Adaptación de las perturbaciones morfomecánicas de la célula mediante nanopartículas de óxido metálico

Métodos

Síntesis de SiO amorfo ₂ NP

La microemulsión ternaria W / O se preparó a temperatura ambiente mezclando agua, un disolvente orgánico (ciclohexano, J.T. Baker), un tensioactivo (Triton X-100, Sigma-Aldrich) siguiendo los métodos de Malvindi et al. [25]. Brevemente, se mezclaron 880 μL de Triton X-100, 3.75 mL de ciclohexano, 170 mL de agua y 50 μL de TEOS (98%, Sigma-Aldrich) y se agitaron durante 30 min. Posteriormente, 30 μL de NH ₄ Se añadió OH (28,0-30,0%, Sigma-Aldrich) a la microemulsión. Después de 24 h, la suspensión se separó por centrifugación (4500 rpm) seguido de cinco lavados en etanol (98%, Sigma-Aldrich) y agua milliQ. Luego, las nanopartículas se dispersaron en agua.

Síntesis de TiO ₂ NP

TiO ₂ Las NP se prepararon siguiendo el método sol-gel descrito por Leena et al. [30] con algunas modificaciones. Brevemente, se añadió gota a gota isopropóxido de titanio (IV) (TTIP; Sigma-Aldrich al 99,9%) en una solución de etanol y agua milliQ (5:1:1) con agitación en condiciones ácidas (pH 3). Las NP se incubaron durante 5 ha 30 ° C primero y luego a 430 ° C durante 3 h para obtener un nanopolvo blanco.

Caracterización de TEM

Las caracterizaciones por microscopía electrónica de transmisión (TEM) se llevaron a cabo con un microscopio JEOL Jem 1011, operando a un voltaje de aceleración de 100 Kv (JEOL USA, Inc.). Las muestras de TEM se prepararon dejando caer una solución diluida de NP en agua sobre rejillas de cobre recubiertas de carbono (Formvar / Carbon 300 Mesh Cu).

Mediciones de potencial ζ y DLS

El tamaño hidrodinámico promedio y el potencial zeta de SiO ₂ NP y TiO ₂ Los NP se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) y mediciones de potencial ζ realizadas en un Zetasizer Nano-ZS equipado con un láser HeNe de 4.0 mW que opera a 633 nm y un detector de fotodiodo de avalancha (Modelo ZEN3600, Malvern Instruments Ltd., Malvern, REINO UNIDO). Las medidas se realizaron a 25 ° C en soluciones acuosas y en medio de cultivo celular (DMEM, alto contenido de glucosa, Sigma-Aldrich) suplementado con FBS (Sigma-Aldrich) al 10% y 20% pH 7). Cada muestra se analizó tres veces, utilizando dos réplicas técnicas independientes, para obtener los valores promedio de las mediciones de DLS y el potencial ζ.

Caracterización XRD

Difracción de rayos X en polvo (XRD) para análisis de fase cristalina de TiO ₂ Las NP se realizaron en un difractómetro Rigaku en geometría de reflexión de Bragg-Brentano utilizando radiación Cu-Ka filtrada. Los patrones de XRD se registraron en el rango de 2Q ¼ 20–80 por escaneo por pasos, usando incrementos de 2Q de 0.02 y un tiempo de conteo fijo de 2 s / paso.

Cultivo celular

Se mantuvieron Caco-2 (ATCC® HTB-37 ™) y A549 (ATCC® CCL-185 ™) en DMEM con glutamina 50 µM, suplementado con 100 U / mL de penicilina y 100 mg / mL de estreptomicina. El porcentaje de FBS fue del 10% para A549 y del 20% para las células Caco-2. Las células se incubaron en una atmósfera controlada humidificada con una proporción de aire / CO ₂ del 95 al 5%. , a 37 ° C.

Determinación de la absorción intracelular de SiO ₂ NPS y TiO ₂ NP

10 ⁵ Se sembraron células Caco-2 y A549 en 1 mL de medio en una placa de seis pocillos. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, el medio se reemplazó con medio fresco que contenía el SiO ₂ NP y TiO ₂ NP, en concentraciones de 15 μg / ml y 45 μg / ml. Después de 48 h, 72 hy 96 h de incubación a 37 ° C, se eliminó el DMEM y las células se lavaron cuatro veces con PBS (pH 7,4), para eliminar las NP que pudieran estar unidas a la membrana celular. Las células se tripsinizaron y contaron usando una cámara de recuento celular automático. Trescientos sesenta mil células se suspendieron en 200 μL de milliQ y se trataron con HCl / HNO ₃ 3:1 ( v / v ) y se diluyó a 5 mL:la solución resultante se analizó para evaluar el contenido de Si y Ti. El análisis elemental se llevó a cabo mediante espectroscopía de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) con un espectrómetro Varian Vista AX.

Ensayo WST-8

Se sembraron células Caco-2 y A549 en microplacas de 96 pocillos a una concentración de 5 × 10 ³ células / pocillo después de 24 h de estabilización. Soluciones madre de NP (SiO ₂ NP y TiO ₂ NP) se añadieron al medio celular a 15 μg / ml y 45 μg / ml. Las células se incubaron durante 24 h, 48 h, 72 hy 96 h. En el punto final, se determinó la viabilidad celular usando un ensayo WST-8 estándar (Sigma-Aldrich). Los ensayos se realizaron siguiendo el procedimiento descrito previamente en De Matteis et al. [31]. Los datos se expresaron como media ± DE.

Ensayo LDH

Las células Caco-2 y A549 se trataron con SiO ₂ NP y TiO ₂ NP siguiendo el procedimiento informado para el ensayo WST-8. El ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) se realizó en microplacas aplicando el reactivo de ensayo de integridad de membrana homogénea CytoTox-ONE (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recogió el medio de cultivo y se midió el nivel de LDH leyendo la absorbancia a 490 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas Bio-Rad. Los datos se expresaron como media ± DE.

Ensayo DCF-DA

Se sembraron células Caco-2 y A549 en microplacas de 96 pocillos y se trataron con SiO ₂ NP y TiO ₂ NP a concentraciones finales de 15 μg / ml y 45 μg / ml. Después de 24 h, 48 h, 72 hy 96 h de interacción célula-NP, se realizó el ensayo DCF-DA (Sigma) en microplacas siguiendo el procedimiento informado por De Matteis et al. [32] Los datos se expresaron como media ± DE.

Ensayo de SOD

Se prepararon extractos de células de Caco-2 y A549 (incubados con 15 μg / ml, 45 μg / ml durante 24 h, 48 h, 72 hy 96 h) de acuerdo con el protocolo descrito en [33]. El ensayo se realizó en microplacas aplicando un ensayo de SOD (Cayman Chemical Company, Michigan, OH, EE. UU.) Que mide los tres tipos de SOD (Cu / ZnSOD, MnSOD y FeSOD). El ensayo utilizó una sal de tetrazolio para la detección de radicales superóxido generados por la xantina oxidasa y la hipoxantina. Una unidad de SOD se define como la cantidad de enzima necesaria para exhibir una dismutación del 50% del radical superóxido. La actividad de la SOD se midió leyendo la absorbancia a 440-460 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas Bio-Rad.

Ensayo MDA

Se prepararon extractos de células de Caco-2 y A549 (incubados con 15 μg / ml, 45 μg / ml durante 24 h, 48 h, 72 hy 96 h) de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente [33]. El ensayo se realizó en microplacas aplicando el kit de ensayo de peroxidación de lípidos (MDA) (Abcam):el MDA de la muestra reaccionó con ácido tiobarbitúrico (TBA) para generar un aducto de MDA-TBA. Esta ruta implicó la medición espectrofotométrica del color rojo producido durante la formación del aducto MDA-TBA, que puede cuantificarse (en términos de nmol / mg de proteína) leyendo la absorbancia a 532 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas Bio-Rad.

Análisis CLSM

Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos a una concentración de 10 ⁵ células / pocillo y sucesivamente incubados con SiO ₂ NP y TiO ₂ NP a concentraciones de 15 μg / ml y 45 μg / ml durante 24 h, 48 h, 72 hy 96 h. Después del tratamiento, para cada punto de tiempo, se retiró el medio que contenía nanopartículas y las células se lavaron tres veces con PBS, se fijaron con glutaraldehído al 0,25% ( v / v en PBS, Sigma-Aldrich) durante 20 min, y finalmente se permeabilizó con Triton al 0,1% ( v / v en PBS, Sigma-Aldrich) durante 5 min. Para la tinción de actina, se utilizó Phalloidin-ATTO 488 (Sigma-Aldrich) a una concentración de 1 μg / ml durante 30 min. Los núcleos se marcaron mediante DAPI (Sigma-Aldrich) a una concentración de 1 µg / ml durante 7 min. La microscopía confocal de barrido láser se realizó en un microscopio confocal Zeiss LSM700 (Zeiss) equipado con un microscopio invertido Axio Observer Z1 (Zeiss) utilizando una lente de inmersión en aceite de apertura numérica x100, 1,46 para la formación de imágenes. Los archivos de datos confocales se procesaron utilizando el software ZEN2010 (Zeiss) y se realizaron cuantificaciones morfométricas (coherencia y densidad integrada de F-actina) en 15 células, utilizando el software de análisis ImageJ 1.47. El complemento OrientationJ se utilizó para cuantificar el parámetro de coherencia eligiendo una secuencia específica de ROI en adquisiciones confocales, según la medida de los tensores de estructura en un vecindario local. Al mismo tiempo, el software calculó el valor de orientación y coherencia que representaba el grado de orientación de las fibras de actina:las fibras más desordenadas tienen valores cercanos a 0, mientras que las perfectamente alineadas muestran un valor de coherencia de alrededor de 1 [34]. La densidad integrada también se calculó mediante la suma de los valores de píxeles en los ROI en adquisiciones confocales para cuantificar la cantidad de fibras de actina en las células.

Análisis AFM

Se sembraron células Caco-2 y A549 en placas de Petri de plástico (Corning) a una concentración de 10 ⁵ célula / pocillo y cultivado hasta un 70-80% de confluencia. A continuación, las células se trataron con 45 μg / ml de un TiO ₂ NP _S y SiO ₂ NP en DMEM durante 72 h. Sucesivamente, se eliminaron las NP y las células se lavaron con PBS. Las células se fijaron usando glutaraldehído al 0,25% durante 20 min, seguido de lavado con PBS. Las mediciones se realizaron mediante un microscopio de sonda de barrido avanzado (Bioscope Catalyst, Bruker Inc., EE. UU.) Montado en un microscopio óptico invertido (Zeiss Observer Z1, Zeiss ALEMANIA). Todo el sistema se coloca sobre una base que actúa como aislante frente a las vibraciones mecánicas ambientales. Los experimentos de AFM se realizaron en modo fuerza-volumen utilizando Sharp Microlever de Bruker en forma de V (MSNL, punta C):un voladizo de nitruro de silicio de alta sensibilidad con una constante de resorte nominal de 0.01 N / m. Este valor se estimó con precisión mediante el método de sintonización térmica [35] antes de realizar adquisiciones AFM. Los parámetros utilizados fueron los siguientes:área de exploración 50 μm, velocidad de rampa 3 Hz, velocidad de exploración FV 0,03 Hz, umbral de activación 100 nm, número de muestra 128, muestra por línea 64 y líneas 64. El módulo de Young (E) se determinó en 20 células, de las cuales se extrajeron 25 curvas de fuerza-distancia en correspondencia con el área nuclear y 25 curvas en la región citoplasmática. El conjunto de datos de aproximación (desde el punto de contacto hasta el valor máximo de fuerza) derivado de las curvas extraídas se ajustó con un modelo de Sneddon modificado:

donde z y δ c fueron los datos de carga experimentales (altura y deflexión en voladizo, respectivamente), α es la mitad del ángulo de la punta, k _c era el valor de la constante elástica del voladizo, y ν es la relación de Poisson (se supone que es 0,5 para la muestra biológica). En el algoritmo de ajuste, el punto de contacto se trató como variable de ajuste y las fuerzas de adhesión se tomaron en cuenta y se adquirieron en 20 celdas.

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como valor medio y desviación estándar asociada. Las diferencias entre los diferentes valores medios se consideraron estadísticamente significativas al realizar la prueba t de Student prueba con una p valor ˂ 0.05 (<0.05 *, <0.01 ** y <0.005 ***).

Resultados

Caracterización de SiO ₂ NP y TiO ₂ NP

SiO ₂ NP y TiO ₂ Las NP se han sintetizado con rutas sintéticas diferentes y reproducibles con el fin de obtener NP con una distribución de tamaño estrecha y controlada (consulte la sección “Métodos”). Luego, las NP se caracterizaron profundamente mediante TEM, DLS, potencial ζ y XRD, tanto en agua como en el medio de cultivo celular (DMEM) con diferentes concentraciones de fuente de proteína (FBS). Esto es crucial, ya que las proteínas de los medios pueden cubrir la superficie de las NP, cambiando así sus propiedades fisicoquímicas y, por tanto, los efectos biológicos [36]. Los análisis TEM mostraron que SiO ₂ Las NP son de forma esférica, con un diámetro medio de 20 ± 2 nm (Fig. 1a). TiO ₂ Las NP tienen un tamaño similar (25 ± 5 nm), pero una morfología diferente (Fig. 1). Las mediciones de DLS realizadas en agua a las 96 h confirmaron un radio hidrodinámico de 21 ± 7 nm y 27 ± 12 nm para SiO ₂ NP y TiO ₂ NP, respectivamente (Fig. 1b y Fig. 1e). Como era de esperar, estos datos están de acuerdo con las observaciones de TEM. ζ-Los análisis de potencial también confirmaron valores de carga superficial en agua de - 45 ± 3 mV para SiO ₂ NP y de - 50 ± 3 mV para TiO ₂ NP (Fig. 1c, f). Como era de esperar, las propiedades fisicoquímicas de las NP cambiaron tras la inoculación dentro del medio de cultivo celular. DLS confirmó un aumento significativo en el tamaño de NP especialmente en presencia de DMEM suplementado con 20% de FBS (Tabla 1). En particular, SiO ₂ Los NP mostraron un tamaño de 29 ± 9 nm, mientras que TiO ₂ Los NP aumentaron hasta 41 ± 14 nm después de 96 h. El aumento del pico de DLS observado en las mediciones de DMEM (con o sin FBS) es un signo de aglomeración de NP, que puede ser promovida por la fuerza iónica del medio (datos no mostrados). Además, las mediciones de potencial ζ demostraron que la carga superficial de ambos NP se desplazó a valores más negativos . Este gran fenómeno dependiente del tiempo se debió a la formación de corona proteica bastante estable [37, 38] inducida por la presencia de proteínas séricas en los medios de cultivo celular que se adsorbieron en la superficie de las NP:el tamaño y la carga de las NP cambian como una función de la concentración de FBS.

Caracterizaciones de SiO ₂ NP y TiO ₂ NP en agua. un - d Imágenes TEM representativas. b - e Dispersión dinámica de luz (DLS) y c - f Mediciones de potencial ζ. g Patrón de análisis de difracción de rayos X (XRD) de TiO ₂ NP

El patrón XRD de TiO ₂ NP _S , calcinado a 430 ° C, mostró una mezcla de fases cristalinas anatasa y rutilo (Fig. 1g ) . Los picos dominantes en 2θ =25.4 ° (101), 48.1 ° (200), 54.1 ° (211), 62.4 ° (204) y 68.8 ° (116) fueron distintivos de la fase anatasa que coincidió bien con los datos estándar de JCPDS ( número de tarjeta:21-1272). La fase de rutilo se representó con picos de difracción a 27,5 ° (110), 36,2 ° (101) y 41,2 ° (111).

Captación de NP en las células Caco-2 y A549

Para cuantificar la cantidad de SiO ₂ NP y TiO ₂ NP _S absorbido por las células, realizamos el análisis elemental de ICP-AES sobre la célula lisada como investigación preliminar. Las células se trataron con 15 µg / ml y 45 µg / ml de NP. Los datos experimentales confirmaron la presencia de SiO ₂ NP y TiO ₂ NP en ambas líneas celulares, con una eficiencia de internalización dependiente del tiempo (Fig. 2a). TiO ₂ Los NP mostraron una mayor absorción con respecto al SiO ₂ NP. Esto fue particularmente evidente en el Caco-2, donde el contenido de Ti alcanzó concentraciones intracelulares de 8,2 ± 0,4 μg y 9,7 ± 0,031 μg después de 72 hy 96 h, respectivamente . La cantidad de Ti detectada en el A549 fue menor, ya que encontramos 5 ± 0,599 μg a las 72 hy 7,12 ± 0,11 μg a las 96 h de tiempo de incubación. SiO ₂ Los NP fueron absorbidos menos por las células en comparación con el TiO ₂ NP, incluso si la internalización fue más pronunciada en Caco-2. También en este caso, de hecho, la cantidad de SiO ₂ internalizado La NP en las células Caco-2 fue de 4,69 ± 0,031 μg después de 72 hy de 5,78 ± 0,045 μg después de 96 h de incubación. Los valores disminuyeron en A549, donde cuantificamos 2.58 ± 0.045 μg después de 72 hy 4.7 ± 0.04 μg después de 96 h.

TiO ₂ NP y SiO ₂ Acumulación de NP en líneas celulares Caco-2 y A549 expuestas a 15 μg / ml y 45 μg / ml de TiO ₂ NP y SiO ₂ NP durante 24 h, 48 h, 72 hy 96 h. A continuación, se recogieron las células, se contaron las células vivas y se midió el contenido de Ti y Si en 360.000 células (µg de Ti y µg ​​de Si). Los datos se informan como media ± DE de tres experimentos independientes; significación estadística de las células expuestas frente a las células de control para p valor <0.05 (<0.05 *, <0.01 ** y <0.005 ***)

Efectos de los NP en CaCo-2 y A549:viabilidad de las células, daño de la membrana y producción de ROS

La viabilidad de las células Caco-2 y A549 se evaluó con el ensayo WST-8. El tratamiento con SiO ₂ NP y TiO ₂ Las NP indujeron una ligera reducción de la viabilidad dependiente de la dosis en ambas líneas celulares probadas (Fig. 3). TiO ₂ Las NP indujeron una citotoxicidad mejorada con respecto al SiO ₂ Las NP y la viabilidad celular de las células CaCo-2 se vieron más afectadas que las de A549, tras el tratamiento con TiO ₂ NP. En particular, observamos una reducción de la viabilidad de aproximadamente un 40% en Caco-2 tratado con 45 μg / ml de TiO ₂ NP durante 72 h. Esta reducción se redujo aún más hasta un 50% después de 96 h, mientras que, en las líneas celulares A549, TiO ₂ Los NP indujeron una reducción del 30% de la viabilidad solo después de 96 h de tratamiento. La liberación de LDH y la producción de ROS se evaluaron en células Caco-2 y A549 tras la exposición a TiO ₂ NP y SiO ₂ NP. Como se muestra en la Fig. 4a, b, las NP indujeron la poración de la membrana celular (y la liberación de LDH de hecho) en estrecha concordancia con los resultados de viabilidad. El efecto fue más evidente en Caco-2 con respecto a A549 especialmente en TiO ₂ Tratamiento NP, en los momentos más altos (72 y 96 h). El porcentaje de liberación de LDH alcanzó un aumento de aproximadamente un 160% con respecto a las células no tratadas (control), después de 96 h de exposición. La generación de ROS se ha estudiado ampliamente porque es uno de los principales efectos inducidos por las NP [39]. Este fenómeno interfiere en la respuesta biológica de defensa antioxidante [40], aunque es importante mencionar que el mecanismo de acción real aún está en investigación. El estrés oxidativo potencial inducido por NP se estimó mediante el ensayo DCFH-DA. Como era de esperar, la interacción entre las NP y las células estimuló la generación de ROS, de una manera dependiente de la dosis con un fuerte efecto en Caco-2 sobre TiO ₂ Tratamiento NP (Fig. 4c, d). El porcentaje de liberación alcanzó valores de 165% con respecto a las células control, a la concentración más alta ensayada.

Ensayo de viabilidad (WST-8) de Caco-2 ( a ) y A549 ( b ) células después de 24 h, 48 h, 72 hy 96 h de exposición a dos dosis (15 μg / ml y 45 μg / ml) de TiO ₂ NP y SiO ₂ NP. La viabilidad de las células tratadas con NP se normalizó con respecto a las células de control no tratadas. Como control positivo (P), las células se incubaron con DMSO al 5% (datos no mostrados). Los datos informados como media ± DE de tres experimentos independientes se consideran estadísticamente significativos en comparación con el control ( n =8) para p valor <0.05 (<0.05 *, <0.01 ** y <0.005 ***)

LDH ( a - b ) y ROS ( c - d ) ensayos en células Caco-2 y A549. Las células se incubaron con 15 μg / ml y 45 μg / ml de TiO ₂ NP y SiO ₂ NP durante 24 h, 48 h, 72 hy 96 h. El porcentaje de pérdida de LDH de las células tratadas con nanopartículas se expresa en relación con las células de control no tratadas. Los controles positivos (P) consistieron en el tratamiento de células con Triton X-100 al 0,9% mostrando aprox. Aumento del 500% de LDH (datos no mostrados). Los niveles de ROS se registraron exponiendo células Caco-2 y A549 con 15 μg / ml y 45 μg / ml de TiO ₂ NP y SiO ₂ NP durante 24 h, 48 h, 72 hy 96 h incubadas con DCFH-DA 100 μM. Se midió la fluorescencia celular. Como control positivo (P), las células se incubaron con 500 μM de H ₂ O ₂ mostrando una ca. Incremento del 300% DCFH-DA (no mostrar). Los datos informados como media ± DE de tres experimentos independientes se consideran estadísticamente significativos en comparación con el control ( n =8) para p valor <0.05 (<0.05 *, <0.01 ** y <.005 ***)

Efectos inducidos por NP sobre la actividad antioxidante y la peroxidación de lípidos en células Caco-2 y A549

La enzima SOD está involucrada en el sistema de defensa antioxidante después de la inducción del estrés oxidativo. Esta enzima cataliza la dismutación de superóxido altamente reactivo (O ₂ ^{• -} ) anión en peróxidos H ₂ O ₂ [41]. Observamos una reducción dependiente de la dosis en la actividad de la enzima SOD tanto en Caco-2 como en A549 después de la incubación con SiO ₂ NP y TiO ₂ NP (15 μg / ml, 45 μg / ml) en diferentes momentos (de 24 a 96 h) (Fig. 5a, b). De acuerdo con las evaluaciones de citotoxicidad, el efecto fue más evidente en el Caco-2 sobre el TiO ₂ Exposición NP. Por ejemplo, los niveles de actividad de SOD se redujeron de 4,1 ± 0,2 U / ml en el control a 1,03 ± 0,325 U / ml en células Caco-2 expuestas a 45 μg / ml de TiO ₂ NP, a las 96 h. La exposición a la misma concentración de SiO ₂ Las NP redujeron la actividad de la SOD a 1,45 ± 0,12 U / ml. El ensayo basado en MDA se utilizó para comprobar la posible peroxidación lipídica mediada por ROS, que a su vez es otra forma de comprobar el estrés oxidativo celular. [42] Los niveles celulares de MDA aumentaron después de la exposición a los dos tipos de NP tanto para Caco-2 como para A549 (Fig. 5c, d). Como se esperaba, el aumento de los niveles de MDA fue proporcional a la concentración y al tiempo de exposición.

un - d Ensayos de SOD y MDA en células Caco-2 y A549. Las células se incubaron con 15 μg / ml y 45 μg / ml de TiO ₂ NP y SiO ₂ NP durante 24 h, 48 h, 72 h, 96 h. El ensayo de SOD utilizó una sal de tetrazolio para la detección de radicales superóxido generados por la xantina oxidasa y la hipoxantina. La curva estándar se utilizó como control positivo (datos no mostrados). Los niveles de MDA se detectaron mediante la cuantificación del aducto MDA-TBA (DO =532 nm). Los datos informados como media ± DE de tres experimentos independientes se consideran estadísticamente significativos en comparación con el control ( n =8) para p valor <0.05 (<0.05 *, <0.01 ** y <0.005 ***)

Efectos morfomecánicos inducidos por NP

Análisis de microscopía confocal de Caco-2 y A549 incubados con 15 μg / ml y 45 μg / ml de SiO ₂ NP y TiO ₂ Las NP durante 24 h, 48 h, 72 h y 96 h se informan en las Figs. 6 y 7. Las células de control Caco-2 exhibieron una morfología similar a los enterocitos intestinales con uniones estrechas y un borde en cepillo en el lado apical [43]. Tras el tratamiento con NP, las uniones estrechas de las células colapsaron y el patrón de las células resultó aislado, con una forma alargada. Estos efectos fueron más evidentes cuando las células se trataron con TiO ₂ NP a 45 μg / ml durante 72 h de tiempo de incubación, mostrando alteraciones relevantes de los patrones de actina, así como cambios en la morfología celular. Las células A549 no tratadas mostraron una forma similar a un guijarro y adherencias célula-célula funcionales [44], mientras que el tratamiento con NP disminuyó los contactos célula-célula y modificó la morfología celular hacia formas más alargadas. La Figura 8 muestra una figura confocal ampliada, que permite detectar cambios en la distribución de actina. La organización alterada de la red de actina después de la exposición a NP (72 h de 45 μg / ml de SiO ₂ NP y TiO ₂ NP) se analizó cuantitativamente mediante densidad de fluorescencia y coherencia utilizando el software ImageJ (Fig. 9). Optamos específicamente por estos dos parámetros porque la densidad integrada nos permitió cuantificar la cantidad de actina, mientras que la coherencia nos dio información sobre el grado de orientación de la fibra en comparación con el entorno [45]. Las células Caco-2 no tratadas tenían un valor de densidad de 129,4 ± 16, y esto no se vio afectado por los tratamientos con NP; los valores fueron 127,7 ± 20 y 128,5 ± 18 después de la exposición a SiO ₂ NP y TiO ₂ NP, respectivamente, Fig. 9a). De manera similar, también la densidad de la red teñida con actina se mantuvo igual en A549 antes y después del tratamiento (68,4 ± 14, 67,9 ± 15 y 67,7 ± 18 para el control negativo, SiO ₂ NP y TiO ₂ NP, respectivamente, Fig. 9b). Aunque los tratamientos con NP no indujeron una alteración en la cantidad de actina, los análisis de coherencia sugirieron una reorganización espacial diferente de la actina. En Caco-2, los valores de coherencia de las células tratadas para SiO ₂ NP (0,16 ± 0,04) y para TiO ₂ El tratamiento NP (0.09 ± 0.02) disminuyó con respecto al control (0.26 ± 0.03) (Fig. 9c). Incluso las células A549 experimentaron una disminución de coherencia después de interactuar con SiO ₂ NP y TiO ₂ NP (0,2 ± 0,07 y 0,158 ± 0,04) en comparación con las células de control (0,4 ± 0,03) (Fig. 9d). Por lo tanto, los NP indujeron una reorganización significativa de la red de actina, que mostró una orientación isotrópica de actina, pero no cambiaron la cantidad total de actina expresada. Además de los reordenamientos citoesqueléticos, también analizamos el área descrita por la relación núcleo / citoplasma. Values of N/C ratio were calculated as the ratio between nuclear area and the whole cellular area (measured performed on 15 cells). We observed opposite values following the treatment with 45 μg/ml of NPs for 72 h with significant statistical validity. In particular, the ratio was (0.40 ± 1.7) in untreated Caco-2 cells, and this increased up to 0.554 ± 0.09 and 0.62 ± 0.12 after SiO₂ NP and TiO₂ NP exposure (Fig. 9e). The trend was different in A549. The nuclear/cytoplasm ratio dropped down upon exposure to NPs from values of 0.550 ± 0.04 for control cells to 0.334 ± 0.06 for SiO₂ NPs and 0.225 ± 0.09 for TiO₂ NP. After the morphological investigations, we analyzed the elastic properties of cells after exposing them to 45 μg/ml of SiO₂ NP y TiO ₂ NPs for 72 h by AFM, in force–volume mode. We measured the different elasticity expressed by Young’s modulus values in the nuclear and cytoplasmic region. Caco-2 cells displayed Young’s modulus value of 105 ± 25 kPa for nuclear region and 47 ± 21 kPa for the cytoplasm. After SiO₂ NP treatment, we observed a reduction of value to 42 ± 8 kPa for the nucleus and 19.59 ± 2 kPa for the cytoplasm. The effects were more evident after treatment with TiO₂ NPs:the Young modulus for the nucleus was 27 ± 4 kPa and 18 ± 4 kPa for the cytoplasm (Fig. 10a). We found an opposite outcome concerning the elastic properties of A549 cells. In this case, Young’s modulus was 129 ± 24 kPa for the nuclear region and 147 ± 26 kPa for the cytoplasmic area. After SiO₂ NP treatment, the values of elasticity increased to 152 ± 23 kPa for nucleus and 152 ± 25 kPa for cytoplasm. When cells were doped with TiO₂ NPs, Young’s modulus values drastically increased to 372 ± 60 kPa for nucleus region and 549 ± 40 kPa for cytoplasmic region (Fig. 10b).

Effects of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 cells. Caco2 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; cells were fixed and then stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network on A549 cells. A549 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; successively they were fixed and stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Local enlargement of confocal acquisitions acquired in Figs. 6 and 7 showed (more in details) the effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 and A549 cells after the exposure of 45 μg/ml of NPs for 72 h and 96 h

Integrated density (a , b ) and coherency (c , d ) for Caco-2 and A549 cells treated with 45 μg/ml of SiO₂ NP y TiO ₂ NPs after 72 h. The integrated density and coherency values were expressed as a mean value and relative SD, calculated from confocal acquisitions by ImageJ (calculation on 15 cells). The mean values and their standard deviations were reported in the histograms. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***). e Analyses of nucleus/cytoplasm ratio on Caco-2 and A549 after exposure to 45 μg/ml of SiO₂ NP y TiO ₂ NPs for 72 h. The ratio was calculated on 15 cells by ImageJ. The mean values and the SD were reported in the histogram. Results were statistically significant for p  < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***)

Young’s modulus values expressed in kPa, calculated from the nuclear region and the cytoskeletal area of Caco-2 (a ) and A549 (b ) cell lines after a treatment to 45 μg/ml of SiO₂ NP y TiO ₂ NPs for 72 h

Discusión

The spread of different kind of ENPs in several fields raises awareness about the importance to assess their potential toxicity in living organisms and the environments as well, taking into account their potential application in biomedical field [46,47,48]. In vitro and in vivo investigations are crucial to enrich the scientific knowledge and to release reliable clinical and epidemiological data [49]. The toxicity tests performed on different cells are considered the golden standard to assess the safety of NPs. However, few studies have investigated the interactions between NPs and cells from a biomechanical point of view. Cell mechanic is an important factor that influences many cellular pathways, including apoptosis, differentiation, migration, cancer metastasis, and wound healing [50]. In our work, we have addressed this point and related cell viability with the changes in mechanical properties of cells treated with different NPs. Firstly, we synthetized amorphous SiO₂ NPs and crystalline TiO₂ NPs with a size of c.a. 20 nm. NPs were stable in water and DMEM up to 96 h, even upon incubation with 10% and 20% of FBS. This was found to induce an increase in NPs size due to the formation of protein corona, in perfect agreement with the literature data. [51]. Since the entry route of NPs often occurs through inhalation and ingestion, we opted to investigate the potential effects on Caco-2 and A549 cells, which are representative models for the intestinal tract and airways mimicking oral and inhalation uptake [52]. As primary investigation, we quantified the cellular internalization of SiO₂ NP y TiO ₂ NPs by elemental analysis. The most effective uptake was observed in Caco-2 cells, especially upon treatment with TiO₂ NPs in a time-dependent manner. It has been reported that amorphous SiO₂ NPs, with a small size range of 15–20 nm, can bind the plasma membrane and then passively pass across the lipid bilayer to get access into the cells [53]. As demonstrated in A549 [54] and Caco-2 [55], in fact, small SiO₂ NPs can translocate in the cytoplasm with no apparent membrane encapsulation. The anatase crystalline form of TiO₂ NPs is the more chemically reactive [56] showing a faster absorption with respect to rutile, as previously reported [32]. However, the uptake mechanisms of Caco2 are still unclear, despite that some hypothesis have been formulated, some of these include metal ion release upon NPs degradation in the intestinal barrier lumen or/and direct uptake by endocytosis. [57]. In A549 cells, TiO₂ NPs were localized in cytoplasm and close the nucleus region [58]. We used WST-8 assay to assess the influence of different concentrations of SiO₂ NPs and TiO2NPs on cell viability. We have observed a general decrease of viability, especially in Caco-2, with TiO₂ NPs displaying the strongest toxicity. After assessing the viability, we monitored the extracellular release of the cytoplasmic enzyme LDH. We confirmed that the NPs induced an extensive membrane damage, which relates also to the increase of intracellular ROS levels, resulting in oxidative stress. In this context SOD, which acts as strong antioxidant against ROS [59], was significantly reduced most probably because of the unbalance of the redox repair systems. In addition, the oxidative stress increased the lipid peroxidation [60], as demonstrated by MDA measurements after NPs incubation. This is particularly evident in Caco-2 cells after TiO₂ NP exposure. It is worth mentioning that this effect can decrease membrane fluidity, which can further explain the observed higher entry levels of the TiO₂ NPs [61]. This was in significant accordance with the intracellular oxidative stress levels measured by SOD inhibition, as well as with the reactive oxygen species generation. After these assessments, we investigated the modulation of the cell cytoskeleton, as an increase of intracellular ROS could affect the F-actin organization [62]. The cytoskeleton is characterized by a set of filaments (actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments) organized in a network that affects the mechanical properties of cells, as well as their behavior [29]. In particular, actin filaments are crucial for cell mechanics, and any alterations may induce aberrations in cell morphology under sub-toxic conditions [63]. It has been demonstrated that actin was one of the most commonly bound protein by SiO₂ NP y TiO ₂ NPs in cellular extracts. This definitely suggests that the actin functions, as well as cell motility and organelles trafficking, can be strongly affected by the presence of these NPs [64, 65]. As a further proof, several in vivo studies have revealed the potential of NPs to induce alterations in the expression of genes related to the cytoskeleton [63]. In order to understand how NPs modulate the cytoskeleton, we performed qualitative and quantitative confocal analyses on Caco-2 and A549 cells, after SiO₂ NP and TIO₂ Tratamiento NP. We focused on actin stress fibers and cortical actin because they allowed to maintain the physiological mechanical architecture of cells. As reported in Figs. 4 and 5, the treatment with NPs induced a significant reorganization of actin. This was more evident after 72 h of treatment with 45 μg/ml of NPs, and especially with the use of TiO₂ NP. The adverse effects were stronger in intestinal cells, where we have observed the formation of protrusions and philopodia at the plasma membrane level, together with the disruption of tight junctions. Fluorescence coherency and fluorescence density have been used as quantitative parameters to assess alterations of actin distribution in the cytoskeleton. While coherency gives information about the organization of actin, density quantifies the levels of fluorescent actin. Caco-2 and A549 exposed to NPs showed a reduction of coherency compared to untreated cells, especially upon incubation with TiO₂ NP. This was in good agreement with the qualitative confocal imaging analyses. The fluorescence density of actin was not altered by NP treatment in both the cell lines, even if untreated Caco-2 cells showed higher values with respect to untreated A549. These data could suggest a potential difference in the amount of actin, which is dependent on>the specific cell type. We also evaluated the nucleus-to-cytoplasm ratio as the relative area of the nucleus over the whole cell. We confirmed a reduction of values in A549 and an increase of the ratio in Caco-2 with respect to the control cells. This indicates changes in cell morphology after NP treatment:Caco-2 underwent an increase of nucleus area, whereas A549 became larger through cytoplasm extension. As a final point, we explored any potential change in cell elasticity upon NP treatment. Cell elasticity is commonly expressed by Young’s modulus (E), which is a ratio between the stress and the applied strain (with unit in Pascal) [66, 67]. Changes in cell elasticity due to cytoskeleton reorganization is often associated to disease progression [68], hence (E) can be a refined indicator of potential pathological states [67]. The deformability of cells was measured through indentation experiments by AFM [69]. Many studies showed the detrimental effects of NPs on the F-actin that induced an enhancement of cell elasticity. However, a clear relation between change in cell stiffness, actin rearrangement and cell viability has not been clearly established yet. Here, we have covered such topic and found that Caco-2 and A549 cells significantly change their (E) upon NP treatment, even though in two different ways. Caco-2 cells are softer as confirmed by the decreased Young’s modulus, which has been found to be a function of both the NPs type and the cell regions analyzed. In particular, TiO₂ NPs induced a general enhancement of elasticity, and this effect is more evident in the nuclear regions rather than the cytoplasmic one. On the other side, A549 displayed a remarkable increase of Young’s modulus after TiO₂ NP exposure in cytoplasm region, compared to control cells (594 ± 40 kPa versus 146 ± 26 kPa, respectively). These data indicated that TiO₂ NPs induce dose-dependent changes in force–deformation profiles in both cell lines, whereas SiO₂ NPs showed little effects. The decrease of Young’s Modulus, and consequently an increase of elasticity after NPs exposure, can potentially impact cell homeostasis and physiological pathways. The reorganization F-actin, together with a reduction of coherency, showed a strong modulation of mechanical cell properties. NPs have been demonstrated to make the nuclear region of Caco-2 cells softer than untreated cells. The increase of elasticity (corresponding to a reduction of Young’s modulus) is a critical factor in tumor progression, because it is an indicator of disruption of cell junctions, which promotes in turn cell migration and metastatization [70]. Therefore, the treatment with NPs on Caco-2 (and TiO₂ NP_S in particular) can potentially promote migration due to change of elastic properties and deformability of cells. Also, the larger and softer nucleus area can be associated to cancer progression [71].

Conclusión

In this paper, we careful assessed the adverse effects of SiO₂ NP y TiO ₂ NPs on two different cell lines (Caco-2 and A549), mimicking the typical tissue that are exposed to NPs (ingestion and inhalation). SiO ₂ NPs presented a low cytotoxicity in comparison with TiO₂ NPS. We demonstrated how the cellular exposure to high doses of NPs induced morphostructural changes in term of actin reorganization, coherency, density and nucleus/cytoplasm ratio, which were more evident upon TiO₂ Tratamiento NP. Cell membrane deformability measurements showed different behavior in the two cells. In Caco-2, the cell elasticity increased after NP treatment, whereas A549 displayed an increase of stiffness. These results demonstrated that NPs induce modifications of cytoskeleton structures and, as consequence, a different Young’s Modulus values. Hence, the phenotype of cancer cells can turn into a more invasive profile, characterized by enhanced migration. On the other side, the increased stiffness observed in A549 might not promote the mobility of this specific cell indeed. We are sure that the analysis of cell mechanics upon NP exposure, combined with standard toxicological assays, will represent a golden standard to accurately assess the safety of NPs and to predict any potential possible diseases triggered by NPs.

Abreviaturas

A549:

Human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells

AFM:

Microscopía de fuerza atómica

ATP:

Adenosine triphosphate

Caco-2:

Human epithelial colorectal adenocarcinoma

CLSM:

Confocal Laser Scanning Microscopy

DAPI:

4′,6′-Diamidino-2-phenylindole

DCF-DA:

2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

ENPs:

Engineered nanoparticles

FBS:

Fetal bovine serum

HCl/HNO3:

Hydrochloric/nitric acid

ICP-AES:

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

LDH:

Lactate dehydrogenase

MDA:

Malondialdehyde

NH4OH:

Ammonium hydroxide

NP:

Nanopartículas

PBS:

Phosphate Buffered Saline

ROI:

Regiones de interés

ROS:

Reactive Oxygen Species

SiO2NPs:

Silicon dioxide nanoparticles

SOD:

Superóxido dismutasa

TBA:

Thiobarbituric acid

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate

TiO2NPS:

Titanium dioxide nanoparticles

TTIP:

Titanium (IV) isopropoxide

XRD:

Difracción de rayos X

Mapeo de las propiedades estructurales, eléctricas y ópticas de nanovarillas de ZnO dopadas con fósforo cultivadas hidrotermalmente para aplicaciones de dispositivos optoelectrónicos Anclaje de nanocristales Plasmonic Ag @ AgCl en microesferas de ZnCo2O4 con actividad fotocatalítica visible mejorada