Coadministración de dacarbazina y ácido transretinoico (ATRA) mediante nanoformulaciones lipídicas para la eficacia antitumoral sinérgica contra el melanoma maligno

Resumen

El melanoma maligno es un cáncer de piel muy agresivo responsable de 80% de la mortalidad y la mediana de supervivencia general en pacientes con melanoma metastásico es de sólo seis a nueve meses. Se ha demostrado que el tratamiento combinado mediante la administración simultánea de fármacos duales en un único nanoportador es elegante y eficaz para combatir el cáncer. En este documento, empleamos una terapia combinada basada en dacarbazina (DBZ), fármaco aprobado por la FDA para el melanoma y ácido retinoico trans-trans (ATRA), agentes anticancerosos prometedores cargados en nanoformulaciones de lípidos (RD-LNF) como una nueva estrategia de tratamiento para el melanoma maligno. Hemos encapsulado con éxito ambos fármacos en nanoformulaciones de lípidos y hemos demostrado una liberación controlada de la carga útil a lo largo del tiempo. Demostramos que la entrega simultánea de DBZ y ATRA podría reducir eficazmente la proliferación celular de una manera dependiente de la concentración. Las nanopartículas combinacionales redujeron significativamente la capacidad de formación de colonias de las células de melanoma B16F10. El análisis del citómetro de flujo mostró que RD-LNF indujo una mayor proporción de células de apoptosis con una inhibición significativa de la progresión del ciclo celular y la migración celular. Estos resultados sugieren el potencial prometedor de RD-LNF en el tratamiento del melanoma maligno con alta eficacia.

Introducción

El melanoma maligno es una de las neoplasias malignas agresivas que se presenta predominantemente en la piel humana [1]. El melanoma representa el 4% de todos los cánceres dermatológicos, sin embargo, es responsable del 80% de la mortalidad por cáncer de piel y se está convirtiendo en una preocupación creciente en los países subdesarrollados y en desarrollo [2, 3]. El melanoma tiene una alta tendencia a hacer metástasis en las diversas partes del cuerpo, incluidos el cerebro, el corazón y los pulmones, lo que lo convierte en una de las formas agresivas de neoplasias malignas [4]. Si se diagnostica en etapas tempranas, la escisión quirúrgica es una de las posibles opciones terapéuticas. Sin embargo, la intervención quirúrgica no garantiza una recuperación completa del melanoma [5]. Además, la fase de crecimiento radial de esta neoplasia maligna se vuelve resistente a la mayoría de las otras opciones de tratamiento, incluidas la quimioterapia y la radioterapia [6]. Para ser específicos, los receptores de péptidos se sobreexpresan en la superficie del cáncer de melanoma, lo que lo convierte en una perspectiva atractiva. Se ha demostrado que el receptor de somatostatina subtipo 2 (SSTR2) se expresa en gran medida en las células del melanoma [7].

La dacarbazina (DBZ) o dimetil-triazeno-imidazol carboxamida (DTIC), un agente alquilante del ADN, es la única opción de primera línea de fármaco quimioterapéutico aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) [8]. DBZ es un agente alquilante fuerte que mata las células cancerosas al agregar los grupos alquilo al ADN o al material nuclear de las células cancerosas [9]. A pesar de su potente acción, DBZ adolece de una escasa solubilidad en agua y una vida media corta (41 min) en la circulación sanguínea, lo que reduce su efecto terapéutico en el tratamiento de las neoplasias malignas del melanoma [10]. Además, se observó una tasa de respuesta decepcionante entre el 10 y el 25% con menos del 5% de recuperación completa del cáncer, lo que indica la limitación de una terapia con un solo agente [11, 12]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar una estrategia alternativa para mejorar la eficacia del tratamiento de DBZ.

La coadministración de múltiples agentes terapéuticos en una sola administración ha demostrado ser más eficaz en comparación con la del agente terapéutico individual [13]. La coadministración de agentes terapéuticos en un único sistema portador conferirá la actividad sinérgica, propiedades farmacocinéticas similares y una mayor eficacia contra el cáncer [14]. El ácido todo-trans-retinoico (ATRA) es un agente anticanceroso prometedor que se utiliza en el tratamiento de varios cánceres [15]. El ATRA mostró su eficacia terapéutica al unirse a los receptores del ácido retinoico en el núcleo de las células cancerosas, lo que resultó en la inhibición del crecimiento, la proliferación, la diferenciación y, finalmente, la muerte celular [16]. A diferencia de otros agentes quimioterapéuticos, ATRA no produjo ningún efecto adverso como cardiotoxicidad o hipoplasia de la médula ósea. Se ha informado que ATRA mejora la eficacia contra el cáncer cuando se usa en combinación con un agente quimioterapéutico apropiado. Una vez más, el ATRA lipófilo sufre una escasa solubilidad en agua y un rápido aclaramiento sistémico, lo que hace necesario un sistema de administración estable [17].

Se ha demostrado que los sistemas de administración de nanopartículas mejoran la eficacia terapéutica de los productos terapéuticos encapsulados liberándolos en los tejidos tumorales diana y evitando el efecto fuera del objetivo en la circulación sistémica empleando un efecto mejorado de permeación y retención (EPR) [18, 19]. Las nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) se consideran una alternativa a muchos vehículos existentes, incluidos los liposomas o las micelas, debido a las características más destacadas, como la estabilidad mejorada, la liberación controlada del fármaco, la alta eficiencia de carga y la facilidad de preparación / ampliación [20]. . Uno de los aspectos importantes del SLN como portador de la administración de fármacos es el perfil de seguridad de los lípidos que se encuentran en el estado GRAS, bien tolerados y lípidos fisiológicos [21]. La incorporación estable de fármacos en el núcleo lipídico mejora la solubilidad acuosa y mejora el perfil farmacocinético y extiende la estabilidad fisiológica en la circulación sistémica [22].

En este estudio, abordamos una estrategia prometedora de co-entrega de DBZ y ATRA utilizando nanoformulaciones de lípidos para el tratamiento combinado en neoplasias malignas de melanoma. Se espera que el DBZ se cargue en el núcleo lipídico, mientras que se espera que ATRA sea parte de la estructura de las nanopartículas. Estudiamos las propiedades fisicoquímicas, la captación celular y la citotoxicidad in vitro de nanopartículas combinadas. Además, el efecto anticáncer se evaluó más a fondo mediante un ensayo de apoptosis, análisis del ciclo celular, formación de colonias y análisis de migración celular.

Conclusión

En conclusión, hemos formulado con éxito nanoformulaciones de lípidos cargadas con dacarbazina y ácido transretinoico. Nuestros resultados demuestran claramente que el RD-LNF inhibe la proliferación de células de melanoma, induce una apoptosis notable e inhibe la progresión del ciclo celular y las migraciones celulares. El trabajo futurista se centrará en estudiar la eficacia contra el cáncer en modelos animales clínicamente relevantes y en desarrollar una terapia dirigida hacia la malignidad del melanoma. Este es un estudio preliminar llevado a cabo en las células de melanoma y estudios de amplio rango en diferentes modelos animales clínicamente relevantes son la siguiente parte de nuestro trabajo de investigación.

Materiales y métodos

Preparación de nanoformulaciones de lípidos cargadas con DBZ / ATRA

Las nanopartículas lipídicas cargadas con fármaco se prepararon mediante el método de sonicación. Brevemente, se disolvieron 10 mg de DBZ y 10 mg de ATRA en 2 ml de una solución de cloroformo que contenía 50 mg de l-α-fosfatidilcolina de huevo (PC) y 2 mg de DSPE-metil (polietilenglicol) -2000 (mPEG ₂₀₀₀ ). El disolvente orgánico se secó mediante exposición a gas argón durante 20 min. A la mezcla de fármaco seco + lípidos se le añadió 80 mg de trimiristina (Tm) y se incubó a 65ºC durante 1 h. A esta mezcla de aceite, se le añadieron 5 ml de solución de poloxámero al 4% y se sonicó inmediatamente con sonda a 80 W durante 6 min. La emulsión resultante se enfrió en hielo durante 30 min. Las nanopartículas se sometieron a una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra 0.5 (corte de 3 kDa; Merck, Alemania) a 12000 × g durante 20 min. La cantidad de DBZ y ATRA libres en el filtrado se evaluó mediante el método de HPLC y se calcularon la eficiencia de carga y la capacidad de carga. Para el análisis de fármacos se utilizó un sistema de HPLC Waters que consta de una bomba binaria Waters 1525, un detector de UV Waters 2487, un detector de fluorescencia Waters 2475, un calentador de columna 1500 y una columna Symmetry C18. Para ATRA, la fase móvil consistió en acetonitrilo y ácido trifluoroacético en una relación 90/10 v / v a un caudal de 1 ml / min y detectado a 348 nm. Para DBZ, se utilizó acetonitrilo y fosfato de hidrógeno disódico 0,05 M en una relación 30/70 v / v que contenía 0,5% de TEA. El pH de la fase móvil se mantuvo a pH 3,7 y se utilizó un caudal de 1 ml / min.

Análisis de morfología y tamaño de partículas

La distribución del tamaño de partícula de la nanopartícula combinada fue evaluada por Malvern Zetasizer Nano ZS90 con un láser He-Ne (633 nm). Todas las muestras se diluyeron con agua destilada y los experimentos se realizaron a 24 ° C por triplicado. La morfología de la nanopartícula se evaluó mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM; JEOL JEM200CX a 120 kV). Las partículas diluidas se tiñeron con ácido fosfotúngstico al 2%, se secaron y se observaron bajo TEM.

Liberación in vitro de nanoformulaciones cargadas de fármacos

La liberación de fármacos encapsulados se evaluó mediante el método de diálisis. Se sellaron dos mililitros de nanopartículas cargadas con fármaco que contenían un equivalente de 1 mg de ATRA y 1 mg de DBZ en una membrana de diálisis (Spectra / Por, MWCO 3,5 kDa). El tubo de diálisis se colocó en 25 ml de tampón de liberación y se mantuvo a una rotación de 100 rpm a 37 ° C. En un intervalo de tiempo predeterminado hasta 72 h, se extrajo 1 ml de muestras y se reemplazó con tampón nuevo de igual cantidad. La cantidad de DBZ y ATRA se evaluó mediante el método HPLC como se describe anteriormente.

Análisis de captación celular y cultivo celular

Las células de melanoma cutáneo murino (B16F10) se adquirieron en China Infrastructure of Cell Line Resources (Beijing, China). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de la mezcla de antibióticos. Los medios se cambiaron regularmente cada 2 días y se cultivaron después de una confluencia del 90%. Para el análisis de la absorción celular, se sembraron células B16F10 en una placa de 6 pocillos durante 24 h de incubación. Las nanopartículas se cargaron con Coumarin-6 como rastreador fluorescente. El medio antiguo se retiró y se reemplazó con un medio nuevo que contenía las nanopartículas de cumarina-6-lípidos y se incubó durante 1 a 3 h en orden inverso. Las células se lavaron y se desecharon con un raspador de células. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min y el sedimento celular se resuspendió en 1 ml de PBS frío. Las muestras se evaluaron con un citómetro de flujo AccuriTM C6 (BD Co., EE. UU.).

Ensayo de citotoxicidad in vitro

El efecto citotóxico de ATRA, DBZ, D-LNF y RD-LNF libres en células B16F10 se evaluó mediante ensayo MTT. Las celdas (1 × 10 ⁴ ) se sembraron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se trataron primero con diferentes concentraciones de ATRA y DBZ libres y se ensayó su efecto anticanceroso en las células del melanoma. Seguido de, las células se trataron con una concentración fija de ATRA, DBZ, D-LNF y RD-LNF libres a 25 μg / ml y 50 μg / ml, respectivamente. Las células se incubaron durante 24 horas y luego el medio se retiró cuidadosamente y se lavó dos veces con PBS. Al final, las células se trataron con 100 µl de solución de MTT 5 mg / ml y se incubaron durante 4 h. El medio de cultivo se retiró con cuidado y se añadieron 100 µl de isopropanol y se incubó durante 15 min en condiciones de agitación. Los cristales de formazán disueltos se estudiaron a 570 nm usando un lector de microplacas. Las células no tratadas se utilizaron como control y los cálculos se realizaron en función de la viabilidad celular de los controles.

Ensayo de apoptosis:citómetro de flujo

Se evaluó el efecto de apoptosis de ATRA, DBZ, D-LNF y RD-LNF libres en células B16F10 después de la tinción con PE anexina V y kit de apoptosis basado en 7AAD. Las células se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad celular de 2 × 10 ⁵ células / pocillo y se incubó durante 24 h. Las células se trataron con equivalentes de 25 µg / ml de formulaciones de ATRA, DBZ, D-LNF y RD-LNF libres y las células no tratadas se consideraron como control. Después de 24 h de exposición al tratamiento, las células se tiñeron según el protocolo del fabricante. Se utilizó el citómetro de flujo AccuriTM C6 para la expresión de PE y 7AAD y se adquirieron un mínimo de 10.000 eventos en el citómetro de flujo. Las células PE positivas y 7AAD negativas fueron apoptóticas tempranas; Las células positivas para PE y para 7AAD fueron apoptóticas tardías.

Análisis del ciclo celular:citómetro de flujo

Las células se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad celular de 2 × 10 ⁵ células / pocillo y se incubó durante 24 h. Las células se trataron con equivalentes de 25 µg / ml de formulaciones de ATRA, DBZ, D-LNF y RD-LNF libres y las células no tratadas se consideraron como control. Después de 24 h, las células tratadas se lavaron y recolectaron mediante tripsinización y se fijaron con etanol al 70% durante 2 ha 4 ° C. Luego, las células se trataron con ribonucleasa para eliminar cualquier contaminación de ARN. Ahora, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) durante 30 min a 37 ° C en la incubadora. La fluorescencia de las células teñidas con PI se determinó mediante el citómetro de flujo AccuriTM C6. La fase del ciclo celular se dividió en subG1, G1, S y fase G2 / M.

Ensayo de formación de colonias

Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad celular de 2 × 10 ⁵ células / pocillo y se incubó durante 24 h. Las células se trataron con equivalentes de 25 µg / ml de formulaciones de ATRA, DBZ, D-LNF y RD-LNF libres. Las células tratadas se tripsinizaron, lavaron y contaron usando un contador de células. A continuación, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1500 células / pocillo. A continuación, las células se incubaron en condiciones ambientales de 37 ° C durante 12 días hasta que las colonias fueron visibles. Las células se lavaron con PBS y se fijaron con metanol a ácido acético en agua (1:1:8) durante 10 min, seguido de tinción con tinción violeta cristal al 0,1% durante 45 min. Luego, las células teñidas se observaron con un microscopio óptico.

Ensayo de migración celular

Para este ensayo se utilizó una cámara transwell de doce pocillos con un tamaño de poro de 8 µm. Para iniciar el estudio, 5 × 10 ⁴ Se sembraron células / pocillo en la cámara superior. El medio superior está desprovisto de FBS mientras que el medio de la cámara inferior consta de un 10% de FBS. Después de 24 h, la cantidad de células que migraron a la superficie inferior de la membrana se fijó y se tiñó con colorante violeta cristal al 0,5%. El número de células se contó en cinco campos que se seleccionaron al azar con un microscopio óptico; se registró y analizó el número medio de células.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± DE y se realizan por triplicado a menos que se mencione por separado y de otro modo. Se compararon dos grupos utilizando t no apareado pruebas, mientras que la comparación de más de dos grupos se realizó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Turquía. Las estadísticas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism y una diferencia de p <0,05 se consideró significativo.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de nanoformulaciones de lípidos cargadas con DBZ / ATRA

El tratamiento del melanoma sigue siendo un desafío importante y las opciones de tratamiento estándar, incluida la quimioterapia, la radioterapia o la resección quirúrgica, serán efectivas solo en los tumores sólidos acompañados de un pronóstico precario. La FDA aprobó medicamentos como el paclitaxel o su combinación, pero no logró mejorar el impacto general sobre la supervivencia del paciente y la cura del cáncer. La dacarbazina (DBZ) es el fármaco quimioterápico de primera línea aprobado por la FDA; sin embargo, DBZ adolece de malas propiedades fisicoquímicas y dio como resultado una tasa de respuesta decepcionante entre el 10 y el 25%. Para hacer frente a estos desafíos, hemos desarrollado una nueva estrategia terapéutica de combinación con ATRA y DBZ en nanoformulaciones de lípidos (Fig. 1). Presumimos que la combinación de dos componentes terapéuticos mejorará la eficacia antitumoral en las neoplasias malignas del melanoma. Vale la pena señalar que ATRA, aunque exhibe propiedades anticancerígenas, no produjo ningún efecto adverso en el entorno sistémico [23]. Como el DBZ es de naturaleza hidrófoba, hemos diseñado nanoformulaciones de lípidos que pueden incorporar de forma estable los fármacos hidrófobos en el núcleo de lípidos y se cargará ATRA como componente estructural de las nanopartículas. Las nanopartículas de lípidos que transportan los componentes terapéuticos ayudarán a distribuir en el tumor más profundo del cuerpo. La eficiencia de carga de DBZ y ATRA fue 91,2 ± 1,25% y 95,8 ± 1,14%, respectivamente. La capacidad de carga de DBZ y ATRA en RD-LNF fue de 7,07 ± 0,65% p / py 7,48 ± 1,05% p / p, respectivamente. Se observó que el tamaño de partícula de D-LNF era 121,5 ± 1,65 nm con un índice de polidispersidad (PDI) de 0,134 y un potencial zeta de -23,5 ± 0,85 mV. El tamaño de partícula de RD-LNF fue 138,2 ± 1,28 nm con un PDI de 0,159 y un potencial zeta de - 25,4 ± 0,58 mV. El aumento en el tamaño total de las partículas se atribuyó principalmente a la carga estructural de ATRA; sin embargo, el tamaño final de RD-LNF fue menor de 150 nm permitiendo la acumulación preferencial de los tumores de melanoma malignos debido al efecto EPR. Además, la presencia de PEG hidrófilo evitará la agregación de partículas y reducirá su captación por el sistema reticuloendotelial (RES) y, por lo tanto, mejorará su desempeño sistémico en el organismo. La carga de la superficie alrededor de - 25 mV conferirá una excelente estabilidad de almacenamiento. La morfología de las partículas se investigó mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM) (Fig. 2). Como se ve, tanto D-LNF como RD-LNF tienen un tamaño perfectamente esférico y están distribuidos uniformemente en la rejilla de cobre. La diferencia de tamaño entre D-LNF y RD-LNF fue consistente con la observación de DLS. La falta de partículas de desechos, partículas pequeñas y agregación indica el éxito del proceso de formulación.

Análisis de estabilidad y liberación de fármacos in vitro de D-LNF y RD-LNF

El RD-LNF exhibió una excelente estabilidad tanto en condiciones de pH 7,4 (PBS) como de suero (10% FBS) (Fig. 3a). El tamaño de partícula no mostró ningún aumento significativo en ambas condiciones a lo largo del período de estudio, lo que indica la estabilidad de las nanopartículas. La capacidad de liberación del fármaco de manera oportuna decide la eficacia de los sistemas de nanopartículas cargadas con fármaco. Hemos realizado la cinética de liberación de DBZ y ATRA de D-LNF y RD-LNF en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). Como se muestra en la Fig. 3b, no se observó liberación por ráfagas o liberación gradual del fármaco de ninguno de los sistemas de dos nanopartículas, lo que indica la carga estable en el núcleo de las nanopartículas y no en la superficie de las nanopartículas. No se observó ninguna diferencia significativa en la liberación de DBZ de D-LNF y RD-LNF, lo que indica que la presencia de ATRA no ralentizó ni alteró el patrón de liberación del fármaco. Un ligero retraso en la liberación del fármaco de DBZ de RD-LNF podría atribuirse al aumento de la longitud de la ruta atribuida al ATRA en la estructura lipídica. Es interesante notar que ATRA se lanzó significativamente más lento en comparación con DBZ en el sistema de portadora RD-LNF. Comenzaron a aparecer diferencias significativas después de 24 h hasta 72 h atribuidas principalmente a la naturaleza hidrófoba extrema del ATRA y a ser parte del componente estructural. En general, la falta de liberación explosiva y la liberación controlada de componentes terapéuticos beneficiarán al tratamiento del cáncer de melanoma.

Captación celular in vitro

La captación celular más alta o mejorada de la nanopartícula determina la eficacia terapéutica en las células cancerosas. Hemos realizado la captación celular de RD-LNF en células cancerosas B16F10 y se utilizó Coumarin-6 como rastreador fluorescente. Como se muestra en la Fig. 4, se observó una internalización notable de las nanopartículas después de 1 h de incubación de las nanopartículas y la captación aumentó constantemente hasta las 3 h. La notable captación de nanoformulaciones de lípidos es coherente con la mayor captación celular del sistema portador a base de lípidos. Se especuló que la difusión pasiva y el mecanismo basado en la endocitosis podrían ser responsables de la mayor captación celular. Las nanopartículas tras la endocitosis llegarán al lisosoma donde se liberan los fármacos encapsulados y exhibirán sus respectivas acciones farmacológicas.

Ensayo de citotoxicidad in vitro

El ensayo MTT se realizó en células B16F10 después del tratamiento con formulaciones respectivas para evaluar el efecto anticanceroso de agentes terapéuticos individuales (Fig. 5a). Al principio, se evaluó la citotoxicidad de DBZ y ATRA libres individuales. DBZ exhibió un efecto citotóxico dependiente de la concentración en las células de cáncer de melanoma mientras que ATRA exhibió un efecto citotóxico significativamente mayor en las células B16F10. A 100 μg / ml, DBZ exhibió una viabilidad celular de ~ 45% en comparación con ~ 22% de viabilidad celular para ATRA, lo que indica la excelente eficacia terapéutica de ATRA. Con el fin de demostrar que la coadministración de DBZ y ATRA podría inhibir potencialmente la progresión del cáncer, se trataron nanoformulaciones de lípidos cargadas con DBZ + ATRA (RD-LNF) para células de melanoma. Las nanoformulaciones de lípidos cargadas con DBZ (D-LNF) que contienen el fármaco de entidad única se utilizaron como grupo de referencia para resaltar la eficacia sinérgica de ATRA (Fig. 5b). Como se esperaba, a 25 μg / ml de concentración fija, ATRA mostró una viabilidad celular ligeramente menor en comparación con la de DBZ, mientras que el D-LNF basado en nanopartículas no mejoró el efecto anticancerígeno de DBZ y permaneció lejos de ser efectivo. Como se esperaba, RD-LNF mostró una viabilidad celular significativamente menor y un mayor efecto anticancerígeno en comparación con el de D-LNF, lo que indica un efecto terapéutico sinérgico aparente de los componentes duales hacia la muerte de las células cancerosas del melanoma. RD-LNF mostró un efecto anticanceroso significativamente mayor en comparación con el de cualquier otro grupo de tratamiento. Se podría esperar que la liberación lenta y sostenida de DBZ junto con la liberación lenta de ATRA del sistema nanoportador podría contribuir al efecto terapéutico sinérgico. En este estudio, la dacarbazina (DBZ) fue el principal fármaco quimioterapéutico y se empleó ATRA como componente estructural de las nanopartículas lipídicas, por lo que no creó un grupo separado para el R-LNF. Hemos estudiado el efecto anticancerígeno de ATRA y DBZ desnudos en las células cancerosas. Además, muchos informes publicados son prueba del efecto anticanceroso de ATRA; por lo tanto, hemos utilizado ATRA como un componente estructural que también podría mejorar la eficacia anticancerosa de las terapias encapsuladas de manera sinérgica.

Ensayo de formación de colonias

El ensayo de formación de colonias se realizó para evaluar el potencial de tumorigénesis de células de melanoma. Como se muestra, DBZ y ATRA libres tienen un papel limitado en la inhibición de la formación de colonias y, de manera similar, D-LNF fue ineficaz para controlar la formación de colonias (Fig. 6). Como era de esperar, la combinación de DBZ + ATRA dio como resultado una potenciación significativa de la inhibición de la formación de colonias en comparación con la de los fármacos libres individuales o las nanopartículas cargadas con un único fármaco. El ensayo de formulación de colonias reitera aún más la eficacia superior contra el cáncer de RD-LNF sobre los medicamentos libres.

Ensayo de apoptosis in vitro y análisis del ciclo celular

Se estudió la inducción de la apoptosis de las células B16F10 después del tratamiento con D-LNF y RD-LNF usando un citómetro de flujo después de teñir las células con la mezcla de Anexina V-FITC / PI (Fig. 7a). Como se muestra, ATRA y DBZ causaron solo el 10-12% de la apoptosis de las células cancerosas y muchas de las células permanecen intactas. Se observó un ligero aumento en las células apoptóticas tempranas después de que el tratamiento con D-LNF podría sugerir el efecto del portador de administración. Es importante destacar que RD-LNF indujo una mayor proporción de células de apoptosis con una mayor proporción de células en apoptosis tardía y apoptosis temprana, lo que indica la eficacia anticancerígena superior de las nanopartículas combinacionales. RD-LNF mostró que las células de apoptosis tardía aumentaron un 21,5% mientras que las células de apoptosis temprana aumentaron hasta un 18,3% y la proporción de células viables disminuyó de 95 a 52%, respectivamente, lo que sugiere que la combinación de DBZ + ATRA contribuyó a la apoptosis de las células cancerosas y podría inhibir la inhibición proliferativa de las células de melanoma B16F10. El efecto de apoptosis de las formulaciones se confirmó adicionalmente mediante análisis del ciclo celular. Como se muestra, DBZ y ATRA exhibieron un ligero aumento en la población sub-G0 mientras que D-LNF mostró una población sub-G0 relativamente más alta en comparación con la de los fármacos libres individuales (Fig. 7b). En particular, se observó un aumento notable en la población sub-G0 para las células de melanoma tratadas con RD-LNF, lo que indica la apoptosis marcada de las células cancerosas. Es bien conocido que DBZ podría aumentar los niveles de expresión de p21, caspasa-3 y PARP escindida y, por lo tanto, promueve la apoptosis celular a través de la estabilización de p53. La inducción de p53 inhibirá la progresión del ciclo celular [24, 25]. Se espera que la combinación de DBZ + ATRA potencie el mecanismo de apoptosis y detenga la progresión del ciclo celular de las células cancerosas y muestre la eficacia contra el cáncer.

Efecto de las nanopartículas combinacionales en la migración celular

La migración celular se analizó a través de la membrana transwell y se observó la migración de las células mediante tinción con violeta cristal (Fig. 8). Después de 24 h, las células de control casi habían logrado la migración completa de las células cancerosas. ATRA parece inhibir la migración celular relativamente mejor que las células tratadas con DBZ. D-LNF también mostró un efecto inhibidor notable sobre la migración celular; sin embargo, el efecto de migración celular más notable se observó en células de melanoma B10F16 tratadas con RD-LNF. Como se ve, se observó una disminución múltiple en la migración celular en comparación con la de las células de control no tratadas. Estos resultados demuestran claramente que RD-LNF reduce potencialmente la proliferación de células malignas aberrantes y suprime la migración celular de manera eficiente.

Disponibilidad de datos y materiales

No aplica

Abreviaturas

DBZ:: Dacarbazina
ATRA:: Ácido retinoico totalmente trans
D-LNF:: Nanoformulaciones de lípidos cargadas con DBZ
RD-LNF:: Nanoformulaciones de lípidos cargadas con ATRA / DBZ
SLN:: Nanopartículas de lípidos sólidos

HEMT AlGaN de doble canal de alto rendimiento con densidad de corriente de drenaje mejorada y alto voltaje de ruptura Electrodos sin aglutinantes y su aplicación para baterías de iones de litio

Nanomateriales

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