ELX800 Biotek, EE. UU.) Utilizando longitudes de onda de prueba y de referencia de 490 y 630 nm, respectivamente. La viabilidad celular se determinó mediante la siguiente fórmula:

$$ {\ text {Viabilidad celular}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {OD (pozo de prueba)}}}} {{{\ text {OD (pozo de referencia)}}}} \ por 100 \, (\%) $$ (3)

La compatibilidad in vitro de las nanopartículas en blanco también se determinó mediante ensayos MTT utilizando MKN 28 y H 22 líneas celulares. Todos los resultados obtenidos de los ensayos MTT se confirmaron repitiendo el experimento en al menos tres ocasiones independientes y probando por triplicado cada vez.

Ensayo de apoptosis

Se adoptó el kit Annexin V-FITC (Bender MedSystem, EE. UU.) Para examinar la alteración de las tasas de apoptosis celular. MKN 28 las células se sometieron a una placa de cultivo de 6 cm durante 24 h. Los medios de cultivo se reemplazaron con 1 μg / mL de CDDP libre, 1 μg / mL de NP cargadas con CDDP y 200 μg / mL de NP en blanco, respectivamente. El grupo de control se reemplazó con medios de cultivo sin fármacos. Se añadió la enzima después de 48 h de cultivo. A continuación, se recogieron las células, se lavaron 2 veces con PBS y se resuspendieron en 100 µl de tampón. Se añadieron a su vez 5 μL de anexina V y 1 μL de PI, se mezclaron y se dejaron reposar durante 15 min a temperatura ambiente sin exposición a la luz. Se agregaron 400 ml de tampón y se sometió al proceso FCM (BD FACS CantoTM, EE. UU.) Para el análisis de las tasas de apoptosis celular.

Ensayo de respuesta a fármacos por histocultura (HDRA)

La HDRA se realizó de acuerdo con nuestros estudios anteriores [14, 19]. Brevemente, se inyectaron ratones ICR machos por vía subcutánea en ambos espacios axilares con 4–6 × 10 6 H 22 células en solución salina. Cuando los tumores alcanzaron los 400-600 mm 3 En volumen, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se tomaron muestras de muestras frescas, se lavaron dos veces en solución salina, se sumergieron en la solución de Hank y se dividieron en trozos con pesos de aproximadamente 15 mg. Las muestras de tejido se colocaron en una placa de 24 pocillos en la que se habían sumergido esponjas cuadradas de gelatina con dimensiones de 1 cm en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 20% y sulfato de amikacina (100 UI / ml) que contenía CDDP o CDDP libre. NP cargados en dos concentraciones diferentes. Se incubaron cuatro muestras de tumor sin ningún fármaco como control. Luego, los tejidos se cultivaron durante 7 días a 37 ° C 5% CO 2 . Se añadió una solución mixta de colagenasa de Tipo I (100 L, 0,6 mg / ml) y MTT (100 L, 5 mg / ml) en succinato de sodio 100 mg / ml. Después de la incubación durante otras 24 h, se extrajo MTT formazán con 1 ml de DMSO y se transfirieron 100 L de solución de cada pocillo a los pocillos de una microplaca de 96 pocillos. La DO de cada pocillo en la microplaca se midió usando el lector ELISA con longitudes de onda de prueba y de referencia de 490 y 630 nm, respectivamente. Las viabilidades de los tejidos se calcularon de acuerdo con la siguiente fórmula (4):

$$ {\ text {Viabilidad del tejido}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {OD (prueba)}} / {\ text {Peso (prueba) / mg}}}} {{{\ text {OD (control)}} / {\ text {Peso (control) / mg}}}} \ times 100 \, (\%) $$ (4)

Eficacia antitumoral in vivo

Medición del volumen tumoral

A ratones ICR macho con un peso entre 18 y 20 g se les implantó la línea celular de hepatoma murino H 22 y se utiliza para calificar la eficacia relativa de los NP cargados con CDDP-Tet. Criados en circunstancias libres de patógenos específicos (SPF), los ratones se realizaron de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité de Cuidado Animal en el Hospital Drum Tower. 0,2 ml de suspensión celular que contiene 4–6 × 10 6 H 22 las células se inyectaron por vía subcutánea en el espacio axilar izquierdo de los ratones. Los ratones se dividieron en 6 grupos:grupo de control (solución salina), grupo de NP en blanco, grupo de CDDP libre (3 mg / kg), grupo de CDDP libre más Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg) y CDDP- Grupo NP cargadas con Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg). Cada grupo estaba compuesto por 6 ratones. Los tratamientos se iniciaron después de 7-8 días de la implantación y el día se designó como "Día 0". Se pesó cada animal en el momento del tratamiento para poder ajustar las dosis para alcanzar las dosis de mg / kg informadas. Los animales también se pesaron cada dos días a lo largo del experimento.

Ensayo de inmunofluorescencia

Los tejidos tumorales de los ratones en el grupo de control y que recibieron CDDP libre más Tet y CDDP-Tet NP se seleccionaron para observación histológica el día 21 después del tratamiento. Los tumores se disecaron y fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, procesada rutinariamente en parafina, seccionada con un grosor de 5 mm. Las secciones de tejido se observaron bajo un microscopio confocal Zeiss LSM510 Meta después de que las muestras se tiñeron con (40,6-diamidino-2-fenilindol) (DAPI, azul) y marcaje terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP con muescas (TUNEL, verde) [20] .

18 Imágenes FDG-PET / CT

Los ratones del grupo de CDDP libre más Tet y del grupo de NP cargadas con CDDP-Tet recibieron imágenes de PET / CT el día 6 después del tratamiento. Se realizaron 4 h de ayuno antes de la inyección del marcador. 14,8 MBq (400 lCi) de 18 Se inyectó F-FDG a través de la vena de la cola como radiotrazador. Las imágenes se obtuvieron con un escáner combinado PET / CT (Jemini JXL, Philips, EE. UU.). Se adquirieron imágenes de PET de alta resolución y el mismo campo de visión de TC con los ratones 45 minutos después de la administración de 18 F-FDG. Las imágenes de PET se corrigieron para atenuación y dispersión sobre la base de los datos de CT. La fusión de imágenes se realizó mediante un sistema automático de fusión de imágenes, utilizando software proporcionado por el proveedor. Se obtuvieron valores máximos de captación de FDG en el tumor para los cálculos del valor de captación estándar (SUV), aplicando correcciones para el peso corporal y la actividad inyectada.

Métodos estadísticos

Los análisis estadísticos de los datos se realizaron utilizando t de Student. prueba. Los datos se enumeran como media ± DE y valores de P <0.05 fueron aceptados como una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Síntesis y caracterización de copolímeros

Según nuestro estudio anterior, sintetizamos los NP con PEG-PCL y HO-PCL (la relación óptima fue 1:3) [14]. El diámetro, la polidispersidad, el peso molecular promedio en número (Mn) y el peso molecular promedio en peso (Mw) de los NP copoliméricos óptimos de PEG-PCL se muestran en el archivo adicional 1:Tabla S1. Cuando se cargan con CDDP y Tet, también se midieron el contenido de carga del fármaco y la eficiencia de encapsulación (archivo adicional 1:Tabla S2), que son similares a los de los NP copoliméricos PEG-PCL cargados con CDDP. Sin embargo, el contenido de carga de fármaco y la eficiencia de carga de Tet son menores que los de los NP copoliméricos PEG-PCL cargados con Tet, que pueden tener algo que ver con los componentes HO-PCL.

A través de la dispersión dinámica de la luz (DLS), el diámetro de los NP copoliméricos de PEG-PCL cargados con CDDP-Tet fue de 359,1 ± 5,3 nm con una polidispersidad de alrededor de 0,231. Cuando se observó por TEM y AFM (archivo adicional 1:Fig S1a y S1b), los NP presentaron forma esférica regular y tamaños similares que en coincidencia con los datos de DLS. Además, las pequeñas gotas se dispersan en las nanopartículas, lo que confirma que las nanopartículas son de hecho la estructura de la doble emulsión.

Captación celular de NP cargadas con CDDP-Tet

La carga de partículas con tintes fluorescentes se ha aplicado como un método común para explorar la captación celular, que realiza la detección visual y en tiempo real. Hemos demostrado que las NP cargadas con colorante pueden ingresar a las células a través de la endocitosis. En este estudio, la rodamina-B es hidrófila y puede detectarse en el canal de fluorescencia de PI, que se utiliza para simular CDDP. Al igual que la simulación de Tet, la cumarina-6 es hidrófoba, cuya señal se puede recibir en el canal de fluorescencia FITC. Después de co-incubarse con NP cargadas con cumarina-6 y rodamina-B durante 2 h, las células LoVo se detectaron mediante microscopía de fluorescencia y lente óptica (200 ×). Como puede verse en la Fig. 2, las señales de fluorescencia se pueden detectar en el canal de fluorescencia PI, el canal de fluorescencia FITC, así como en el canal de fluorescencia dual PI / FITC. Los resultados confirmaron que las NP pueden transportar cumarina-6 y rodamina-B a las células tumorales al mismo tiempo, de acuerdo con lo cual podemos inferir que CDDP y Tet pueden cargarse en las NP y ser absorbidas por las células tumorales simultáneamente.

Fotografías de células LoVo después de 2 h de tinción con NP cargadas con rodamina B y cumarina-6 (200 ×; barra:50 um). un Morfología celular al microscopio óptico, b morfología celular bajo microscopio de fluorescencia (canal de fluorescencia PI), c morfología celular bajo microscopio de fluorescencia (canal de fluorescencia FITC), y d morfología celular bajo microscopio de fluorescencia (canal de fluorescencia dual PI / FITC)

Citotoxicidad in vitro de las nanopartículas

La citotoxicidad de CDDP libre, Tet libre, CDDP libre más Tet y NP cargadas con CDDP-Tet se compararon en la línea celular gástrica MKN28. La concentración de Tet fue 2,4 veces mayor que la concentración de CDDP. Como se muestra en la Fig. 3, la citotoxicidad de las NP cargadas con CDDP-Tet fue más potente entre los cuatro grupos. La diferencia de citotoxicidad entre Tet libre y el grupo de NP y otros tres grupos de fármacos libres se hizo prominente con el aumento de la concentración. Se observaron resultados similares en células de cáncer de cuello uterino humano Hela y células de carcinoma hepatocelular H 22 (Archivo adicional 1:Fig S2a, S2b).

Citotoxicidad in vitro de las nanopartículas. un Viabilidades celulares de MKN28 después de ser cocultivado con fármacos durante 48 h. La concentración de Tet fue 2,4 veces mayor que la concentración de CDDP. b Fotografías de células MKN28 bajo microscopía óptica (200 ×) después de ser cocultivadas con fármacos durante 48 h

El estudio de toxicidad de los NP en blanco se realizó en nuestro trabajo anterior. En el estudio anterior, el blanco de NP tenía poca toxicidad en las líneas de células tumorales, lo que indicó que los NP en blanco tienen una biocompatibilidad satisfactoria [14, 16].

Análisis de apoptosis in vitro de NP cargadas con CDDP-Tet

Medimos el impacto de 1 μg / mL de CDDP libre, 2.4 μg / mL de Tet libre, CDDP libre más Tet (1 μg / mL + 2.4 μg / mL) y NP cargadas con CDDP-Tet (1 μg / mL + 2.4 μg / mL) sobre la tasa de apoptosis de las células MKN28 después de ser cocultivadas durante 48 h. La tasa de apoptosis celular se calculó como Q2 + Q4 (que se muestra en la Fig. 4). La alteración de las tasas de apoptosis de las células fue similar entre los grupos de CDDP libre más Tet, CDDP libre y Tet libre (Fig. 4a-c). Sin embargo, la tasa de apoptosis de las células MKN28 inducida por NP cargadas con CDDP-Tet fue significativamente mayor que la de otros tres grupos (Fig. 4d).

Análisis de apoptosis in vitro por citometría de flujo a CDDP gratuito, b Tet gratis, c CDDP + Tet y d gratuitos NP CDDP-Tet

Ensayo de respuesta a fármacos por histocultura (HDRA)

Para evaluar la efectividad antitumoral de los NP de manera más completa, evaluamos los efectos antitumorales del CDDP libre, el CDDP libre más Tet y los NP cargados con CDDP-Tet en H 22 líneas celulares que utilizan HDRA. Como método clínico para predecir la quimiosensibilidad, HDRA simula las condiciones prácticas de los tejidos tumorales de manera más auténtica que el experimento citológico [19], cuyos resultados pueden verse influenciados por el microambiente y la microestructura del tejido tumoral, como la penetración del fármaco, los valores de pH extracelular, intersticial presión de fluido, etc.

La concentración de Tet es 2,4 veces mayor que la concentración de CDDP. Como se muestra en la Fig. 5, a la concentración más baja, el efecto antitumoral del CDDP libre y el grupo Tet fue mejor que el del CDDP, aunque los efectos fueron similares con el aumento de la concentración del fármaco. De acuerdo con el análisis de apoptosis, las NP cargadas con CDDP-Tet tuvieron un efecto antitumoral considerablemente mejor entre tres grupos en todas las concentraciones probadas.

Ensayo de respuesta a fármacos de histocultivo

Análisis de eficacia antitumoral in vivo

Evaluación de la eficacia y los efectos secundarios

Modelos murinos formados por H 22 injertos de líneas celulares se trataron con 3 mg / kg de CDDP libre, CDDP libre junto con Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg), NP cargadas con CDDP-Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg), respectivamente. Los tumores se obtuvieron 12 días después del tratamiento farmacológico. Los tamaños de los tumores se detectaron cada 2 días para determinar el contenido más óptimo de administración del fármaco. Como se muestra en la curva de crecimiento del tumor (Fig. 6), la tendencia de crecimiento del tumor del grupo de control así como el grupo de nanopartículas en blanco fueron similares pero existió una inhibición prominente del tumor en otros tres grupos con la administración del fármaco. En comparación con el grupo de CDDP libre, el grupo de CDDP libre más Tet mostró una mejor eficacia antitumoral durante los primeros 6 días. Sin embargo, después de 6 días, la diferencia de la tasa de inhibición tumoral entre los dos grupos comenzó a reducirse y después de 10 días, el CDDP libre más Tet tuvo un efecto antitumoral aún peor.

Volumen tumoral de H 22 establecido xenoinjertos en ratones ICR durante la terapia bajo diferentes tratamientos. Los ratones se trataron con diferentes estrategias el día 0 como se muestra en la figura:3 mg / kg de CDDP libre, CDDP libre junto con Tet (CDDP 3 mg / kg + Tet 7.2 mg / kg) y NP cargadas con CDDP-Tet ( CDDP 3 mg / kg + Tet 7,2 mg / kg), respectivamente. Media ± DE ( n =6) de cada grupo se midió

Durante los primeros 6 días, los efectos antitumorales de los grupos NP cargados con CDDP más Tet y CDDP Tet libres fueron similares. Por lo tanto, los NP cargados con CDDP-Tet de murino mostraron una mejor eficacia antitumoral desde el día 6 después del tratamiento. Archivo adicional 1:La Figura S3a muestra diferentes tamaños de tumores de cada grupo. El volumen tumoral del grupo de NP cargadas con CDDP-Tet fue el más pequeño, lo que podría considerarse como el reflejo directo de un efecto antitumoral prominente. Además de la capacidad de inhibición del tumor, en comparación con el grupo de CDDP libre o CDDP libre más Tet, había menos vasos sanguíneos localizados en la superficie del tumor). De manera similar, como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S3b, la densidad vascular fue la más baja en el grupo de NP en relación con el grupo de control y el grupo de CDDP más Tet libre.

Para investigar más a fondo la proporción de células apoptóticas en tejido tumoral in vivo, se realizó el ensayo TUNEL para la detección de células apoptóticas. Como se muestra en la Fig. 7, las células apoptóticas en tumores pueden teñirse con fluorescencia verde para indicar apoptosis. Las imágenes fusionadas muestran menos regiones fluorescentes verdes en el grupo de control y el grupo de CDDP libre más Tet, lo que indica la presencia de menos células apoptóticas. Además, se observó un gran número de regiones fluorescentes verdes en el grupo tratado con CDDP-Tet NP, lo que indica una gran cantidad de células apoptóticas. Los resultados confirmaron que las NP CDDP-Tet pueden promover la apoptosis tumoral in vivo.

Las células apoptóticas se detectaron mediante un ensayo TUNEL (verde) y se tiñeron conjuntamente con tinción nuclear DAPI (azul)

Además de una mejor eficacia antitumoral que el grupo CDDP libre y CDDP libre más Tet, los NP cargados con CDDP-Tet también mostraron menos efectos secundarios. Como se muestra en la Fig. 8a, el CDDP libre y el CDDP libre más Tet causaron una pérdida de peso significativa en comparación con el grupo de control, lo que indica la toxicidad con la administración directa del fármaco. La curva de cambio de peso del grupo de NP en blanco fue similar a la del grupo de control, lo que sugiere que la toxicidad de las NP en blanco podría ignorarse. La pérdida de peso causada por las NP cargadas con CDDP-Tet y los grupos de control fueron comparables durante los primeros 6 días. Desde el día 6 al día 12, los niveles de peso murino en el grupo de NP fueron ligeramente más bajos que en el grupo de control, pero fueron más altos que los del grupo de CDDP libre o CDDP libre más Tet. Es de destacar que el grupo CDDP libre más Tet contribuyó a una pérdida de peso obvia y disminuyó el apetito de los ratones durante los primeros 4 días, lo que indica que la absorción de medicamentos fue dañina para todo el cuerpo. Por el contrario, las NP cargadas con CDDP-Tet pueden liberarse lentamente en los tejidos y mantener la concentración en un grado estable; por lo tanto, los efectos secundarios obviamente disminuyeron en comparación con la administración directa del fármaco. Luego, los efectos secundarios del tratamiento también se evaluaron mediante biopsia de hígado (Fig. 8b). En comparación con el grupo de control, el límite entre las células hepáticas del grupo de fármacos desnudos de doble fármaco es borroso, algunas células hepáticas tienen cambios hinchados, los cuerpos celulares se encogen, picnosis nuclear y eosinofilia aumentada (flecha amarilla), mientras que el fármaco doble grupo de nanopartículas. La estructura de las células madre es normal, el espacio intercelular está despejado y no hay ningún cambio patológico evidente. Estos resultados sugirieron que hubo poco deterioro causado por la entrega de NP.

Evaluación de efectos secundarios a pesos corporales de H 22 establecido xenoinjertos en ratones ICR durante la terapia bajo diferentes tratamientos. b Las muestras de hígado teñidas con HE se observaron con microscopio óptico (400 ×)

PET – CT

Para comparar mejor el efecto terapéutico in vivo de cada grupo, los ratones se sometieron a TC, PET / TC el día 6 después del tratamiento. Las imágenes de fusión de TC y PET se muestran en la Fig. 9. La PET / TC es un método eficaz para reflejar los cambios metabólicos a través de 18 Detección de captación de FDG [21]. As shown in CT scan (Fig. 9), the tumor volume of free CDDP plus Tet group and CDDP-Tet-loaded NPs group were comparable (Fig. 9a) but the tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group was significantly higher than NPs group (Fig. 9b). The decreased intensity at the tumor site of the murine received CDDP-Tet-loaded NPs symbolized poor metabolism rate of the tumor, and thereby indicating the capability of NPs to retard tumor growth.

Male ICR mice bearing a subcutaneous H22 tumor at the left axillary (arrows). CT, PET and fused PET/CT images are arranged in the figure from left to right. Tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group (blue arrow) was significantly higher than NPs group (yellow arrow)

Discusión

Considering the heterogeneity and complexity of tumor, combination therapy has become a standard strategy in the clinical treatment of tumor [22]. Nevertheless, simple combination of two individual therapeutics can't necessarily reach anticipated effect because of the different physicochemical and pharmacokinetic properties of the two drugs [23]. To deliver different drugs to tumor cells in a synergistic ratio, a combination therapy vehicle has been designed in this study. CDDP is hydrophilic while Tet is hydrophobic, which cause problems for the loading method. In this study, we used the amphiphilic copolymer with PCL as the hydrophobic core and PEG as the hydrophilic corona [14]. By the improved double emulsion method, Tet located in the oil layer and CDDP located in the water layer, the unique structure imparts the NPs with the capacity to simultaneous encapsulation of Tet and CDDP to form NPs. CDDP and Tet are located in different layers of NPs, resulting in low interfering effect and high stability [24].

The combination therapy vehicle loaded with CDDP and Tet can enhance the efficacy of CDDP-Tet combination. Not only in the cellular experiments, CDDP-Tet NPs also significantly inhibit tumor tissue viabilities in the HDRA assays, validating the anti-tumor effect of the NPs in the model which take into account of tumor microenvironment [19]. As to in vivo study, antitumor efficacy was observed in tumor volume change, which demonstrated that CDDP-Tet NPs effectively suppressed tumor growth with lower proliferation level. 18 FDG-PET/CT imaging revealed that the glucose metabolism of the tumors in the CDDP-Tet group was inhibited more prominently and early by inducing higher apoptosis level of tumors, which was confirmed in the immunofluorescence assays [21]. Compared with free CDDP plus Tet, CDDP-Tet NPs are faster and safer to take effect, which can be explained by the three mechanisms as follows.

Firstly, as a lipid-soluble drug, Tet can hardly distribute in the ECM and therefore rarely diffuse around tumor cells [9]. Located in the oil phase of NPs, Tet is endowed with better solubility and bioavailability, reaching the tumor sites in the same synergistic ratio as CDDP. Furthermore, CDDP, which used to have systemic side effect, once carried by the nanoparticle, can easily reach the interstitium of tumor tissues from leaky tumor blood vessels and be held within the tumor on account of pressure made by destitute lymphatic drainage [25]. The more CDDP tumor tissues hold, the less damage will be done to normal organs. As a result of passive targeting strategies, CDDP-Tet NPs are much safer than free CDDP plus Tet, which can be observed in the murine body weight changes and liver biopsies.

Drug resistance is regarded as one of the greatest challenges in cancer treatment, not only because of genetic changes at the level of a single cell, but also due to tumor tissues and microenvironment [26]. On one hand, Tet is alkaline, so it will be protonated in the acidic tumor microenvironment and thus can’t cross the electronegative tumor cytomembranes, which is called pH-induced physiological drug resistance [27]. On the other hand, large distances between blood vessels in solid tumors and high interstitial fluid pressure contribute to limited distribution of CDDP and Tet [28]. Carried by the nanovehicle, Tet can enter tumor cells via endocytosis without influence of tumor microenvironment, overcoming the pH-induced physiological drug resistance. The small size of nanocarriers allows them to enter tumor vasculature and preferentially accumulating at the tumor site in vivo [29, 30].

In summary, this study represents an example of delivering a chemotherapeutic drug along with a chemosensitizer simultaneously. Carried by the NPs, both drugs are targeted to tumor site passively, reducing systemic toxicity. Besides, NPs offer a solution to physiological drug resistance by helping the chemosensitizer enter tumor cells more and faster, which play an important role in improving the efficacy of tumor chemotherapy. Therefore, we believed that this PEG–PCL block copolymeric NPs could be a promising carrier for combined chemotherapy.

Conclusions

Based on our previous studies [8, 14, 16], this paper investigated the application of PEG–PCL/HO-PCL NPs for delivery of the combination of two drugs with different physicochemical properties. For in vitro studies, NPs exhibited superior antitumor effect with great biocompatibility. Enhanced antitumor efficacy was observed in tumor volume change and 18 FDG-PET/CT Imaging as to in vivo study in murine model. The mice in NPs group also exhibited reduced side effects. Additionally, the apoptosis rate of tumor cells was promoted by NPs in both in vitro and in vivo studies. In summary, this block copolymeric NPs could be a promising carrier for the delivery of Cisplatin–Tetradrine combinations and other combinations, with enhanced antitumor effect and reduced toxicity, for the treatment of cancer.

Disponibilidad de datos y materiales

The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abreviaturas

Tet:

Tetradrine

CDDP:

Cisplatin

NP:

Nanopartícula

PEG–PCL:

Poly(ethyleneglycol)–polycaprolactone

HO-PCL:

Polycarprolactone

ECM:

Extracellular matrix

PEG:

Polietilenglicol

RES:

Reticuloendothelial system

DMF:

Dimetilformamida

SPF:

Libre de patógenos específicos

Mn:

Peso molecular medio numérico

Mw:

Peso molecular medio ponderado

DLS:

Dispersión de luz dinámica


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