La posible toxicidad hepática, cerebral y embrionaria de las nanopartículas de dióxido de titanio en ratones

Métodos

Productos químicos y reactivos

TiO ₂ a microescala (micro-TiO ₂ ) y 5 nm de TiO ₂ en forma de anatasa se adquirieron de Sigma-Aldrich (Shanghai, China), y 10, 60 y 90 nm de TiO ₂ (anatasa) se adquirieron en Run He Ltd. (Shanghai, China). El formaldehído, el ácido nítrico, el peróxido de hidrógeno y la heparina sódica eran de grado reactivo y se adquirieron de Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Se adquirieron tampón fosfato (PBS), penicilina y estreptomicina de Gibco (San Diego, EE. UU.). Los kits de extracción de ARN total se adquirieron de Takara (Dalian, China). Los kits de ensayo de especies de oxígeno reactivo se adquirieron de Jianchen Ltd. (Nanjing, China). Stock TiO ₂ La suspensión (1%) en solución de Hank se esterilizó a 121 ° C durante 30 min. La suspensión se sonicó y se diluyó a la concentración deseada justo antes de su uso.

Animales y modelos

Para el estudio de la toxicidad hepática y cerebral, se compraron ratones ICR (región de control de impronta) (22 ± 3 g, mitad machos y mitad hembras) del centro de animales de la Universidad Médica de China. Todos los procedimientos experimentales que involucran animales fueron aprobados previamente por el Comité de Ética Institucional de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Tianjin y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas internacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Para el estudio de la toxicidad del embrión de ratón, se compraron ratones ICR (45 hembras, 20-35 g; 15 machos, 35-40 g) de Beijing Weitong Lihua Ltd. (Beijing, China). Todos los ratones estaban sanos y sexualmente maduros. Cinco días antes del tratamiento, los ratones se criaron en jaulas separadas en un galpón con buena ventilación, un ciclo de luz / oscuridad de 12 h, 20 ± 2 ° C, 60 ± 10% de humedad relativa y acceso ad libitum a alimentos y agua.

El régimen de dosificación 1 se diseñó para una prueba de toxicidad general y toxicidad cerebral. Los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos y un grupo de control adicional, con 10 ratones / grupo. Un TiO ₂ a nanoescala (nano-TiO ₂ ) se inyectó la suspensión (intraperitoneal (i.p.), 5, 10, 50, 100, 150 y 200 mg / kg) una vez al día durante 14 días. Se inyectó solución salina en ratones del grupo de control. Los ratones fueron observados todos los días y ningún animal murió durante el estudio. El día 15, se tomaron muestras de sangre del seno orbitario. Todos los ratones se pesaron individualmente, se anestesiaron con fenobarbital al 2% (60 ml / kg, i.p.) y luego se sacrificaron mediante dislocación cervical. Se recogieron todas las muestras de tejido (tejido cerebral aislado de la corteza y el hipocampo) y se almacenaron a -80 ° C. Cada corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón se cortó en dos porciones. Una porción se empapó en solución de formalina (10%) a 4 ° C para examen patológico. La otra porción se almacenó a -20 ° C para la determinación del contenido de titanio.

El régimen de dosificación 2 se diseñó para la prueba de toxicidad hepática. Los ratones se dividieron en tres grupos experimentales y un grupo de control. Nano-TiO ₂ (5, 10, 50 mg / kg) se administró una vez al día a través de sonda durante 60 días. Los ratones del grupo de control recibieron CMC (carboximetilcelulosa) al 0,5%. Los ratones fueron observados todos los días y ningún animal murió durante el estudio. En el día 60, los ratones fueron anestesiados con Fenobarbital al 2% (60 ml / kg, ip), y luego fueron sacrificados mediante dislocación cervical, los hígados se recolectaron inmediatamente y se procesaron para su examen mediante microscopía electrónica, determinación de ROS y oxidación de lípidos. y análisis de la expresión génica.

Determinación del contenido de titanio en los tejidos diana

Se cortó un trozo de muestra de tejido congelado de 0,1 a 0,5 g, se descongeló a temperatura ambiente y luego se digirió en HNO ₃ (0,5 ml) y H ₂ O ₂ (0,5 ml) a 160ºC. Después de diluirlo a 3 ml con ácido nítrico al 3%, se determinó la concentración de titanio en la solución usando espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Luego se calculó el contenido de titanio en los tejidos diana.

Pruebas de bioquímica sanguínea y cálculo de la relación entre órganos y peso corporal

Los niveles de las enzimas en las muestras de suero se analizaron mediante un analizador bioquímico automático (TBA-2000FR, Toshiba, Tokio, Japón). Estas enzimas son biomarcadores relacionados con la función del hígado y el riñón.

La relación entre el peso del órgano y el cuerpo se calculó sobre la base de los pesos del órgano y del cuerpo. Los pesos corporales se midieron antes de la anestesia y el sacrificio. Los órganos se pesaron después del aislamiento de ratones anestesiados y sacrificados.

Examen patológico y microscopía electrónica de transmisión

El examen patológico de los tejidos del hígado o del cerebro empapados en formalina se realizó bajo un microscopio óptico después de la tinción con hematoxilina. Para la microscopía electrónica de transmisión (TEM), los tejidos del hígado se incrustaron en resina epoxi EPON 812 y se cortaron en secciones tan delgadas como <500 µM después de la fijación con glutaraldehído y ácido ósmico. Las secciones se tiñeron con una solución saturada de ácido acético uranio (pH 3,5) y citrato de plomo (pH 12) durante 1 a 2 h. Las secciones teñidas se examinaron usando TEM.

Determinación de los niveles de especies reactivas de oxígeno, las actividades de sus enzimas metabólicas y los niveles de neurotransmisores

Para los tejidos del hígado, el anión superóxido (O ₂ ^- ) los niveles se determinaron utilizando XTT. La actividad de la catalasa (CAT) se determinó utilizando valores de DO a 240 nm, siguiendo los procedimientos publicados [20]. Los niveles de peroxidación lipídica se determinaron mediante el contenido de malondialdehído (MDA) siguiendo los procedimientos publicados [21].

Los tejidos cerebrales se homogeneizaron con una solución de polivinilpolipirrolidona al 1% preenfriada (50 mM en PBS a pH 7,6) después del aislamiento. Los sobrenadantes se recogieron después de centrifugación a 15.000 rpm durante 20 min (Eppendorf 5418, Hamburgo, Alemania) y se utilizaron para el análisis posterior de las actividades de la enzima superóxido (SOD), CAT, ascorbato peroxidasa (APX) y glutatión peroxidasa (GSHPx). La actividad de SOD se determinó usando NBT (prueba de azul de cloruro de nitro-tetrazolio). La actividad de catalasa se determinó usando un kit (kit de ensayo CAT, A007-2, Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng, Nanjing, China). La actividad de APX se midió usando un kit (kit de ensayo APX, A123, Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng, Nanjing, China). La actividad de GSHPx se determinó usando un kit (kit de ensayo GSHPx, A005, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). Las actividades de la óxido nítrico sintasa constitutiva (cNOS), la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la acetilcolinesterasa (AChe) se determinaron mediante kits comerciales (kit de ensayo AChe, A024, Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng, Nanjing, China).

Los niveles de ROS en tejidos cerebrales se determinaron añadiendo diacetato de diclorofluorescina 2 ', 7' a una concentración final de 10 µM en homogeneizado de tejido cerebral e incubando a 37 ° C durante 30 min; Luego, los tejidos se sometieron a análisis mediante citometría de flujo.

Determinación de niveles relativos de ARNm

El ARN total se extrajo de muestras de tejido hepático utilizando un kit comercial (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767, Takara, Dalian, China). El ADN complementario se sintetizó mediante transcripción inversa con cebador aleatorio. Los niveles relativos de ARNm de SOD, CAT, GSHPx, MT, HSP70, CYPA, P53, GST y TF se determinaron utilizando un kit de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) (One Step SYBR® PrimeScript ™ RT-PCR Kit, PR066A, Takara, Dalian, China). Todos los cebadores (Tabla 1) se sintetizaron y compraron de Shanghai Sangon Ltd.

Prueba de toxicidad embrionaria ex vivo

Se aislaron embriones de 8,5 días embrionarios de ratones hembra después de la dislocación cervical y luego se cultivaron en 50,0 ml de solución de Hank que contenía 3 ml de suero centrifugado inmediatamente (ICS) de ratas, micro-TiO ₂ o nano-TiO ₂ (0.0, 50.0, 100.0 y 200.0 μg / mL) con 3 embriones en cada botella durante 48 h.

Para determinar el efecto de micro-TiO ₂ o nano-TiO ₂ tiempo de exposición en embriones, los embriones se cultivaron en 50,0 ml de solución de Hank que contenía 3 ml de ICS de ratas, micro-TiO ₂ o nano-TiO ₂ (200,0 μg / mL) con 3 embriones en cada botella durante 16, 26 y 48 h, y luego se lavaron durante 48 h con solución de Hank precalentada a 37 ° C y se cultivaron en 50,0 mL de solución de Hank que contenía 3 mL de ICS de ratas.

El desarrollo embrionario se evaluó mediante la puntuación de Maele-Fabry Van [22]. El diámetro del saco vitelino, la longitud de la corona y la rabadilla del embrión, la longitud de la cabeza y el número de secciones del cuerpo se examinaron con un microscopio de disección. La tasa de malformación de los embriones en desarrollo se evaluó en función de las puntuaciones de los cambios morfológicos del prosencéfalo, el mesencéfalo, el rombencéfalo, la yema de la extremidad anterior, la yema de la extremidad posterior, los sistemas auditivo y visual y el corazón. Se aislaron más de 10 embriones de 2 ratones ICR en el día embrionario 10,5 para el control.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron con SPSS 13 (IBM, Illinois, EE. UU.). La diferencia entre el grupo de tratamiento y el grupo de control se analizó utilizando una t de Dunnett prueba. La diferencia entre los grupos se analizó mediante ANOVA. La comparación entre dos de múltiples muestras se analizó utilizando las pruebas LSD y SNK. Los datos categóricos se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado y la prueba de suma de rangos. Si P <0.05, la diferencia se consideró significativa.

Resultados

Distribución tisular del titanio en ratones después de la exposición a nanoescala de dióxido de titanio

Tratamos ratones con nano-TiO ₂ (i.p., 5, 10, 50, 100, 150 y 200 mg / kg) durante 14 días y se determinó el contenido de titanio en los órganos de los ratones. Los resultados revelaron que el titanio se acumuló en los órganos de ratones tratados con diferentes dosis de nano-TiO ₂ (Figura 1). La magnitud de la acumulación dependía de la dosis (Fig. 1). El hígado fue el órgano donde más se enriqueció el titanio seguido del riñón. La magnitud de la acumulación de titanio fue aproximadamente la misma en el bazo, pulmón, cerebro y corazón (Fig. 1). Los resultados sugieren que nano-TiO ₂ puede absorberse a través del tracto gastrointestinal y distribuirse a los tejidos a través del sistema circulatorio y depositarse en los órganos hígado, riñón, bazo, pulmón, cerebro y corazón.

El titanio se acumuló en órganos de ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ suspensión o solución salina según se indique mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 14 días. * en comparación con el control, P <0.05, # en comparación con el control, P <0.01

Toxicidad general del dióxido de titanio a nanoescala en ratones

Tratamos ratones con diferentes dosis de nano-TiO ₂ durante 14 días y encontraron que no hubo diferencia en las ganancias de peso corporal entre los grupos de ratones tratados con diferentes dosis (datos no mostrados). Dosis bajas de nano-TiO ₂ (5 y 10 mg / kg) no cambiaron la relación órgano / peso corporal del hígado, riñón, bazo, pulmón, corazón y cerebro en ratones después de la administración i.p. exposición durante 14 días (Fig. 2). Sin embargo, las altas dosis de nano-TiO ₂ (50, 100, 150 y 200 mg / kg) aumentó significativamente la relación órgano / peso corporal del hígado, riñón, bazo y corazón y disminuyó la de pulmón y cerebro en ratones de una manera dependiente de la dosis (Fig.2 ).

Relación de pesos de órganos / cuerpos en ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ suspensión o solución salina según se indique mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 14 días. * en comparación con el control, P <0,05; # en comparación con el control, P <0.01

Dosis más bajas (5, 10, 50 y 100 mg / kg) de nano-TiO ₂ no cambió ningún índice bioquímico sanguíneo (Fig. 3). Altas dosis de nano-TiO ₂ (150 a 200 mg / kg) biomarcadores de función hepática elevada fosfatasa alcalina (ALP) y alanina aminotransferasa (ALT), albúmina (ALB), leucina aminopeptidasa (LAP), butirilcolinesterasa (PChe), bilirrubina total (TBIL) y proteína total ( TP) (Fig.3). Las dosis altas disminuyeron los niveles de ácido úrico (UA) sérico y nitrógeno ureico en sangre (BUN), que son biomarcadores de la función renal. Aumentaron los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST), creatina quinasa (CK), lactato deshidrogenasa (LDH) y alfa hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH), que son índices de daño miocárdico (Fig. 3).

Índice de bioquímica sanguínea en ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ suspensión o solución salina según se indique mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 14 días. * en comparación con el control, P <0,05; # en comparación con el control, P <0,01. un Índice bioquímico de biomarcadores de función hepática. b Índice bioquímico de biomarcadores de función renal. c Índice bioquímico del biomarcador de daño miocárdico

Estos resultados sugieren que altas dosis de TiO ₂ puede causar daño severo al hígado, riñón, corazón y otros órganos de una manera dependiente de la dosis.

Toxicidad hepática del nano-TiO ₂ en ratones

Además, evaluamos la toxicidad hepática del nano-TiO ₂ . Usando microscopía óptica, encontramos que no hubo cambios significativos en los hígados de ratones expuestos a dosis bajas (i.p. durante 14 días, 5 mg / kg) nano-TiO ₂ (Figura 4a, b). Observamos marcada obstrucción y dilatación vascular (fig. 4c, 50 mg / kg), aumento de basófilos (fig. 4d, 100 mg / kg), isquemia parcial en el hígado (fig. 4e, 150 mg / kg) y obstrucción de las venas centrales (Fig. 4f, 200 mg / kg) en ratones expuestos a nano-TiO ₂ (i.p.).

Histología de hígados en ratones tratados con nano-TiO ₂ expuesto a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ suspensión o solución salina según se indique mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 14 días. un Control. b TiO ₂ , 5 mg / kg. c TiO ₂ , 50 mg / kg. d TiO ₂ , 100 mg / kg. e TiO ₂ , 150 mg / kg. f TiO ₂ , 200 mg / kg

Sin embargo, usando TEM, encontramos una ligera hinchazón de las mitocondrias en los hepatocitos y la presencia de cromatina condensada y células apoptóticas en los tejidos del hígado en ratones expuestos a dosis bajas de nano-TiO ₂ (sonda durante 60 días, 5 mg / kg) (Fig. 5a, b). Observamos nano-TiO ₂ en las mitocondrias de los hepatocitos, mitocondrias inflamadas y vacuolas en las mitocondrias de las células del hígado de ratones tratados con 10 mg / kg de nano-TiO ₂ (sonda durante 60 días, Fig. 5c). Además, observamos colapso del nucleolo, cromatina dispersa, apoptosis obvia y / o cuerpos apoptóticos en las células hepáticas de ratones tratados con 50 mg / kg de nano-TiO ₂ (sonda durante 60 días, Fig. 5d). Los resultados indicaron que nano-TiO ₂ puede provocar daños patológicos en las células hepáticas a nivel subcelular y celular.

Estructura ultramicroscópica de hepatocitos en ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ según se indique mediante sonda una vez al día durante 60 días. Los ratones del grupo de control recibieron CMC (carboximetilcelulosa) al 0,5%. un Control (× 8000). b TiO ₂ (5 mg / kg) (× 8000). c TiO ₂ (10 mg / kg) (× 10,000). Las flechas indican mitocondrias y vacuolas en las mitocondrias. d TiO ₂ (50 mg / kg) (× 10,000)

El tratamiento de ratones con 5 mg / kg de nano-TiO ₂ durante 60 días no cambió los niveles de ROS como O ²⁻ , H ₂ O ₂ , óxido nítrico (NO) y MDA (Fig. 6), o los niveles de ARNm de los genes SOD, CAT, GSHPx, MT, GST, HSP70, P53 y TF en tejidos hepáticos (Fig. 7). Tratamiento de ratones con 10 o 50 mg / kg de nano-TiO ₂ durante 60 días resultó en aumentos significativos en los niveles de O ²⁻ , H ₂ O ₂ , NO y MDA (Fig.6), disminuyen los niveles de ARNm de los genes SOD, CAT, MT, GST, HSP70, P53, TF y GSHPx, y aumentan los niveles de ARNm de los genes CYP1A en el hígado de ratones ( Figura 7). Los resultados mostraron que altas dosis de nano-TiO ₂ estrés oxidativo inducido y cambios en la expresión de genes protectores en el hígado de ratones expuestos.

Tasas de producción de ROS y niveles de peroxidación de lípidos en hígados de ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ según se indique mediante sonda una vez al día durante 60 días. Los ratones del grupo de control recibieron CMC (carboximetilcelulosa) al 0,5%. * en comparación con el control, P <0.05, normalizado a proteína total

Niveles de expresión relativa de genes en hígados de ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ según se indique mediante sonda una vez al día durante 60 días. Los ratones del grupo de control recibieron CMC (carboximetilcelulosa) al 0,5%. * en comparación con el control, P <0,05; # en comparación con el control, P <0.01, normalizado a β-actina

Toxicidad cerebral del dióxido de titanio a nanoescala en ratones

Además, evaluamos la toxicidad cerebral de nano-TiO ₂ . Primero examinamos las proporciones de peso cerebral / corporal en los ratones expuestos a nano-TiO ₂ (i.p. durante 14 días). Las dosis bajas (5, 10, 50 mg / kg) no cambiaron las proporciones de peso del cerebro / cuerpo, y las dosis más altas (100, 150, 200 mg / kg) disminuyeron significativamente las proporciones de peso del cerebro / cuerpo en una dosis dependiente manera (Fig. 2). La concentración de Ti en los tejidos cerebrales aumentó significativamente de manera dependiente de la dosis (Fig. 1).

También examinamos los cambios histológicos en el cerebro de ratones expuestos a nano-TiO ₂ (i.p. durante 14 días) usando tinción con hematoxilina. Observamos que dosis bajas de nano-TiO ₂ (50 mg / kg) no cambió la histología del tejido cerebral en ratones después de i.p. exposición durante 14 días (Fig. 8a, b). Tratamiento de ratones con 100 mg / kg de nano-TiO ₂ resultó en células nerviosas rotas y agrietadas en el tejido cerebral (Fig. 8c). Tratamiento de ratones con 150 mg / kg de nano-TiO ₂ resultó en la invasión de células inflamatorias en el tejido cerebral (Fig. 8d). Los resultados mostraron que altas dosis de nano-TiO ₂ puede causar daño morfológico al tejido cerebral, lo que resulta en una reacción inflamatoria.

Cambios patológicos en el tejido cerebral de ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ suspensión o solución salina según se indique mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 14 días. un Control. b 50 mg / kg. c 150 mg / kg. d 200 mg / kg

Determinamos los efectos del nano-TiO ₂ sobre el estado redox y las moléculas de señal en el tejido cerebral de ratones expuestos a nano-TiO ₂ (i.p. durante 14 días). Observamos que una dosis baja (5 mg / kg) de nano-TiO ₂ no cambió O ²⁻ , H ₂ O ₂ y los niveles de MDA, no cambiaron las actividades de las enzimas antioxidantes APX, CAT, GSHPx y SOD, ni los niveles de los antioxidantes no enzimáticos ASA / DASA y GSH / GSSG. Tampoco cambió la actividad de la óxido nítrico sintasa (NOS) y los niveles de NO en los tejidos cerebrales (Figuras 9 y 10). Dosis más altas de nano-TiO ₂ aumento de O ²⁻ , H ₂ O ₂ , y los niveles de MDA, disminuyeron las actividades de las enzimas antioxidantes APX, CAT, GSHPx y SOD, disminuyeron los niveles de los antioxidantes no enzimáticos ASA / DASA y GSH / GSSG, aumentaron los niveles de NO y las actividades de NOS, y disminuyeron los niveles de AchE y glucosa en sangre (GLU) en los tejidos cerebrales (Figs. 9 y 10). Estos resultados sugieren que nano-TiO ₂ puede causar daño en el cerebro en ratones después de i.p. exposición.

Relaciones cerebrales ASA / DASA y GSH / GSSG en los ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ suspensión o solución salina según se indique mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 14 días

Cambios en las actividades de ROS, enzimas antioxidantes, señalización de NO, glutamato y AchE en los cerebros de ratones expuestos a nano-TiO ₂ . Los ratones se trataron con nano-TiO ₂ suspensión o solución salina según se indique mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 14 días. N =10, * en comparación con el control, P <0,05; # en comparación con el control, P <0,01. un Cambio de ROS (O2-, H2O2 y MDA) en cerebros de ratones expuestos a nano-TiO2. b Cambio de enzimas antioxidantes (SOD, CAT, APX y GSHPx) en cerebros de ratones expuestos a nano-TiO2. c Cambio de componentes de señalización de NO (cNOS, iNOS y NO) en cerebros de ratones expuestos a nano-TiO2. d Cambio de contenido de glutamato y actividad AchE en cerebros de ratones expuestos a nano-TiO2

Efecto tóxico del nano-TiO ₂ sobre embriones de ratón Ex Vivo

Evaluar la toxicidad para el desarrollo de nano-TiO ₂ , primero comparamos el crecimiento y desarrollo de embriones in vivo y embriones ex vivo. Los resultados mostraron que el crecimiento y desarrollo de los embriones ex vivo fue similar al de los embriones in vivo (datos no mostrados). Por lo tanto, utilizamos embriones ex vivo para estudiar los efectos tóxicos del nano-TiO ₂ en embriones.

Investigamos los efectos de diferentes dosis (concentraciones finales 0.0, 50.0, 100.0 y 200.0 μg / mL) y diferentes tiempos de exposición de micro-TiO ₂ / nano-TiO ₂ sobre el crecimiento y desarrollo embrionario, así como la morfología de tejidos y órganos mediante el examen del diámetro VXY embrionario, la longitud de la coronilla y la rabadilla, la longitud de la cabeza y el número de secciones del cuerpo. Los resultados mostraron que el micro-TiO ₂ no cambió estos indicadores en ninguna dosis (Tabla 2).

Para diferentes tamaños de nano-TiO ₂ , tratamiento de embriones de 5 a 10 nm, 60 nm, 90 nm con 50,0 μg / ml de TiO ₂ no tuvo ningún efecto sobre el diámetro VXY del embrión, la longitud de la corona y la rabadilla, la longitud de la cabeza y el número de secciones del cuerpo (Tabla 2). Las dosis más altas (100,0 y 200,0 μg / ml) disminuyeron el diámetro de VXY, la longitud de la coronilla y la rabadilla, la longitud de la cabeza y el número de secciones corporales, y aumentaron la tasa de malformaciones (Tabla 2). Para la misma dosis, no hubo diferencias obvias entre los grupos tratados con diferentes tamaños de nano-TiO ₂ , 50,0 o 100 μg / ml. Tratamiento de embriones con 200 μg / mL nano-TiO ₂ disminuyó significativamente el diámetro de VXY, la longitud de la corona y la grupa, la longitud de la cabeza y la cantidad de secciones del cuerpo de los embriones de ratones con el aumento del tamaño de nano-TiO ₂ partículas (Tabla 2).

Tratamiento de embriones de ratones con micro-TiO ₂ (200,0 μg / ml) durante 16, 24 y 48 h no cambiaron el diámetro de VXY, la longitud de la coronilla y la rabadilla, la longitud de la cabeza y el número de secciones del cuerpo (Tabla 3). Tratamiento de embriones de ratones con nano-TiO ₂ (5-10 nm y 60 nm, 90 nm, 200,0 μg / ml) durante 16 h tampoco cambiaron el diámetro de VXY, la longitud de la coronilla y la rabadilla, la longitud de la cabeza y el número de secciones del cuerpo (Tabla 3). Sin embargo, el tratamiento de embriones de ratones con nano-TiO ₂ (5-10 nm y 60 nm, 90 nm, 200,0 μg / ml) durante 24 y 48 h disminuyó el diámetro de VXY, la longitud de la coronilla y la rabadilla, la longitud de la cabeza, el número de secciones corporales y aumentó la tasa de malformaciones (Tabla 3). Para el mismo tiempo de exposición, no hubo diferencia en el diámetro VXY, la longitud de la coronilla y la grupa, la longitud de la cabeza, el número de secciones del cuerpo o la tasa de malformación entre grupos de diferentes tamaños de nano-TiO ₂ particles (Table 3).

In summary, these results indicate that nano-TiO₂ had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO₂ particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO₂ particles.

Discusión

Nano-TiO₂ has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO₂ exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO₂ , using mice models. We find that nano-TiO₂ accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO₂ significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO₂ significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO₂ do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO₂ may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.

In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO₂ , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO₂ in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO₂ generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO₂ can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO₂ liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.

In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe₂ O ₃ nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO₂ on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO₂ may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.

We find that the micro-TiO₂ and low doses of nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO₂ (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO₂ in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO₂ does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO₂ . This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO₂ , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO₂ may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO₂ concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO₂ is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO₂ particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles (Table 2).

In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO₂ . This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO₂ is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO₂ in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO₂ can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO₂ can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO₂ . Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO₂ .

Conclusiones

Ingested nano-TiO₂ can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO₂ causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO₂ has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO₂ particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO₂ exposure on human health.

Abreviaturas

ALB:

Albumin

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

BUN:

Blood urea nitrogen

CK:

Creatine kinase

cNOS:

Constitutive nitric oxide synthases

HBDH:

Hydroxybutyrate dehydrogenase

ICR:

Imprinting control region

iNOS:

Inducible NOS

LAP:

Qleucine aminopeptidase

LDH:

Lactate dehydrogenase

Nano-TiO₂ :

Nanoscale titanium dioxide

PChe:

Butyrylcholinesterase

ROS:

Reactive oxygen species

TBIL:

Total bilirubin

TP:

Total protein

UA:

Uric acid

Cristalización dependiente de la temperatura de nanoflakes de MoS2 en nanohojas de grafeno para electrocatálisis Formación y propiedades luminiscentes de Al2O3:nanocompuestos de SiOC en la base de nanopartículas de alúmina modificadas por feniltrimetoxisilano