Preparación de liposomas de ácido glicirretínico mediante el método de solución monofásica de liofilización:preformulación, optimización y evaluación in vitro

Métodos / Experimental

Materiales

El ácido glicirretínico (> 98% puro) se obtuvo de Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, China). La fosfatidilcolina de soja (Lipoid S100) se adquirió de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemania). El colesterol se compró a J&K Scientific Ltd. (Beijing, China). El compuesto de referencia de GA se adquirió de los Institutos Nacionales de Control de Alimentos y Medicamentos (Beijing, China). FITC-PEG-DSPE (peso molecular 2000) se adquirió de Shanghai Ponsure Biotech, Inc. (Shanghai, China). El alcohol terc-butílico (> 98%) y todos los demás reactivos, si no se especifica lo contrario, se compraron a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, China). El agua desionizada se preparó mediante un sistema de purificación de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.).

Estudio de solubilidad de GA, SPC y colesterol en el sistema de codisolvente de agua / TBA

Las soluciones saturadas de TBA-agua (30 ml) de GA con diferente porcentaje de volumen de TBA se prepararon agitando un exceso de fármaco en el vehículo correspondiente a 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C y 45 ° C durante 72 h. Después de la centrifugación (15 min a 3000 rpm), el sobrenadante se pasó a través de filtros microporosos de 0,45 µm. La solubilidad en saturación de GA se midió mediante HPLC después de una dilución adecuada. Se realizaron tres réplicas en cada codisolvente de TBA / agua. El análisis de HPLC se realizó en un sistema de HPLC LabAlliance (modelo Serie III) (Lab Alliance, Tianjin, China) equipado con una bomba cuaternaria, un muestreador automático y un compartimento de columna, acoplado a un detector de UV. La separación se realizó en una columna C18 (4,6 mm x 250 mm; 5 µm; Dikma Technologies, Beijing, China); metanol y agua (90:10 V / V ) se utilizaron como fase móvil a un caudal de 1,0 ml / min. Los analitos fueron detectados por un detector de UV a 250 nm.

La solubilidad de la fosfatidilcolina de soja (SPC) (o colesterol) en el sistema de codisolvente de TBA / agua se estimó mediante el método turbidimétrico [19, 20]. Brevemente, se disolvieron 10 mg de SPC (o colesterol) en TBA a 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C y 45 ° C para obtener una solución transparente; la temperatura se mantuvo durante todo el experimento. Se añadió una cantidad creciente de agua purificada a la misma temperatura a la solución de TBA de SPC (o colesterol) a 25ºC hasta que tuvo lugar por primera vez la turbidez y se registró el valor del volumen de agua crítico. La turbidez se puede identificar detectando el valor de absorción a 655 nm (> 0,04) frente a la solución en blanco (agua purificada) en un espectrofotómetro UV-Vis modelo T6 (Purkinje General Instrument Co., Ltd., Beijing).

Preparación de liposomas mediante el método de solución de liofilización monofásica

Se disolvió GA, SPC y colesterol en TBA a 45ºC, y se disolvió lioprotector soluble en agua como manitol, lactosa, sacarosa y trehalosa en agua a 45ºC. Luego, estas dos soluciones se mezclaron en proporciones apropiadas para obtener una tercera solución monofásica isotrópica transparente (volumen total 60 ml). Después de esterilizar la solución monofásica mediante filtración a través de poros de 0,22 µm, se llenaron viales de liofilización de 10 ml con un volumen de llenado de 2,0 ml. Después de precongelar durante 12 ha -40 ° C, se llevó a cabo la liofilización a una temperatura de almacenamiento de -50 ° C durante 24 h con una presión de cámara de 1 a 20 Pa en un liofilizador (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China).

Medición del tamaño de las partículas y la eficiencia de encapsulación de los liposomas

La suspensión de liposomas se preparó mediante la adición de 5 mg de proliposomas en polvo a 5 ml de agua purificada y la posterior agitación con vórtice durante 1 min dos veces con un intervalo de 15 min para una hidratación completa. El análisis de tamaño de los liposomas se caracterizó mediante el uso de un analizador de tamaño de partículas láser (Nano ZS90 Malvern Instruments, Reino Unido).

La eficacia de encapsulación de GA en liposomas se determinó mediante la técnica de ultrafiltración-centrifugación. Brevemente, pipetear 1 ml de dispersión liposomal (500 μg de proliposomas en 5 ml de agua purificada) en un matraz aforado de 10 ml, luego agregar 5 ml de agua purificada, 2 ml de acetona y diluir a 10 ml con agua purificada. Transferir 0,5 ml de esta suspensión a la cámara superior del filtro de centrífuga (Amicon Ultra-0.5, Millipore, Cdduounty Cork, Irlanda) con un corte de peso molecular de 50 kDa, que se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min a 15 ° C utilizando una ultracentrífuga (CP70MX, Hitachi Koki Co., Ltd., Japón). Luego, se inyectaron 20 µl de ultrafiltrado en el sistema de HPLC a una longitud de onda de absorción de UV de 250 nm, y el contenido de GA se denominó contenido de fármaco libre. La eficiencia de encapsulación (EE) se calculó de acuerdo con las siguientes ecuaciones

donde W _gratis es la cantidad de fármaco gratis y W _total es la cantidad total de fármaco.

Determinación de la tasa de sublimación de mezclas de TBA / agua

Se puso un mililitro de mezclas de TBA / agua de diferente porcentaje de volumen de TBA (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% y 90%) en viales de liofilización de 10 ml. , respectivamente. Las mezclas de TBA / agua se precongelaron a -40 ° C durante 12 hy luego se liofilizaron con un liofilizador (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China) a -50 ° C. Se registró el tiempo en que las mezclas de TBA / agua desaparecieron por completo de los viales de liofilización, y la tasa de sublimación se calculó dividiendo el volumen (μl) por el tiempo (min).

Determinación de la presión de vapor saturado de mezclas de TBA / agua

Los detalles del aparato experimental y el procedimiento de operación se describieron en otra parte [21, 22]. Las presiones de vapor del sistema TBA / agua (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% y 90%) se midieron mediante un método estático. El aparato estaba compuesto por un ebulliómetro de trabajo lleno con una mezcla de TBA / agua, un ebulliómetro de referencia lleno de agua pura, un recipiente tampón, dos condensadores, dos medidas de temperatura y un sistema de control de presión. La presión de equilibrio del sistema se determinó mediante la temperatura de ebullición del agua pura en el ebulliómetro de referencia en términos de la relación temperatura-presión representada por la ecuación de Antoine [23].

Determinación de la solubilidad de GA

La solubilidad en agua de GA libre se determinó añadiendo GA en exceso (10 mg) a 10 ml de agua pura con agitación magnética (300 rpm) en un baño de agua controlado termostáticamente (DF-101S, Henan Yuhua instrument Co., Ltd., China) a 25 ° C hasta alcanzar el equilibrio (48 h). Las muestras se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,45 µm, se diluyeron adecuadamente con metanol y se analizaron por HPLC [24]. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Observación de la morfología de la superficie de mezclas de agua / TBA precongeladas

Se vertieron cinco mililitros de mezclas de agua / terc-butanol en una placa Petri de 90 mm, luego se congelaron en la trampa fría (-40ºC); las muestras congeladas se observaron utilizando un microscopio óptico XSP-4C (Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd., Shanghai, China).

Microscopía electrónica de transmisión

La apariencia de los liposomas se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) Hitachi HT7700 (Hitachi, Japón) a un voltaje de aceleración de 100 kV. La suspensión de liposomas se obtuvo añadiendo 5 mg de proliposomas en polvo a 5 ml de agua purificada a temperatura ambiente, se mezcló mediante vórtex durante 10 sy luego se dejó reposar durante 30 s. Se retiró una gota con una micropipeta y luego se colocó sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono. El exceso de suspensión se eliminó secando la rejilla con un papel de filtro. Tinción negativa con una solución de ácido fosfotúngstico al 1% ( w / w , pH 7,1) se preparó directamente sobre el depósito. El exceso se eliminó con un papel de filtro y el depósito se dejó secar antes del análisis.

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

Los espectros de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) de las muestras se obtuvieron en un espectrofotómetro Nicolet 6700 FTIR (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Cada muestra y bromuro de potasio se mezcló con un mortero de ágata y se comprimió en un disco delgado. El rango de escaneo fue de 4000 a 400 cm ⁻¹ y la resolución era de 4 cm ⁻¹ .

Calorimetría diferencial de barrido

Las mediciones de calorimetría diferencial de barrido (DSC) se realizaron en un calorímetro de barrido DSC HSC-1 (Hengjiu Instrument, Ltd., Beijing, China). Se colocaron muestras de 15 mg en bandejas de aluminio y se sellaron en la prensa de bandejas de muestras. Las sondas se calentaron de 25 a 350 ° C a una velocidad de 10 ° C / min en atmósfera de nitrógeno.

Difracción de rayos X

Las propiedades estructurales de las muestras se obtuvieron utilizando el difractómetro de rayos X D8 Focus (Bruker, Alemania) con radiación Cu-Kα. Las mediciones se realizaron a un voltaje de 40 kV y 40 mA. Las muestras se escanearon de 5 ° a 60 ° y la velocidad de escaneo fue de 5 ° / min.

Estabilidad del proliposoma GA

Los polvos de proliposomas de GA se transfirieron a una botella de vidrio, se llenaron con nitrógeno, se sellaron y se almacenaron lejos de la luz a temperatura ambiente. La prueba de estabilidad se llevó a cabo durante 6 meses utilizando la eficiencia de atrapamiento y el tamaño de partícula de los liposomas reconstituidos como índices.

Liberación de fármacos in vitro

Se observó la liberación de GA de los liposomas usando el método de diálisis a 37 ± 0,5 ° C. Después de reconstituir los liposomas en PBS (pH 7,4) o solución salina normal para hacer 0,5 mg / ml de GA, se colocó una alícuota de cada dispersión liposomal (5 ml) en una bolsa de diálisis (peso molecular de corte 8000-14000 Da) y se herméticamente cerrado. Luego, el tubo se sumergió en 150 ml de medio de liberación, PBS (pH 7,4) o solución salina normal que contenía 0,1% ( v / v ) Tween 80 para mantener la condición de sumidero [25, 26]. Mientras se agitaba el medio de liberación usando el agitador magnético a 300 rpm, se tomaron muestras (1,5 ml) a intervalos de tiempo predeterminados del medio de liberación durante 12 h, que se volvió a llenar con el mismo volumen de medio fresco. La concentración de GA se determinó mediante HPLC después de una dilución adecuada con metanol.

Captación celular in vitro

Los liposomas de fluorescencia se prepararon mediante el método de solución de liofilización monofásica. Brevemente, se disolvió una mezcla de 30 mg de GA, 254 mg de SPC, 75,5 mg de colesterol y 21,2 mg de FITC-PEG-DSPE en TBA. Además, se disolvieron 1016 mg de trehalosa en agua. Luego, estas dos soluciones se mezclaron para obtener una solución monofásica transparente (volumen total 30 ml). Después de que la solución monofásica se esterilizó mediante filtración a través de poros de 0,22 μm, se llenó en viales de liofilización de 10 ml con un volumen de llenado de 2,0 ml, luego se liofilizó durante 24 hy se añadió agua para reconstituir los liposomas hasta su uso.

Las células HepG2 (Wanleibio, Co., Ltd., Shenyang, China) se cultivaron en DMEM con FBS al 10% (suero bovino fetal). Las células se sembraron en placas hasta lograr una confluencia del 90% en placas de 6 pocillos, y las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37,0 ° C con 5,0% de CO ₂ . Después de 24 h de incubación, se agregaron 200 μl de suspensión de liposomas FITC-GA a 1 ml de la suspensión de células HepG2 (1 x 10 ⁴ células por pocillo). Después de la incubación durante 0,5 h, 1 h, 2 hy 4 h, las células se lavaron tres veces con PBS a pH 7,4 y la fluorescencia extracelular se apagó con un 0,4% ( w / v ) Solución de azul tripán. Las células se lisaron con 1% ( w / v ) Triton X100. La intensidad de fluorescencia del lisado celular a 495 nm de excitación y 520 nm de emisión se midió usando un espectrofotómetro de fluorescencia RF5301 (Shimadzu, Tokio, Japón). Los valores de fluorescencia relativa se convirtieron en concentraciones de fosfolípidos basándose en una curva estándar de concentración de fosfolípidos frente a la intensidad de fluorescencia de FITC medida en el tampón de lisis celular. La concentración de proteína se determinó usando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). La captación se expresó como la cantidad de fosfolípidos frente a por miligramos de proteína celular [27].

Resultados y discusión

Estudio de preformulación

Estudio de solubilidad

Dado que los liposomas se preparan mediante el método de solución de liofilización monofásica, se realizó un estudio de solubilidad para garantizar que el fármaco y el material portador pudieran disolverse en la solución de TBA / agua antes de la liofilización.

La Figura 1 muestra los cambios en la solubilidad saturada de GA en el sistema de codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen. Entre 25 ° C y 45 ° C, la solubilidad saturada de GA aumentó continuamente con el aumento del porcentaje de volumen de TBA del 10 al 60%, y la solubilidad saturada de GA fue> 0,5 mg / ml cuando el porcentaje de volumen de TBA fue> 40%. Por otro lado, la solubilidad saturada de GA aumentó al aumentar la temperatura de la solución de TBA / agua, cuando se mantuvo en el mismo porcentaje de volumen. La diferencia de solubilidad a diferentes temperaturas se hizo cada vez más evidente cuando el porcentaje en volumen de TBA alcanzó el 30%. La solubilidad de los fosfolípidos y el colesterol de la soja en el sistema de codisolvente de TBA / agua se muestra en el gráfico de columnas apiladas (Fig. 2). La Figura 2a, b representa el volumen de mezcla de TBA / agua necesario para que una unidad (1 mg) de fosfolípidos y colesterol alcance la solubilidad saturada a diferentes temperaturas, respectivamente. El área gris representa el volumen de agua y el área negra representa el volumen de TBA. A medida que la temperatura aumentó gradualmente de 25 a 45 ° C, el volumen total de codisolvente de TBA / agua y el porcentaje de volumen de TBA (etiquetas en las columnas) necesarios para disolver 1 mg de fosfolípido disminuyeron gradualmente (Fig. 2a). A medida que la temperatura aumentó más allá de los 35 ° C, el volumen de TBA necesario se redujo significativamente y estuvo por debajo de 0,15 ml. De manera similar, a medida que la temperatura aumentó gradualmente de 25 a 45 ° C, hubo una reducción en el volumen de TBA necesario para disolver 1 mg de colesterol, mientras que el porcentaje de volumen de TBA mostró una tendencia hacia una disminución gradual. Los resultados anteriores demostraron que la temperatura y el porcentaje de volumen de TBA afectan en gran medida la solubilidad de los fosfolípidos, el colesterol y la GA.

Solubilidad saturada de GA en TBA / codisolvente de agua con diferente porcentaje de volumen (media ± DE, n =3)

Solubilidad de SPC ( a ) y colesterol ( b ) en codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen

Comparación de la tasa de sublimación del sistema de codisolvente de agua / TBA con diferente porcentaje de volumen

La tasa de sublimación afecta directamente la eficiencia de producción de polvo liofilizado. Una tasa de sublimación más rápida es más económica y puede evitar el colapso de los materiales [16]. En este estudio, examinamos las tasas de sublimación de diferentes concentraciones de TBA / sistemas de agua. Como se muestra en la Fig. 3, la tasa de sublimación del disolvente mixto aumentó gradualmente a medida que el porcentaje en volumen de TBA aumentó del 10 al 90%. Además, la tasa de sublimación alcanzó más de 10 μl / min ya que el porcentaje de volumen excedió el 60%.

Tasa de sublimación del codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen (media ± DE, n =3)

Para identificar la razón de la diferencia en la tasa de sublimación de TBA con diferente porcentaje de volumen, primero examinamos la morfología de la superficie de las muestras congeladas. La Figura 4 contiene las imágenes microscópicas ópticas de la solución de TBA / agua con un porcentaje de volumen del 40% al 80% (no se pudo examinar el TBA con un porcentaje de volumen <30% ya que se derritió rápidamente bajo el microscopio óptico). En comparación con la TBA con un porcentaje de volumen del 40%, la TBA con un volumen> 50% tiene estructuras claras y dispersas en forma de aguja. Especulamos que a medida que aumenta el porcentaje de volumen de TBA, el diámetro de los cristales en forma de aguja se vuelve más pequeño, lo que da como resultado un aumento en el área de superficie específica y, por lo tanto, un aumento en la tasa de sublimación.

Morfología superficial del codisolvente de TBA / agua de diferente porcentaje de volumen de TBA por microscopio óptico (aumento de × 100). un 40%. b 50%. c 60%. d 70%. e 80%

Además, también medimos la presión de vapor saturado del sistema de codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen a 25 ° C. La Figura 5 es un gráfico de barras de los cambios en la presión de vapor saturado del sistema codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen de TBA. Como se muestra en la figura, la presión de vapor saturado del disolvente mixto tiende a aumentar gradualmente a medida que aumenta el porcentaje en volumen de TBA. Como la temperatura se correlaciona positivamente con la presión de vapor saturado, según la ecuación de Antoine (Ec. 2), podemos deducir que la presión de vapor saturado del sistema de codisolvente bajo la temperatura de liofilización (- 50 ° C) aumentará a medida que el porcentaje de volumen de TBA aumenta, y esta puede ser una de las razones del aumento gradual en la tasa de sublimación.

$$ {\ log} _ {10} p =A- \ frac {B} {T} $$ (2)

donde p es la presión de vapor, T es la temperatura, A y B son constantes específicas del componente.

Presión de vapor saturada de codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen (media ± DE, n =3)

Efecto de la liofilización sobre las propiedades físicas y químicas de GA en el sistema de codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen

Con el fin de investigar el efecto de la liofilización sobre las propiedades fisicoquímicas de GA en el sistema de codisolvente de TBA / agua, se realizó el siguiente experimento. Se disolvieron diez miligramos de GA en 8 ml de codisolvente de TBA / agua de diferentes porcentajes de volumen de TBA (40%, 50%, 60%, 70% y 80%). Después de esterilizar la solución monofásica mediante filtración a través de poros de 0,22 µm, se llenaron viales de liofilización de 10 ml con un volumen de llenado de 2,0 ml. La liofilización se llevó a cabo a -50 ° C durante 24 h mediante liofilizador.

Los espectros de DSC del polvo liofilizado después de disolver GA en un sistema codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen de TBA se muestran en la Fig. 6a. La curva de DSC del fármaco crudo muestra un pico endotérmico obvio a 301 ° C, que es el punto de fusión de GA. La liofilización en un sistema de codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen de TBA provocó un desplazamiento hacia adelante del pico de fusión de GA. La magnitud del cambio del pico de fusión aumentó a medida que disminuyó el porcentaje de volumen de TBA.

DSC ( a ), XRD ( b ) y FTIR ( c ) de GA después de la liofilización en codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen; (a) GA, (b) 40% TBA, ( c ) 50% TBA, (d) 60% TBA, (e) 70% TBA, y (f) 80% TBA

Investigaciones anteriores ya han demostrado que la concentración de TBA puede afectar profundamente la formación de una mezcla compleja de fases cristalinas, amorfas o metaestables [28]. En algunos casos, el uso de TBA puede resultar en una reducción de la cristalinidad, y otro caso es el opuesto [29].

Los espectros de difracción de rayos X (XRD) del polvo liofilizado después de disolver GA en un sistema codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen de TBA se muestran en la Fig. 6b. El espectro XRD del fármaco crudo muestra varios picos de difracción de cristal distintos entre 5 ° y 20 °. La liofilización en un sistema codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen de TBA provocó la desaparición de los picos de difracción entre 5 ° y 20 ° en los espectros XRD de las muestras. Esto indicó que el cristal de la droga original se había vuelto amorfo.

Los espectros FTIR del polvo liofilizado después de disolver GA en un sistema codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen de TBA se muestran en la Fig. 6c. La forma del espectro FTIR del fármaco crudo es consistente con la del polvo liofilizado en el sistema de codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen de TBA dentro de los 4000–400 cm ⁻¹ rango. No hubo aparición de picos característicos para nuevos grupos funcionales, lo que demuestra que la estructura química de GA se mantuvo igual después de la liofilización en TBA con diferente porcentaje de volumen.

El cambio de una forma cristalina a una amorfa puede alterar la solubilidad del fármaco, lo que afecta la encapsulación de proliposomas durante la reconstrucción hidratada. En este estudio, medimos la solubilidad acuosa del polvo de GA liofilizado a 25 ° C. Encontramos que la solubilidad saturada del GA liofilizado en agua disminuyó gradualmente de 64,10 a 19,27 μg / ml a medida que el porcentaje de volumen de TBA aumentó de 40 a 80%. Sin embargo, todavía era significativamente más alta que la solubilidad en agua del fármaco crudo (6,36 μg / ml), lo que indica que el cambio de una estructura cristalina a una amorfa durante la liofilización afecta la solubilidad del fármaco crudo (Fig. 7).

Solubilidad acuosa de la liofilización de GA en codisolvente de TBA / agua con diferente porcentaje de volumen (media ± DE, n =3)

Experimento de factor único

Hay muchos factores que pueden influir en la calidad de los liposomas. Es bien sabido que las proporciones fosfolípido / fármaco tienen un efecto sobre la calidad del encapsulado del fármaco [30]. Cantidades moderadas de colesterol pueden aumentar la disposición ordenada de la membrana lipídica y la estabilidad. Sin embargo, un alto contenido de colesterol en el liposoma puede disminuir la flexibilidad de la membrana y, por lo tanto, dificultar la penetración del fármaco en la bicapa lipídica [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:

$$ \mathrm{Score}=\frac{\mathrm{EE}}{\mathrm{MEE}}\times 50\%-\frac{\mathrm{MD}}{\mathrm{MMD}}\times 50\% $$ (3)

where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.

The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w / w ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w / w ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.

Parameter Optimization by Box-Benhnken Design

To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X ₁ ), quantity of cholesterol (X ₂ ), volume percentage of TBA (X ₃ ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y ₁ ) and mean diameter (Y ₂ ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y ₁ y Y ₂ have the same weightiness (importance). Y ₁ had to be maximized, while Y ₂ had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P <0,05). In this case, X ₁ , X ₂ , X ₁ X ₂ , X ₁ X ₁ , X ₂ X ₂ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X ₁ and X ₂ ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P  > 0.05). In this case, X ₃ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X ₁ ) and quantity of cholesterol (X ₂ ) do not have a significant effect (P  > 0.05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.

In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X ₁ , X ₂ , and X ₃ under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X ₁ and X ₂ have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X ₃ had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X ₃ and the other two factors.

Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter

Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.

Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant

Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w / w ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.

The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean  ±  SD, n =3)

Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.

Transmission Electron Microscopy

In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.

Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes

Stability of GA Proliposome

After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.

In Vitro Drug Release Studies

Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P  = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.

In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n =3)

In Vitro Cell Uptake

Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.

In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. un The uptake amount versus incubation time. b - e Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min

Conclusions

In the present work, preformulation investigation, formulation design along with in vitro characterization of GA-loaded liposomes by lyophilization monophase solution method have been done. After carrying out a preformulation study, we found that solubility of GA, cholesterol, and SPC in TBA/water co-solvent was substantially increased when temperature was over 40 °C. Sublimation rate of co-solvent gradually increased with increasing TBA volume percentage, which perhaps relate to surface morphology of the frozen co-solvent and saturated vapor pressure. After lyophilization using TBA/water co-solvent system, GA became amorphous structure; moreover, water solubility increased. This may have an effect on proliposome encapsulation during hydrated reconstruction. After optimization by Box-Benhnken design and screening of lyoprotectant, the optimum conditions (508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volume percentage of TBA, 4:1 trehalose/SPC weight ratio) for lyophilization monophase solution process were achieved. Under the optimum conditions, satisfactory encapsulation efficiency (74.87%) and mean diameter (191 nm) of reconstituted liposomes were obtained. The reconstituted liposomes resulted in initial assemble and final spherical shape, as confirmed by TEM analysis. The in vitro release profile of the produced GA-loaded liposome was investigated in the two media and it both showed prolonged release during 12 h. Cellular uptake studies showed that the uptake process of reconstituted liposomes by Hep G2 cells is time-dependent.

Abreviaturas

BBD:

Box-Benhnken design

DSC:

Calorimetría diferencial de barrido

EE:

Encapsulation efficiency

FTIR:

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

GA:

Glycyrrhetinic acid

MD:

Mean diameter

SPC:

Soybean phosphatidylcholine

TBA:

Tert-butyl alcohol

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

XRD:

Difracción de rayos X

Inhibidor de la autofagia (LY294002) y nanoliposoma a base de combinación de 5-fluorouracilo (5-FU) para una eficacia mejorada contra el carcinoma de células escamosas de esófago Nanoencapsulación de aceite:desarrollo, aplicación e incorporación al mercado de alimentos