Cambio espectral rojo en la detección colorimétrica sensible de la tuberculosis por el complejo antígeno-anticuerpo ESAT-6:una nueva estrategia con nanopartículas de oro

Resultados y discusión

Aquí se siguió el ensayo colorimétrico basado en anticuerpos que muestra los cambios espectrales como un desplazamiento al rojo para detectar ESAT-6. La Figura 1a muestra la representación esquemática del ensayo colorimétrico basado en anticuerpos de una sola etapa; en presencia de ESAT-6, se espera que el cambio de color en la solución GNP sea azul con cambio espectral rojo al perder la estabilidad del GNP bajo una alta concentración de un ion divalente, NaCl, mientras que, en ausencia de ESAT-6, GNP es estable debido a la unión del anticuerpo anti-ESAT-6 en la superficie de GNP y conduce a retener su color rojo original incluso a una alta concentración de NaCl. Esta estrategia se confirmó utilizando el CFP-10 no específico contra el anticuerpo anti-ESAT-6 y se suponía que mostraba una solución de GNP de color rojo (Fig. 1b). Dado que la CFB-10 es también la principal proteína que causa la tuberculosis, aquí la usamos como proteína de control [26]. Generalmente, para este tipo de ensayo basado en GNP, el GNP de 13 a 15 nm es muy adecuado para alcanzar la mayor sensibilidad [27], y aumentar el tamaño de GNP no es adecuado para alcanzar el buen límite de detección. Es debido a la razón por la cual el tamaño creciente del GNP necesita una mayor cantidad de anticuerpos para unirse a la superficie del GNP. Si una mayor cantidad de anticuerpos se une a la superficie, se obtiene un resultado falso negativo. Aquí, deseamos usar 15 nm GNP y logramos la máxima sensibilidad al nivel subpicomolar.

Optimización de iones divalentes para agregación controlada de GNP

Para esta optimización de detección, usamos NaCl para la agregación de GNP. Cuando analizamos la concentración necesaria de NaCl como se muestra en la Fig. 2, se agregaron diferentes concentraciones de NaCl al GNP, el color de la solución comenzó a aparecer como azul, lo que indica la agregación con 100 mM de NaCl. Y también en el espectro, se vio claramente que solo con el GNP agregado (concentraciones de NaCl de 100 a 800 mM), hay un corrimiento al rojo en la longitud de onda ~ 600 nm, mientras que el GNP disperso (concentraciones de NaCl de 0 a 50 mM) aún mantienen su espectro a ~ 500 nm. Sin embargo, hay un cambio espectral de pico insignificante con 50 mM de NaCl. A partir de estos resultados, se concluyó que necesitamos al menos 100 mM de NaCl para la agregación de GNP, pero para obtener la sensibilidad mejorada, usamos una concentración más alta (800 mM) de NaCl para experimentos adicionales. Previamente, el rango similar de NaCl para la agregación del PNB fue mostrado por Gopinath et al. [10].

Optimización de iones divalentes. Se mezclaron de 0 a 800 mM de NaCl con GNP constante (1 O.D.). Después de 15 min, se escaneó a la longitud de onda de 400 a 800 nm. Las fotografías fueron tomadas con la cámara digital como se muestra en el recuadro de la figura. Los cambios de espectro y color están indicados por la agregación de GNP con NaCl 100 mM. Los picos se indicaron con las esferas de colores respectivos

Optimización de anticuerpos ESAT-6 para la dispersión de GNP

Después de la optimización de NaCl, a continuación, determinamos la concentración adecuada de anticuerpo anti-ESAT-6 para llevar a cabo los experimentos. Dado que la sensibilidad depende en gran medida de la concentración de anticuerpo, es necesario desear la concentración adecuada de anticuerpo anti-ESAT-6 para inducir la dispersión de GNP. La noción subyacente es que, si se desea la concentración mínima de anticuerpo, se puede formar fácilmente un complejo con la adición de la diana y no hay moléculas libres para unir en el GNP, mientras que, si hay varios anticuerpos disponibles, cuando tratamos de detectar el baja concentración de ESAT-6, solo una pequeña cantidad de anticuerpos forman complejos. Luego, el anticuerpo restante se une a la superficie de GNP e induce la estabilidad de GNP, lo que provoca una menor sensibilidad. La IgG del anticuerpo tiene un peso molecular más alto (~ 150 kDa), lo que hace que los anticuerpos libres se unan fácilmente a la superficie GNP por interacción electrostática o enlace iónico / hidrógeno entre los grupos aniónicos terminados en la superficie en la superficie GNP [28]. Debido al mayor peso molecular, el número de anticuerpos es menor, y aquí, se equilibró con ESAT-6 de peso molecular de 6 kDa, que tiene más moléculas incluso a una concentración más baja. Como se muestra en la Fig. 3a, primero agregamos desde la concentración más baja de anticuerpo anti-ESAT-6 (30 nM) y aumentamos hasta la concentración máxima (500 nM) al GNP. Se demostró que 30 nM de anticuerpo anti-ESAT-6 con GNP está en transición de agregación incluso con NaCl 800 mM, debido a que no hay suficientes anticuerpos disponibles en la superficie de GNP, pero a partir de 60 nM de anticuerpo anti-ESAT-6, el La solución ha mantenido su color rojo debido al número suficiente de anticuerpos anti-ESAT-6 que se unen a la superficie GNP. Hasta que se probó la concentración máxima (500 nM), el color GNP se mantuvo en color rojo con una alta estabilidad. Después de decidir que la concentración adecuada era 60 nM de anticuerpo, para comprobar la estabilidad del anticuerpo anti-ESAT-6 y los conjugados de GNP, intentamos aumentar las concentraciones de NaCl. Como se muestra en la Fig. 3b, el conjugado GNP de anticuerpo preparado (anticuerpo 60 nM con GNP) es muy estable incluso con la adición de NaCl 1 M. El espectro de la figura 3c también muestra el mismo resultado que la detección visual; Los conjugados GNP de anticuerpo anti-ESAT-6 preparados conservan su pico en ~ 520 incluso con una alta concentración de NaCl y, al mismo tiempo, solo el GNP conduce a la agregación con NaCl 800 mM con el pico máximo en ~ 500 nm.

Optimización y estabilidad de anticuerpos ESAT-6. Se probaron diferentes concentraciones de anticuerpo anti-ESAT-6 usando NaCl 800 mM. un Agregación o dispersión de GNP con el anticuerpo anti-ESAT-6 (0 a 500 nM); La flecha indica la región de transición para la concentración óptima de anticuerpos. b Estabilidad de 60 nM de GNP complejado con anticuerpos con diferentes concentraciones de NaCl (0,012 a 1000 mM). c Espectros para diferentes complejos. Los picos se indicaron con las esferas de colores respectivos

Detección de ESAT-6 mediante el uso de anticuerpos precomplejados mediante el cambio espectral rojo colorimétrico y la validación de la bioincrustación ESAT-6

Dado que el anticuerpo de 60 nM muestra una excelente estabilidad, inicialmente, intentamos detectar ESAT-6 complejado con 60 nM de anticuerpo anti-ESAT-6. ESAT-6 es la proteína de menor peso molecular con un tamaño de 6 kDa y ha optado bien por el ensayo colorimétrico. Antes de realizar el experimento de detección, verificamos la contaminación biológica de ESAT-6 en la superficie GNP; Debido a que existe la posibilidad de que ESAT-6 se una a GNP, puede dar lugar a un falso positivo o falso negativo. Como se muestra en la Fig. 4, en ESAT-6 con la concentración hasta 100 nM, GNP no fue estable a 800 mM de NaCl, lo que indica que ESAT-6 no se une electrostáticamente a la superficie de GNP. Este no ensuciamiento también insinuó que la composición de aminoácidos de ESAT-6 está jugando un papel importante en este ensayo. Después de esta confirmación, detectamos ESAT-6 precomplejado con 60 nM de anticuerpo anti-ESAT-6. Se complejaron diferentes concentraciones de ESAT-6 con la concentración constante (60 nM) de anticuerpo y luego se agregaron a GNP. Finalmente, se agregaron 800 mM de NaCl para evaluar la agregación con el desplazamiento espectral rojo. Como se muestra en la Fig. 5a (recuadro), la detección de ESAT-6 de 0,5 nM a 500 nM ha confirmado un cambio de color claro con las transiciones en comparación con el control (con sólo 60 nM de anticuerpo). El color de las soluciones ha cambiado de rojo a azul incluso a 0,5 nM y se ha intensificado más a 15 nM, y podría deberse a la saturación completa con ESAT-6. Parece que no queda ningún anticuerpo para unirse a GNP incluso a 0,5 nM. Con referencia a la representación gráfica de la Fig. 5a, de 15 a 500 nM de ESAT-6 muestra la saturación completa. Se demuestra claramente a partir de la Fig. 5b que el espectro del experimento de control (sin proteína ESAT-6) exhibe un perfil agradable a ~ 500 nm, mientras que con ESAT-6 con 0,5 y 500 nM, los espectros se desplazaron al rojo. A partir de estos resultados, se concluyó que podemos detectar la proteína ESAT-6 desde 0,5 nM y aún así bajar a concentraciones más bajas debido a la apariencia de color azul obvio.

Prueba de ensuciamiento de ESAT-6 en la superficie GNP. Se mezclaron diferentes concentraciones de ESAT-6 con GNP y, después de 30 min, se agregaron 800 mM de NaCl. También se muestra una representación esquemática. La aparición de un color azul indica la agregación

Detección de ESAT-6 a concentraciones más altas. un Representación gráfica para la detección de ESAT-6. Se mezclaron diferentes concentraciones de ESAT-6 con 60 nM de anticuerpo y, después de 30 min de incubación, se añadió GNP. Luego se agregaron 800 mM de NaCl para inducir el cambio de color. Se detectó ESAT-6 de 0,5 nM con el cambio de color claro (rojo a azul). Las fotografías fueron tomadas con la cámara digital como se muestra en el recuadro de la figura. b Cambios espectrales en la longitud de onda de 400 a 800 nm. Los picos se indicaron con las esferas de colores respectivos

Límite de detección de ESAT-6 por el cambio espectral rojo colorimétrico

Dado que 60 nM de anticuerpo anti-ESAT-6 mostraron una mejora aparente para la detección de ESAT-6, para averiguar el límite de detección, ajustamos con ESAT-6 más abajo hasta el picomolar más bajo (1,25 pM a 5000 pM ). Como se muestra en la Fig. 6a, a partir de 1,25 pM de ESAT-6, se inicia el color azul debido a la formación del complejo entre ESAT-6 y el anticuerpo. Desde 2,5 pM, el color de la solución que ha cambiado a azul se ha intensificado y retuvo los cambios de color con concentraciones adicionales. En el experimento de control (sin ESAT-6), el color de la solución parecía ser rojo, lo que apoya la especificidad del experimento actual (Fig. 6a). Este resultado también fue confirmado por el espectro que se muestra en la Fig. 6b. Con la solución de control, no hay cambios en el espectro, pero desde 1,25 hasta 5 nM de proteína ESAT-6, los espectros se desplazaron al rojo hacia 600 nm. A 5 nM de ESAT-6, se observó un cambio espectral completo con picos máximos. Con base en estos resultados experimentales, podríamos concluir que el límite de detección de ESAT-6 está alrededor del picomolar más bajo (1.25 pM) usando el precomplejo de anticuerpos ESAT-6.

Límite de detección de ESAT-6 mediante el ensayo colorimétrico basado en anticuerpos. un Representación gráfica para la detección de ESAT-6. Se mezclaron diferentes concentraciones de ESAT-6 con 60 nM de anticuerpo y, después de 30 min de incubación, se añadió GNP. Luego, se agregaron 800 mM de NaCl para inducir el cambio de color. La proteína ESAT-6 se tituló desde 1,25 pM hasta 5000 pM. Las fotografías fueron tomadas con la cámara digital como se muestra en el recuadro de la figura. b Cambios espectrales en la longitud de onda de 400 a 800 nm. Los picos se indicaron con las esferas de colores respectivos

Ajuste con especificidad

Dado que pudimos detectar ESAT-6 con 60 nM de anticuerpo anti-ESAT-6, a continuación, probamos la misma detección con una concentración un poco alta de anticuerpo anti-ESAT-6 para que fuera 75 nM. Los resultados obtenidos se encuentran en la Fig. 7a. Se ha encontrado que se produjo un ligero cambio de color usando 75 nM de anticuerpo precomplejado a 850 pM de ESAT-6. Aumentamos la concentración de ESAT-6 a 100 nM y pudimos observar el progreso en los cambios de color a azul. Con estos experimentos, se observó que el límite de detección estaba en el rango nanomolar usando anticuerpos precomplejados 75 nM. Finalmente, para confirmar la especificidad de la unión de ESAT-6, también probamos un ensayo similar utilizando un precomplejo de proteína anti-ESAT-6 y CFP-10 de M. tuberculosis . Los resultados se ven claramente que solo ESAT-6 tiene la especificidad y CFP-10 puede ser el control apropiado (Fig. 7b). En general, a partir de los resultados anteriores, se descubrió que la optimización de la concentración de anticuerpos es obligatoria para mejorar la sensibilidad del ensayo colorimétrico.

Detección de ESAT-6 con anticuerpo anti-ESAT-6 75 nM. un Representación de cambios de color. Se mezclaron diferentes concentraciones de ESAT-6 con 75 nM de anticuerpo y, después de 30 min de incubación, se añadió GNP. Luego, se agregaron 800 mM de NaCl para inducir el cambio de color. Se detectó ESAT-6 de 0,85 nM con el cambio de color claro (rojo a azul). Las fotografías fueron tomadas con una cámara digital. b Cambios espectrales en la longitud de onda de 400 a 800 nm. Los picos se indicaron con las respectivas esferas coloreadas. El ensayo de especificidad se llevó a cabo utilizando CFP-10 y demostró ser un control negativo