Evaluación de la actividad del citocromo P450 3A4 inhibido por nanopartículas de oro y los mecanismos moleculares que subyacen a su toxicidad celular en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano C3A

Resultados y discusión

Caracterización fisicoquímica de PC AuNP de plasma desnudo y humano

Los efectos del tamaño de NP, la carga superficial y la formación de PC en plasma humano alrededor de AuNP sobre el diámetro hidrodinámico (D _H ), el índice de polidispersidad (PDI), el potencial z y una propiedad espectral, así como la morfología, se han caracterizado mediante espectroscopía DLS, TEM y UV-Vis (Fig. 1). En las imágenes TEM, todo el AuNP desnudo (sin PC) en agua DI estaba monodisperso con la distribución de tamaño ajustada y los rangos de espectro UV-Vis únicos de 521–553 nm (Fig. 1a). Se observaron formaciones de PC alrededor de AuNP con los cambios en la distribución del tamaño y los desplazamientos al rojo de los espectros de absorción (Fig. 1b). La D _H y los valores de PDI de 40 y 80 nm desnudo y PC AuNP en EMEM completo fueron compatibles hasta 24 ha 37 ° C excepto para el PC BPEI-AuNP de 40 y 80 nm que mostraron una disminución en los valores de PDI (0.29 y 0.32, respectivamente ) a las 24 ha 37 ° C en comparación con las de 0 ha 37 ° C (0,62 y 1,0, respectivamente) (Tabla 1). Los valores de potencial Z de todos los AuNP desnudos y PC disminuyeron relativamente a las 24 ha 37 ° C en comparación con los de 0 ha 37 ° C. Se observó una agregación de PC BPEI-AuNP de 40 y 80 nm en PBS y EMEM completo, que se correlacionó con múltiples picos en una distribución de tamaño y cambios en D _H y corrimientos al rojo de los espectros de absorbancia en relación con el BPEI-AuNP desnudo (Fig. 1 y archivo adicional 1:Figura S1, Tabla 1). Estos resultados fueron respaldados por estudios recientes de que el PC de 40 y 80 nm y el BPEI-AuNP recubierto por corona de albúmina de suero humano se agregaron en PBS y varios medios de cultivo celular [7, 8, 9].

Micrografías electrónicas de transmisión de a AuNP en agua desionizada y b PC AuNP en PBS a 0 ha 25 ° C, longitud de onda de los espectros UV-Vis (recuadro superior) y distribución dinámica de la dispersión de luz (recuadro inferior). Las flechas indican la formación de PC. PC corona de proteínas plasmáticas humanas, BPEI polietilenimina ramificada, LA ácido lipoico, PEG polietilenglicol

Citotoxicidad AuNP

La citotoxicidad de AuNP se midió utilizando la concentración letal media (LC ₅₀ ) en células C3A. La carga superficial de NP, el tamaño de partícula y la formación de PC alrededor de LC ₅₀ dependiente de NP Los análisis con AuNP se muestran en la Fig. 2. Todas las BPEI-, LA y PEG-AuNP de 40 nm y las BPEI-AuNP de 80 nm fueron citotóxicas para las células C3A con la LC ₅₀ correspondiente oscila entre 127,3 y 205,5 μg / cm ² (Figura 2a). El PEG-AuNP desnudo de 80 nm mostró una viabilidad celular del 59% a la concentración más alta de 250 μg / cm ² , mientras que los LA-AuNP de 80 nm no fueron citotóxicos. La PC redujo la toxicidad de AuNP en función del tamaño y la modificación de la carga superficial, excepto por el BPEI-AuNP de 80 nm que mostró una viabilidad celular del 51% a 250 μg / cm ² a las 24 h (Fig. 2b). Estudios recientes demostraron que el BPEI-AuNP desnudo de 40 nm era tóxico para los hepatocitos humanos primarios, HUVEC y las células del túbulo proximal renal humano (HPTC) (LC ₅₀ rangos de 22,4 a 80,3 μg / cm ² ) [7,8,9]. Los BPEI-AuNP recubiertos con PC eran citotóxicos para los hepatocitos humanos, pero los AuNP recubiertos con HSA no eran citotóxicos [7]. Estos resultados sugirieron que las células C3A son más resistentes a la toxicidad de AuNP que las células humanas primarias debido a una alta tasa de proliferación y actividad metabólica de la línea celular cancerosa [31].

Viabilidad de C3A y LC ₅₀ valores de 40 y 80 nm a AuNP y b PC AuNP. Los datos representan la media ± S.D. ( n =3). Corona de proteína plasmática humana PC, ND no determinado, polietilenimina ramificada BPEI, ácido lipoico LA, polietilenglicol PEG, LC ₅₀ concentración letal media

Captación intracelular de AuNP

La captación celular dependiente del tamaño de NP, de la carga superficial y de la PC de todas las AuNP desnudas y de PC se determinó en 1,56 μg / cm ² hasta 24 h. ANOVA mostró cambios significativos con el tamaño, el PC y el tiempo ( p <0,0001) e interacciones (PC × tamaño, PC × tiempo, tamaño × tiempo y PC × tamaño × tiempo) ( p <0,001) para toda la captación de AuNP además de una interacción insignificante (PC × tamaño) para la captación de LA- y PEG-AuNP ( p =0,2). Como se muestra en la Fig. 3a-f, se observó un aumento lineal en la captación celular de 40 y 80 nm desnudo y PC AuNP además de 40 nm desnudo y PC BPEI-AuNP que alcanzaron la mayor captación celular a las 6 h y luego disminuyó ( Figura 3a). Sin embargo, a las 24 h, el BPEI-AuNP catiónico de 40 nm contenía la absorción más alta seguida de PEG-AuNP neutro de 40 nm y luego LA-AuNP aniónica de 40 nm, que se asoció con el orden de citotoxicidad de las células C3A de AuNP (Fig. 2a ). Este resultado es consistente con los estudios previos de que la poli (N- (2-aminoetil) acrilamida) catiónica y BPEI-AuNP tuvieron la mayor absorción celular en comparación con las del poli (ácido acrílico) aniónico, y LA-AuNP y poli neutro ( N- (2,3-dihidroxipropil) acrilamida y PEG-AuNP en células Caco-2 de adenocarcinoma colorrectal humano, HPTC y hepatocitos humanos [9, 32]. Además, el complejo NP-PC atenuó todos los BPEI de 40 y 80 nm. y LA-AuNP y el PEG-AuNP de 40 nm en las células C3A, pero aceleraron la captación de PEG-AuNP de 80 nm (Fig. 3f). Estos resultados están respaldados por estudios recientes de que la PC inhibe la captación de AuNP en HUVEC, HEK y HPTC, independientemente del tamaño y la carga superficial [8, 9, 33]. Por el contrario, las coronas de PC y HSA mejoraron la captación de PEG-AuNP de 40 nm en los hepatocitos humanos, pero esta última indujo la captación de PEG-AuNP de 80 nm en HEK [7, 33] .

Captación celular dependiente del tiempo de 40 nm a BPEI-AuNP, b LA-AuNP y c PEG-AuNP y el d de 80 nm BPEI-AuNP, e LA-AuNP y f PEG-AuNP en ausencia y presencia de PC en células C3A hasta 24 h. Los datos representan la media ± S.D. ( n =3). Las letras fueron significativamente diferentes según la prueba HSD de Tukey. BPEI polietilenimina ramificada, LA ácido lipoico, PEG polietilenglicol, PC corona de proteína plasmática humana, MSD diferencia mínima significativa. * p <0,05; ** p <0,005; *** p <0,0001

Medidas de estrés oxidativo y nitrosativo

Dado que el BPEI y el PEG-AuNP desnudos de 40 nm exhibieron una mayor citotoxicidad y absorción celular en las células C3A en comparación con otros AuNP, se seleccionaron para investigar el estrés oxidativo / nitrosativo inducido por AuNP. Ambos AuNP modularon la generación de ROS / RNS en células C3A de manera dependiente del tiempo y de la concentración ( p <0,0001) y por interacción (tiempo × concentración, p <0,0001). Como se muestra en la Fig. 4a, la generación de ROS / RNS disminuyó a las concentraciones más altas de BPEI-AuNP de 40 nm (62,5 μg / cm ² y 125 μg / cm ² ) a 1 ha 37 ° C pero aumentó hasta 24 h. Por el contrario, el PEG-AuNP de 40 nm suprimió sustancialmente la generación de ROS / RNS a 39,1 μg / cm ² en adelante con un cambio de pliegue <0,5 hasta 24 h (Fig. 4b). La activación de la muerte celular a menudo contribuye a la toxicidad del NP y, en la mayoría de los casos, un aumento en la producción de ROS / RNS, que conduce al estrés oxidativo, es responsable de la toxicidad del NP [34]. La producción de ROS / RNS dependiente de la carga superficial se observó con BPEI catiónico de 40 nm y PEG-AuNP neutro. El BPEI-AuNP de 40 nm mostró un patrón bifásico de generación de ROS / RNS (antioxidante a la 1 hy prooxidante a las 3 h en adelante) a altas concentraciones, que se asoció con su citotoxicidad en las células C3A (Fig. 2a). Este resultado es consistente con los estudios previos de que la generación de ERO inducida por BPEI-AuNP de 40 y 80 nm y la generación de ROS inducida por citrato-AuNP de 20 nm se asoció con sus citotoxicidades en hepatocitos humanos y células HepG2, respectivamente, de manera dependiente del tiempo y de la concentración. [7, 35]. AuNP mostró citotoxicidad inducida por estrés oxidativo en células de leucemia promielocítica humana, HL-60 con una reducción total de glutatión, independientemente del tamaño [19]. Por el contrario, el PEG-AuNP de 40 nm sirvió como antioxidante, lo que sugiere que el estrés oxidativo / nitrosativo puede no ser un mecanismo directo de la citotoxicidad inducida por PEG-AuNP de 40 nm en las células C3A (Fig. 2b).

Producción de ROS / RNS dependiente del tiempo y de la concentración en células C3A expuestas a a el BPEI-AuNP de 40 nm y b el PEG-AuNP de 40 nm hasta 24 h. Los datos representan la media ± S.D. ( n =3). Las letras fueron significativamente diferentes según la prueba HSD de Tukey. BPEI polietilenimina ramificada, LA ácido lipoico, PEG polietilenglicol, CTRL control, MSD una diferencia mínima significativa, PCN piocianina (inductor de ROS). ** p <0,005; *** p <0,0001

Medición de la actividad CYP3A4

Se caracterizaron los efectos inhibidores de 40 y 80 nm desnudos y PC AuNP sobre la actividad de CYP3A4. Como se muestra en la Fig.5, el BPEI-, LA- y PEG-AuNP de 40 nm y el BPEI-AuNP de 80 nm en LC ₅₀ Los valores inhibieron la actividad catalítica de CYP3A4 en células C3A con la correspondiente actividad de 20,1 a 31,4% en relación con los controles, independientemente del tamaño y la carga superficial. Las concentraciones no tóxicas de LA- y PEG-AuNP de 80 nm también suprimieron su actividad (31,4 y 26,6%, respectivamente). Sin embargo, la PC mejoró ampliamente la inhibición de CYP3A4 inducida por AuNP de 40 y 80 nm además de la PEG-AuNP de 40 y 80 nm que muestra una actividad del 63 y 46% en comparación con los controles. Esto concuerda con estudios in vitro con tejido hepático humano y hepatocitos en los que el ácido tánico aniónico-AuNP y el BPEI-AuNP catiónico de 40 y 80 nm inhibieron sustancialmente la actividad catalítica de CYP3A4 [7, 25]. En contraste, PEI-AuNP catiónico y polivinilpirrolidona-AuNP neutra inducen la expresión de ARNm de CYP1A2, CYP2C9 y CYP3A4 en células HepG2 y CYP2B y CYP3A en corte de hígado de rata, respectivamente [36, 37]. Un estudio reciente informa que el BPEI-AuNP desnudo y PC de 40 y 80 nm suprimió sustancialmente la actividad de CYP3A4 en los hepatocitos humanos mediante un cambio conformacional en la proteína o bloqueando el bolsillo del sustrato como una inhibición reversible [7].

Un efecto inhibidor de AuNP sobre la actividad de CYP3A4 en células C3A expuestas a BPEI-, LA- y PEG-AuNP de 40 y 80 nm en ausencia y presencia de PC durante 24 h. Los valores representan la media ± S.D. ( n =3). BPEI polietilenimina ramificada, LA ácido lipoico, PEG polietilenglicol, PC corona de proteínas plasmáticas humanas

Perfil de expresión génica centrada en la vía de toxicidad del PEG-AuNP de 40 nm

De los genes representativos que cubren 13 vías diferentes de estrés y toxicidad, se expresó diferencialmente un total de 212 genes (↓ 186 y ↑ 26 genes) en LC ₅₀ valor del PEG-AuNP de 40 nm (Fig. 6, archivo adicional 1:Tablas S2-S7). El 12,3% (26 genes, ↓ 26, ↑ 0 genes) del total de genes (212 genes) participaron predominantemente en la β-oxidación de ácidos grasos mitocondriales; para apoptosis 11,3% (24 genes, ↓ 18, ↑ 6 genes); para la vía de reparación y daño del ADN 11,3% (24 genes, ↓ 18, ↑ 6 genes); y para la respuesta al choque térmico 11,3% (24 genes, ↓ 22, ↑ 2).

Genes representativos implicados en a β-oxidación de ácidos grasos mitocondriales, b apoptosis, c estrés oxidativo y respuestas antioxidantes, y d transportadores de captación y eflujo hepático a LC ₅₀ valor de 40 nm de PEG-AuNP. Todos los datos tuvieron un cambio de veces <- 2 y> 2 en p <0,05. El análisis de ontología genética se enumera en el archivo adicional 1:Tablas S2 – S7

En la vía de oxidación β de ácidos grasos mitocondriales, genes que codifican tres enzimas diferentes involucradas en la producción de acil-CoA y equivalentes reductores de NADH y FADH ₂ fueron principalmente suprimidos; Genes ACAD11, ACAD9, ACADM y ACADS en acil-CoA deshidrogenasas (2,0 a 13,6 veces); ACAA1 y ACAA2 en cetoacil-CoA tiolasas (7,3 a 14,9 veces); DECR1, ECHS1, EHHADH y HADHA (10,7 a 18,9 veces) en enoil-CoA hidratasa (Fig. 6a, archivo adicional 1:Tabla S2). La β-oxidación de ácidos grasos mitocondriales juega un papel importante en la producción de acil-CoA y en la reducción de equivalentes de NADH y FADH ₂ , que se asocia con cuatro enzimas principales (acil-CoA deshidrogenasas, enoil-CoA hidratasas, hidroxiacil-CoA deshidrogenasas y cetoacil-CoA tiolasas [38, 39]). Además, los portadores de electrones, NADH y FADH ₂ , están involucrados en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la cadena respiratoria mitocondrial, lo que resulta en la producción de ATP. En el estudio actual, el PEG de 40 nm indujo una disfunción mitocondrial, una pérdida de mantenimiento de ATP a través de una disminución en los niveles intracelulares de ATP y FADH ₂ , definiendo consecuentemente su citotoxicidad en células C3 (Fig. 2a). El fenómeno similar se informó en hepatocitos humanos, HUVEC y HPTC, expuestos a 40 nm BPEI-AuNP, lo que indica que la disfunción mitocondrial puede ser un mecanismo común de toxicidad AuNP, independientemente de la carga superficial y los tipos de células [7,8,9]. Un estudio reciente informó que se observó citotoxicidad relevante para la disfunción mitocondrial en células epiteliales de cáncer de próstata inmortalizadas y células epiteliales de cáncer de pulmón en respuesta a un inhibidor de la fosforilación de STAT3, OPB-51602 [40].

En la vía de la apoptosis, los seis genes proapoptóticos de CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A, TNFRSF10B y TNFSF10 estaban regulados positivamente, mientras que los seis genes antiapoptóticos de AKT1, ALB, BCL2, BCL2L1, MCL1 y XIAP estaban regulados negativamente (Fig. .6b, archivo adicional 1:Tabla S3), que se correlacionó con la citotoxicidad dependiente de la dosis en las células C3A (Fig. 2a). En el punto de control de reparación y daño del ADN, los genes de las quinasas del punto de control (CHEK1 / 2), los genes de reparación por escisión del ADN (ERCC1 / 2/3) y la ligasa IV del ADN (LIG4) se regularon positivamente, pero otros genes de reparación por escisión (ERCC5 / 6, XRCC1 / 5), los genes de la quinasa del punto de control (CDKN1A) y de las proteínas quinasas (PRKDC) se regularon negativamente (de 2 a 19 veces). Estos resultados sugirieron que la interferencia inducida por PEG-AuNP de 40 nm con el ciclo celular y el sistema de reparación del ADN puede correlacionarse con una inducción de la muerte celular en las células C3A (Fig. 2a, archivo adicional 1:Tabla S3). Los genes que codifican dos proteínas de choque térmico (HSP) diferentes (A1A y A1B) se regularon al alza (10,2 a 14,2 veces) pero HSP40 subfamilia A, B y C; Miembro 1 de HSP90; y HSP60 fueron regulados a la baja (de 2 a 16 veces) (Archivo adicional 1:Tabla S4).

En el estrés oxidativo y la respuesta antioxidante, el PEG-AuNP de 40 nm en LC ₅₀ valoran los genes antioxidantes inducidos y los prooxidantes suprimidos, lo que se asoció con una disminución en la generación de ROS / RNS siendo antioxidante en sí mismo (Fig. 4b). En los genes antioxidantes, se indujo glutatión peroxidasa (GPX) 1, GPX2, GPX4, PRDX1, PRDX2, PRDX6, superóxido dismutasa (SOD) 1 y CAT (3,8 a 18,1 veces). En los genes prooxidantes, se suprimieron TXNIP y PPP1R15B (4,8 y 17 veces, respectivamente) (Fig. 6c, archivo adicional 1:Tabla S5). Esto es consistente con un estudio previo que AuNP mostró citotoxicidad inducida por estrés oxidativo en HepG2 y hepatocitos humanos, independientemente del tamaño [7, 19].

En el metabolismo de fase I, los genes CYP3A4 y ESD se suprimieron en gran medida (7 y 12 veces, respectivamente). Especialmente, el efecto inhibidor de PEG-AuNP de 40 nm sobre la expresión de CYP3A4 se correlacionó con una disminución en la actividad de CYP3A4 (Fig. 5). Estudios recientes informaron que el BPEI-AuNP de 40 nm inhibía la expresión génica de CYP1A2, CYP2C9 y CYP3A4 en hepatocitos humanos; ESD en HUVEC; y CYP1A1 en HPTC [7, 8, 9]. El estudio epidemiológico demostró que las enzimas CYP en el tejido hepático de pacientes con CHC fueron inhibidas sustancialmente por el proceso tumorigénico a nivel molecular y funcional [41].

Perfil de expresión génica del transportador de eflujo y absorción de fármacos

El desarrollo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) por parte de las células tumorales es una de las principales causas de los fracasos del tratamiento del cáncer [42, 43]. La disminución de la absorción del fármaco mediada por transportadores de membrana integrales y el aumento del flujo de salida del fármaco, incluida la glicoproteína P (P-gp) y la proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP), es uno de los principales mecanismos de la MDR.

La expresión génica diferencial de los transportadores de captación y salida de fármacos en células C3A expuestas a PEG-AuNP de 40 nm mostró que un total de 14 genes de transportadores ABC (↓ 12 y ↑ 2 genes) y un total de 21 genes de transportadores SLC (↓ 21 y ↑ 0 genes) se modularon sustancialmente en LC ₅₀ valor (Figs. 6d y 7, archivo adicional 1:Tabla S7). En los transportadores de eflujo de fármacos de la familia ABC, los genes de la proteína asociada a la resistencia a múltiples fármacos (MRP3 / ABCC3), MRP4 (ABCC4) y la proteína regulada por el flujo de salida de colesterol (CERP / ABCA1) en la membrana basolateral se regularon negativamente (7,2 a 10,4 veces). Los genes que codifican P-gp (ABCB1), MRP2 (ABCC2), BCRP (ABCG2) y esterolina 2 (ABCG8) en los transportadores de flujo de salida canalicular también se suprimieron (8,6 a 13,8 veces). Por el contrario, la resistencia a múltiples fármacos (MDR4 / ABCB4) en la membrana canalicular y el transportador ABC de las mitocondrias (MTABC3 / ABCB6) en la membrana mitocondrial externa estaban altamente reguladas al alza (9,8 y 5,8 veces, respectivamente). En los transportadores de absorción de fármacos, también se inhibieron los genes de la proteína transportadora de cobre (CTR1 / SLC31A1) y, en menor grado, el transporte de aniones orgánicos (OAT7 / SLC22A9) (18 y 15 veces, respectivamente). Estos resultados apoyan un estudio reciente de que el BPEI-AuNP de 40 nm regula a la baja MDR3 en hepatocitos humanos pero regula al alza MRP3 en HUVEC, lo que indica una interacción dependiente de la carga superficial y del tipo celular entre AuNP y transportadores de salida [7, 8]. El estudio epidemiológico mostró que se producía una alta expresión de BCRP y una baja expresión de OCT3 en el tumor de CHC, que estaba estrechamente asociado con la progresión del tumor y su tamaño [44]. Un estudio anterior mostró que el inhibidor de la P-gp, el verapamilo, mejoraba la citotoxicidad del glutatión-AuNP conjugado con doxorrubicina en líneas celulares de fibrosarcoma felino al aumentar la concentración intracelular del fármaco [45]. El estudio actual enfatiza que la información derivada de los mecanismos en el PEG-AuNP de 40 nm identificó una acción separada pero aún complementaria sobre la β-oxidación de los ácidos grasos mitocondriales, el ciclo del TCA y la cadena respiratoria, los transportadores de flujo y captación del fármaco, así como la actividad del CYP3A4 en Células C3A (Fig. 7). Al final, esto destacará la interacción AuNP con procesos biológicos clave y su mecanismo molecular subyacente en el HCC, que puede estar aún más implicado en el desarrollo de una diana terapéutica más eficaz en el tratamiento del HCC.

Una representación esquemática de los mecanismos básicos de acción de PEG-AuNP de 40 nm en el tratamiento del HCC. Las barras verdes (una inhibición) y los triángulos rosas (una inducción) indican las rutas y marcadores biológicos modificados con PEG-AuNP de 40 nm. El análisis de ontología genética se enumera en el archivo adicional 1:Tablas S2 – S7

Para validar el análisis de expresión génica de RT ² matriz, los nueve genes se seleccionaron para PCR en tiempo real. En el archivo adicional 1:Tabla S1, los nueve genes se modularon en LC ₅₀ del PEG-AuNP de 40 nm. Estos cambios transcripcionales fueron consistentes con los del análisis de expresión génica con matrices de PCR (Fig. 6, Archivo adicional 1:Tablas S2-S7).