Estudios preliminares sobre nanopartículas biodegradables de óxido de zinc dopadas con Fe como forma potencial de suministro de hierro al organismo vivo

Material y métodos

Síntesis de nanopartículas

Se sintetizaron nanopartículas de óxido de zinc dopadas con hierro (ZnO:Fe NPs) mediante técnica hidrotermal de microondas. El método está bien establecido, es relativamente económico, biofriendly e industrialmente escalable, capaz de introducir diferentes iones extraños como dopantes funcionales [21,22,23,24,25], en una variedad de óxidos [26,27,28]. La concentración de hierro en las presentes nanopartículas se fijó en un 5% molar. La síntesis se realizó a partir de nitratos (V):Zn (NO ₃ ) ₂ · 6H ₂ O (99%, Sigma – Aldrich) y Fe (NO ₃ ) ₃ · 9H ₂ O (96%, Carl Roth). Hemos probado varios proveedores y elegimos los que ofrecen el producto más uniforme que no contiene niveles medibles de sobras no solubles. Los compuestos se disolvieron en agua destilada:17,63 g de nitrato de zinc (V) y 1,25 g de nitrato de hierro (III) (V). Después, la solución transparente se alcalinizó usando una solución acuosa de amoníaco al 25% (Carl Roth) a pH 8. El residuo rojo resultante se lavó usando un embudo Büchner, con ~ 1 l de agua destilada y se filtró con succión. El precipitado se colocó en un recipiente de teflón de 100 ml, se llenó con agua hasta el 80% del volumen y luego se cerró en la cámara del reactor Ertec Magnum II. El proceso hidrotermal por microondas se llevó a cabo a 4 MPa durante 20 min. Después de la reacción, se recogió el producto rojo pálido y se secó durante la noche a 60 ° C.

Caracterización de nanopartículas

La caracterización del producto se realizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), espectroscopía de fotoluminiscencia (PL) y catodoluminiscencia (CL) y análisis elemental de dispersión de energía (EDX). Las mediciones SEM se realizaron con microscopio Hitachi SU-70 de alta resolución (1 nm), equipado con detector de radiación característico y sistema de catodoluminiscencia GATAN Mono CL3 en modo de electrones secundarios (SE) y transmisión (TE). Los espectros de excitación y emisión de fotoluminiscencia se registraron utilizando espectrofluorímetro Horiba / Jobin-Yvon Fluorolog-3, equipado con una lámpara de xenón como fuente de excitación y fotomultiplicador Hamamatsu R928P. La dispersión dinámica de la luz (DLS) y el potencial zeta se midieron con el sistema de caracterización de partículas DelsaMax Pro. El análisis de termogravimetría (TGA) se realizó usando termogravímetro NETZSCH STA 449 F1 Júpiter bajo flujo de argón. Las mediciones de SEM se realizaron después de la deposición de las nanopartículas en la malla de cobre 400 recubierta de policarbonato de Agar. La muestra se suspendió en agua destilada usando el procesador ultrasónico Sonics VCX500, y luego se colocó una gota de la suspensión sobre la malla y luego se secó. La muestra se preparó después de 2 h de sedimentación de partículas más pesadas.

Modelo in vitro

Para el estudio actual, se utilizó la línea celular Caco-2 (células de adenocarcinoma de colon caucásico), como modelo de células epiteliales del tracto gastrointestinal. La línea celular se obtuvo de The European Collection of Authenticated Cell Cultures — ECACC (Sigma – Aldrich, Cat. No. 86010202). Las células se sembraron a 0,5 × 10 ⁶ células / ml en placas de 6 o 96 pocillos y se mantienen en la modificación de Dulbecco del medio de Eagle, DMEM (Gibco), suplementado con suero bovino fetal al 10%, FBS (Gibco), 1% de aminoácidos no esenciales, NEAA (Gibco ), 1% de penicilina-estreptomicina-neomicina-PSN (Gibco) y 0,2% de bicarbonato de sodio (Gibco) a 37 ° C y 5% de CO ₂ . Cuando se observó una confluencia del 95-100%, se retiró el medio de cultivo celular y se añadió una suspensión de NP de ZnO:Fe en medio de crecimiento fresco. Las células se incubaron con cuatro concentraciones diferentes de NP de ZnO:Fe (1,0; 0,1; 0,01 y 0,001 mg de NP de ZnO:Fe / ml) durante 24 ha 37 ° C y 5% de CO ₂ .

Análisis de viabilidad celular

Se evaluó la viabilidad celular para Caco-2 usando dos métodos:ensayo XTT y tinción con azul tripán. Todos los reactivos necesarios para el ensayo XTT se proporcionaron a partir del kit comercial (Cell Proliferation Kit II, Roche). Después de la incubación de células cultivadas en placa de 96 pocillos con diferentes concentraciones de NP de ZnO:Fe, las células se incubaron con 50 μl de mezcla de marcaje XTT durante 4 ha 37 ° C y 5% de CO ₂ . Posteriormente, se evaluó la concentración de formazán con el método espectrofotométrico. La absorbancia se midió a 470/650 nm y los resultados se correlacionaron con el número de células viables. En el siguiente experimento, se supuso que el resultado de absorbancia más alto era la viabilidad del 100% de las células. Los resultados finales se calcularon en base a cuatro repeticiones de experimentos separados ( n =4).

Para realizar la tinción con azul tripán, después de que las células cultivadas en placas de 6 pocillos se incubaron con diferentes concentraciones de NP de ZnO:Fe, se recolectaron las células (tripsina al 0.05% y EDTA al 0.2% durante 10 min), se centrifugaron y se volvió a colocar el sedimento. suspendido en 1 ml de medio de crecimiento. Se mezclaron cien microlitros de solución estéril de azul de tripán al 0,4% con 100 µl de suspensión celular. Se cargaron diez microlitros de muestra en el portaobjetos de recuento y se analizaron usando el software JuLi Br Couting (NanoEnTek) para evaluar el número de células viables. Los resultados finales se calcularon en base a tres repeticiones de experimentos separados ( n =3).

Modelo animal

Para los fines de este estudio preliminar, los ratones Balb-c machos adultos ( n =6) se mantuvieron individualmente en condiciones de vida estándar y controladas (período de luz-oscuridad de 12/12 h, 25 ° C, humedad del 30%) con comida estándar y agua (proporcionada ad libitum). Todos los procedimientos fueron aceptados por el Comité de Ética Local, acuerdo no. WAW2 / 59/2017. Después de 7 días de aclimatación, se administró una suspensión de NP de ZnO:Fe en agua (10 mg / ml; 0,3 ml / ratón) mediante sonda oral (IG) a los animales del grupo experimental ( n =4). Los ratones del grupo de control recibieron 0,3 ml de agua potable por IG ( n =2). Durante el experimento, no notamos ningún cambio de comportamiento en los animales probados ni anomalías en los tejidos. Después de 24 h, los ratones del grupo experimental y de control se sacrificaron en CO ₂ -O ₂ cámara (CO2 Box, Bioscape, Merazet) con posterior recogida de tejidos. La mitad de las muestras recién recolectadas se congelaron a -20 ° C para la espectrometría de absorción atómica (AAS). La segunda mitad de los tejidos se fijaron en formalina tamponada al 4% y se transfirieron a etanol al 70% (después de 24 h). Posteriormente, las muestras se deshidrataron en las concentraciones crecientes de etanol, se incrustaron en parafina (Leica TP1020, Leica EG1150) y se prepararon portaobjetos microscópicos de 6 μm de espesor (o 4 μm de espesor para exámenes histopatológicos) con micrótomo (Leica RM2255).

Acumulación de hierro evaluada por tinción de Perl

Se tiñeron portaobjetos de microscopía de bazo, hígado y cerebro con el método de Perl (azul de Prusia) para detectar la presencia de hierro. Las muestras se desparafinaron y rehidrataron en agua destilada, luego se colocaron en una solución de trabajo con partes iguales de ferricianuro de potasio al 5% (Sigma-Aldrich) y ácido clorhídrico al 5% (Sigma-Aldrich) y se tiñeron durante 30 min. Posteriormente, las secciones se enjuagaron en agua y se tiñeron con rojo nuclear resistente (Sigma-Aldrich) durante 5 min, se enjuagaron con agua y se montaron debajo de los cubreobjetos con Permount (Fisher Scientific). Las imágenes de las muestras teñidas se tomaron utilizando el microscopio Olympus BX60 y el software de adquisición de imágenes Cell ^ P. De cada muestra analizada, se seleccionaron 16 imágenes elegidas al azar para exámenes adicionales con MicroImage v.4.0 (Olympus) de acuerdo con el protocolo de análisis de imágenes en el hogar [29]. Para los exámenes del bazo, solo se tuvo en cuenta la pulpa roja dentro del tejido durante los análisis. El contenido de hierro se calculó como una relación entre el área y la intensidad de las tinciones positivas para el hierro (color azul) con el área de los núcleos celulares dentro de una imagen.

Concentración de hierro en tejidos analizados medida con espectrometría de absorción atómica

Se prepararon muestras de tejido previamente recolectadas, almacenadas a -20 ° C y posteriormente descongeladas para una evaluación cuantitativa adicional de la concentración de hierro con el método de espectrometría de absorción atómica (AAS), de acuerdo con el protocolo descrito en detalles antes [24]. Brevemente, los tejidos se pesaron y se mantuvieron durante> 16 h en la solución que contenía 5 ml de ácido nítrico al 65% y 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30% (Merck). Posteriormente, las muestras se mineralizaron en el sistema de microondas Ethos 900 (Milestone, EE. UU.) En una solución líquida y se evaluaron con AAS (Perkin-Elmer) para determinar el contenido de hierro.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos en el estudio se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM). Para la evaluación estadística de la acumulación de hierro obtenida con la tinción de Perl, se realizó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey-Kramer para todos los grupos. Para evaluar una diferencia significativa entre los grupos de control y experimentales de los análisis AAS, un t no apareado se utilizó la prueba. Las diferencias significativas entre los grupos de control y experimentales en experimentos in vitro se evaluaron utilizando ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Los análisis estadísticos se calcularon con GraphPad InStat 3.10. Para todas las pruebas, los resultados obtenidos se consideraron estadísticamente significativos con P ≤ 0.05 y P ≤ 0.01 y P ≤ 0,001 como alta y extremadamente significativa.

Resultados

Caracterización de nanopartículas

Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de nanocristales de ZnO:Fe cristalizados en proceso hidrotermal de microondas se muestran en la Fig. 1. El polvo seco almacenado después de la síntesis se dispersó en agua usando un baño ultrasónico y luego se depositó sobre la malla de cobre 400. La suspensión resultante del tratamiento ultrasónico se dejó durante 2 h para la aglomeración y sedimentación de los granos grandes. En la muestra comúnmente se ven cristales de ZnO en forma de prismas hexagonales alargados. Los cristales se alargan en la dirección del crecimiento de los planos c— [001]. La intersección de los prismas se ve claramente en la imagen:los hexágonos tienen un tamaño de 50 a 100 nm. Básicamente, las nanopartículas se aglomeran y forman estructuras más grandes. En la Fig. 1b, se muestra tal estructura de cristales de ZnO:Fe fuertemente aglomerados y agrupados. La muestra también está compuesta por granos no uniformes cuya distribución de tamaño contiene entre cientos de nanómetros y micrómetros. No hay indicios claros de que exista una fase separada distinta a la de ZnO, lo que sugiere la ausencia de cristalización en una fase a base de hierro (p. Ej., Óxido de hierro) [30].

Imágenes de microscopía electrónica de barrido de NP de ZnO:Fe depositadas sobre una malla de cobre después de la sedimentación de grandes agregados. Ampliación 100 kx ( a ) y 20 kx ( b ). Se colocó gota a gota una suspensión que contenía 1 mg de nanopartículas de ZnO por mililitro de agua sobre la malla de cobre recubierta de policarbonato para permitir observaciones de microscopía de barrido de alta resolución

Se realizaron análisis termogravimétricos (TGA) y calorimetría diferencial de barrido (DSC) bajo el flujo de argón desde temperatura ambiente hasta 800 ° C y los resultados obtenidos se muestran en la Fig.2. La primera pérdida de masa tuvo lugar hasta 200 ° C y provocó una disminución de la masa de la muestra en un 4,78% con respecto a su masa inicial. La segunda pérdida se registró entre 200 y 400 ° C y su valor ronda el 7,36%. No hubo otras disminuciones de masa hasta 800 ° C. El primero estaba relacionado con la evaporación de las moléculas de agua adsorbidas en la superficie y el segundo probablemente fue causado por una reducción de los grupos hidroxilo. La curva DSC muestra un pico endotérmico a 118,3 ° C (-0,6175 mW / mg, evaporación de agua) y un pico exotérmico a 283,1 ° C (0,4356 mW / mg, descomposición de grupos hidroxilo). Un pequeño efecto relacionado con la descomposición indicó que la cristalización casi completa de las nanopartículas de ZnO:Fe ocurrió en el proceso hidrotermal de microondas.

TGA / DSC de ZnO:NP de Fe calentadas en argón

La Figura 3 muestra los espectros de fotoluminiscencia a temperatura ambiente de las NP de ZnO:Fe. El espectro de emisión (Fig. 3a) consta de dos características:luminiscencia de borde de banda cercana estrecha (NBE) de baja intensidad y luminiscencia de emisión de nivel profundo amplio (DLE) muy intensa. Primero uno alcanza su punto máximo a ~ 380 nm mientras que el segundo a 600 nm. El dominio de la intensidad del DLE en el espectro sugiere que los nanocristales obtenidos fueron fuertemente defectuosos en el nivel cristalográfico [31, 32, 33]. El espectro de excitación (Fig. 3b) indica el mecanismo de emisión desde niveles profundos en la banda prohibida de ZnO:Fe.

Emisión de fotoluminiscencia (PL) ( a , λ _exc =260 nm) y excitación ( b , λ _em =595 nm) espectros de ZnO:Fe NPs. Las muestras se vertieron sin apretar en la matriz de aluminio y luego se reequilibraron para permitir las mediciones de PL. Los segundos y más altos órdenes de longitud de onda de excitación se filtraron con un filtro de paso de banda espectral

El espectro de catodoluminiscencia de las NP de ZnO:Fe se muestra en la Fig. 4; La relación de intensidad DLE / NBE es ≈ 25. Picos de banda NBE a aprox. 380 nm, la banda DLE contiene cuatro componentes con un pico a ~ 570, 625, 653 nm y muy débil a 770 nm. Según McCluskey y Jokela [34], la banda de 570 nm está relacionada con las vacantes de oxígeno, mientras que otras se asignaron a las vacantes de zinc en la red de tipo wurtzita [35].

Espectro de catodoluminiscencia (CL) de NP de ZnO:Fe. Se granuló nanopolvo seco para obtener el espectro de CL procedente de un gran volumen de la muestra. Las bandas mostradas ilustran la cantidad y calidad de los defectos cristalográficos presentes en los nanocristales de óxido de zinc

La cantidad de hierro en la muestra se determinó mediante dos técnicas:espectroscopía de absorción atómica (AAS) y espectroscopía de rayos X de energía dispersiva (EDX). En el caso de AAS, la suspensión preparada de manera similar a la utilizada en el experimento con roedores se analizó para indicar 3,98% atómico de Fe en el ZnO:Fe. Mediante el método EDX, se analizó el polvo seco en la malla de cobre para encontrar una concentración de hierro de 4.5% a. en relación con los iones zinc.

Las propiedades de la suspensión se midieron utilizando métodos DLS y TEM, y la distribución de los diámetros de las nanopartículas se muestra en la Fig. 5. La distribución es bimodal:para una población, el diámetro más frecuente alcanzaba un pico entre 20 y 100 nm (TEM), así como entre 50 y 100 nm (TEM). 200 nm (DLS). La segunda población contiene una cantidad menor de objetos más grandes de 100 a 500 nm (TEM) y ca. 150–500 nm (DLS). El carácter bimodal de las nanopartículas se observa claramente mediante ambos métodos mostrados. La alta dispersión de tamaños en la población más grande indica que corresponde a nanopartículas aglomeradas. Las estadísticas que se muestran para diámetros superiores a 100 nm indican muchas formas diferentes en que las nanopartículas de ZnO:Fe se aglomeran. Las nanopartículas en suspensión de agua se cargaron negativamente según lo revelado por el potencial zeta por debajo de 0 V. El valor de aproximadamente -40 mV también indicó que la suspensión de agua final era estable y las nanopartículas no tenían afinidad por la aglomeración.

Distribución de los radios hidrodinámicos de las nanopartículas medidos en suspensión de agua (puntos) y tomados directamente de las imágenes TEM a lo largo de los lados más cortos y más largos de los nanocristales (ver texto). Las nanopartículas se transfirieron a una suspensión de agua mediante un cuerno ultrasónico de alta potencia. La concentración de material seco fue de 1 mg por 1 ml de agua. Una vez finalizada la sedimentación, se realizaron diez mediciones de movilidad para obtener una movilidad creíble frente a la gráfica del diámetro de las nanopartículas. Los tamaños de TEM se tomaron directamente de las imágenes:a lo largo de c eje (lados más largos de los cristales de ZnO) y a lo largo de m y a ejes (lados más cortos de los cristales)

Evaluación toxicológica in vitro de Nanopartículas de ZnO:Fe

Ambos análisis de viabilidad celular (XTT y Trypan Blue) revelaron una disminución de la absorbancia de las células Caco-2 incubadas con ZnO:Fe NP, que se correlacionó directamente con el número de células viables. Se observaron cambios estadísticamente significativos solo después de 24 h de exposición de las células incubadas a las concentraciones más altas de NP (1,0 y 0,1 mg / ml), mientras que los niveles fisiológicos de concentración de NP (0,01 y 0,001 mg / ml) no tuvieron un efecto significativo en los cultivos celulares. (Figuras 6 y 7).

Viabilidad celular (línea Caco-2) probada por el método XTT. Las células se expusieron durante 24 h a una suspensión de NP de ZnO dopadas con hierro en diferentes concentraciones como sigue:0,001 mg / ml; 0,01 mg / ml; 0,1 mg / ml; y 1 mg / ml. Los resultados representan el porcentaje medio de células viables (± SEM) para los grupos de control y experimentales ( n =4). Diferencia significativa de ** P ≤ 0.01 vs. control fue marcado en el gráfico

La viabilidad celular (línea Caco-2) probada con tinción con azul tripán. Las células se expusieron durante 24 h a una suspensión de NP de ZnO dopadas con hierro en diferentes concentraciones como sigue:0,001 mg / ml; 0,01 mg / ml; 0,1 mg / ml; y 1 mg / ml. Los resultados representan el porcentaje medio de células viables (± SEM) para los grupos de control y experimentales ( n =3). Diferencia significativa de ** P ≤ 0.01 vs. control fue marcado en el gráfico

Distribución de hierro en modelo animal

Para evaluar la accesibilidad al hierro in vivo de ZnO:Fe NP, ratones ( n =4) recibieron por vía oral una suspensión de ZnO:Fe NP y después de 24 h, los animales se escarificaron con una mayor recolección de tejidos cruciales. La evaluación cuantitativa del contenido de hierro dentro de los tejidos examinados se analizó con el método AAS para todos los órganos recolectados y se calculó con el software Micro Image (basado en la tinción de Perl) para los tejidos del hígado, el bazo y el cerebro. Presentados en la Fig. 8, los datos muestran un nivel aumentado de contenido de hierro (frente al control) en los tejidos del corazón, músculo esquelético, bazo e intestino delgado 24 h después de la administración oral de NP de ZnO:Fe (sin aumento estadísticamente significativo). En el caso del hueso, el nivel medio de hierro dentro del grupo experimental fue solo ligeramente más alto que en el resultado de control. El contenido de hierro en los tejidos del hígado y el cerebro aumentó significativamente ( P ≤ 0.01) 24 h después de IG de ZnO:Fe NPs, vs grupo control (Fig.8). En los riñones, el tejido adiposo visceral y subcutáneo y los pulmones, los niveles de Fe descendieron 24 h después de la administración de NP de ZnO:Fe.

Distribución de hierro dentro de los tejidos analizados 24 h después de la administración de IG de NP de ZnO:Fe. Los datos representan un porcentaje medio de Fe en los órganos analizados del grupo experimental ( n = 4) comparado con el grupo de control (100% - línea horizontal). El contenido de hierro se analizó con AAS. Diferencia significativa de ** P ≤ 0,01 frente al control

La evaluación del contenido de hierro teñido con el método de Perl en el hígado reveló una ( P ≤ 0,001) aumento del nivel de Fe en todos los animales experimentales frente a los de control (Fig. 9b). De manera similar, los resultados obtenidos para la pulpa roja del tejido del bazo mostraron una ( P ≤ 0,001) aumento del contenido de hierro en todos los animales experimentales frente a los de control (Fig. 10b). Los datos obtenidos del análisis de tejido cerebral indicaron que no hubo aumento de Fe en el grupo experimental 24 h después de la IG de ZnO:Fe NP (Fig. 11b).

Contenido de hierro en el hígado calculado con la tinción de Perl y el software MicroImage. Los resultados se calcularon como una relación entre el área y la intensidad de las tinciones positivas para el hierro y el área de los núcleos celulares. Los datos se presentan como resultado medio (± SEM) para cada animal examinado ( a ) y como valor medio (± SEM) para los grupos de control y experimentales ( b ). Diferencia significativa de * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0,01 y *** P ≤ 0,001

Contenido de hierro en la pulpa roja del bazo calculado con la tinción de Perl y el software MicroImage. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ). Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ). The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens

Discussion

As was mentioned in the “Introduction” section, the iron deficiency is a considerable nutritional disorder in human population, as well as in other mammalian species [3, 7, 8]. Consequently, an implementation of new, more efficient and safe iron supplementation strategy seems to be highly desirable. Currently presented results come from preliminary studies aimed at further, detailed investigations related with potential usage of biodegradable ZnO NPs doped with Fe as a novel strategy for iron supplementation. As was confirmed previously, in-house manufactured zinc-based NPs undergo very efficient absorption after their oral administration with further, rapid distribution to major organs and tissues in the living organism [22,23,24]. Moreover, we reported that these nanostructures demonstrated bio-safety and biodegradability within the body along with fast clearance from the organism [36]. Employed in the current study, the oral way of NP administration provides a highly efficient way of fast delivery of the exogenous nanostructures to the body, based on persorption process [37, 38]. Furthermore, this strategy decreases chance of eventual toxic effects related with administration of iron-doped substances, because of the existence physiological “security mechanisms” related to both Zn and Fe absorption from the gastrointestinal tract. This crucial, physiological pathways of iron distribution may be avoided in case of intravenous/intramuscular application iron-doped substances [14], which can result in increased possibility of occurrence iron-related toxic side effects. The examination of the internalization pathways of the nanoparticles, their dynamics, and cellular systems involved in the process is being currently studied in the frame of other publication. In the current paper, we decided to show overall effect of our nanoparticles on living organism, focusing on the effect of iron.

Toxicity of nanostructures may be related with various features of material, not only with chemical composition, but also with e.g. size, shape, or their ability to aggregate [39]. Nevertheless, it was confirmed that smaller NPs were better absorbed than bigger one and high surface-to-volume ratio makes the particles of some metals exceptionally reactive and cytotoxic [40, 41]. Nanostructures were able to enter cells and affect their components, which altered the viability of cells [42, 43]. In one of the previous investigations on cytotoxicity of ZnO or FeO NPs, authors did not observe toxic effects (based on ability of examined cells to grow and divide), even in high doses of NPs [44]. Presented here is a study performed on Caco-2 cell line, as a model of epithelial cells of the gastrointestinal tract, revealing a low toxicity of used nanomaterials. ZnO:Fe NPs in small/physiological doses (0.001 mg/ml and 0.001 mg/ml) did not alter the viability of cells (Figs. 6 and 7). Following the incubation of Caco-2 cells with high doses of ZnO:Fe NPs, a statistically significant decrease of viability was observed. However, IC50 (the half maximal inhibitory concentration), as a measure of the effectiveness of a substance in inhibiting a specific biological or biochemical function, still remained surprisingly high—around 1 mg/ml (Figs. 6 and 7). Observed drop of cell viability was probably associated with the physical deposition of nanoparticles on the surface and overstress of the cells rather than the cytotoxic effect related to the nanoparticles themselves. In another study, authors concluded decrease IC50 of cells from cancer cell line following incubation with ZnO and ZnO:Fe3O4 NPs and relatively low cytotoxicity effect (and non-dose-depended) of examined NPs on noncancerous cells [45]. Similar observations were also reported for ZnO and platinum NPs [46, 47]. Nevertheless, further examinations on chronic toxicity profile of such composites including antioxidant activity profiling, production of reactive oxygen species (ROS), and using another cells and cell line must be performed.

Obtained in the in vivo experiment, results indicated a rapid distribution of ZnO:Fe NPs to tissues mostly related with iron homeostasis (Figs. 8, 9, and 10). Similar studies, concerning the bioavailability of iron from “nano” form, were mostly performed on anemic animals or examined following the iron depletion period [18, 19, 48], where our preliminary studies were carried out on healthy, normally maintained mice. Comparison of data presented in the current work with similar studies may be misleading because of differences in employed NPs e.g. their size, shape and compound or route, dose, and frequency of their administration to animals. Results of iron level in the liver showed significantly increased level at 24 h after application of ZnO:Fe NPs, comparing with control (Figs. 8 and 9). Iron accumulation was visible in hepatocytes of liver tissue (Fig. 12), where the major storage site of the element takes place [49]. Similarly, previous studies with intraperitoneally injected iron oxide, magnetic NPs to rats also resulted in 55% accumulation of these nanomaterials in the liver at 6 h following injection [50]. Likewise, the spleen level of iron in the current study was clearly higher in experimental group, than within control (Figs. 8 and 10). Interestingly, tendency of iron accumulation was detected around blood vessels within the spleen, which might indicate the transfer of ZnO:Fe NPs from general bloodstream into the tissue (Fig. 13b, d). Primary accumulation of nanostructures within the liver and spleen after their application might also be attributed with clearance via mononuclear phagocytes in these tissues, as was also postulated previously [50,51,52].

In case of brain tissue, the measurement of total iron level (AAS method) showed significantly higher level of the element in animals with previously administered ZnO:Fe NPs (Fig. 8), which was not confirmed by analysis based on Perl’s staining (Fig. 11). Inconsistency between both, employed in the study methods, may be related with sensitivity of Perl’s staining. This histological method of iron visualization is dedicated to detect iron aggregates. Iron contained in the “nano” form, additionally distributed within the tissue without physiological deposits of these elements, might not be sensitive enough to stain these extremely small deposits of iron. Possibility of overcoming the blood-brain barrier with manufactured by us nanostructures was already described [23, 24, 53]. In another study, with intraperitoneally administered superparamagnetic maghemite iron oxide NPs to mice, no accumulation of iron in experimental group was detected, nor within brain or heart tissues, which is inconsistent with our results [52]. Another study, focused on a distribution pattern of iron oxide magnetic NPs within living organism, indicated similar circulation mechanism of nanostructures as in our study—increased level of Fe within the brain and heart after administration of NPs [51]. Increased level of iron in heart tissue may be caused by presence of ZnO:Fe NPs in the general blood stream and consequently its higher level within the tissue. Likewise, higher level of iron within a skeletal muscle detected in AAS analyses is probably related with intensive blood circulation within this muscle and in case of small intestine, the improved content of iron is caused by residues of orally administered NPs.

Conclusiones

In conclusion, we performed the preliminary study on the distribution of biodegradable ZnO:Fe NPs as a perspective, new supplementation strategy in iron deficiency. Deposition of iron in the body of mice following oral administration of the nanostructures was detected within the crucial tissues, where the major storage site of the element takes place. We assumed that obtained in the study results might indicate the biodegradable ZnO:Fe NPs as a good carriers of exogenous iron in the living body. However, further research is needed to completely understand the exact mechanisms of the deposition, elimination, and influence of ZnO:Fe NPs on the body.

Disponibilidad de datos y materiales

The conclusions of the following study are based on the data presented in this manuscript.

Abreviaturas

NP:

Nanopartículas

ZnO:Fe NPs:

Zinc oxide nanoparticles doped with iron

IG:

Intra-gastric

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

PL:

Photoluminescence spectroscopy

CL:

Cathodoluminescence spectroscopy

DLS:

Dispersión de luz dinámica

Caco-2 cells:

Caucasian colon adenocarcinoma cells

DMEM:

Dulbecco’s modification of Eagle’s medium

FBS:

Suero fetal bovino

NEAA:

Non-essential amino acids

PSN:

Penicillin–streptomycin–neomycin

EDTA:

Ácido etilendiaminotetraacético

AAS:

Atomic absorption spectrometry

SEM (in statistical analysis):

Standard error of the mean

Nanocables de Si tipo p grabados para una descomposición eficiente del ozono Efecto de los defectos subsuperficiales inducidos por el mecanizado sobre la evolución de la dislocación y las propiedades mecánicas de los materiales a través de la nano indentación