Nanosistema GAL-GNR-siBRAF: Silenciamiento Genético BRAF Dirigido + Fototermoterapia para Detener el Crecimiento del Hepatoma

Resumen

El cáncer de hígado es una de las malignidades más comunes en todo el mundo. Los inhibidores de la quinasa RAF son efectivos en el tratamiento del carcinoma hepatocelular (HCC); por lo tanto, la inhibición de la vía BRAF/MEK/ERK se ha convertido en una nueva estrategia terapéutica para la terapia novedosa del HCC. Sin embargo, los sistemas de administración dirigida específicos para tumores siguen siendo un obstáculo significativo para las aplicaciones clínicas. La galactosa (GAL) puede dirigirse al receptor asialoglicoproteico (ASGPR) que se expresa altamente en las células de cáncer de hígado. En este estudio, diseñamos un nanomaterial multifuncional novedoso GAL-GNR-siBRAF que consta de tres partes: GAL como parte de direccionamiento al cáncer de hígado, nanobarras de oro (GNR) que ofrecen capacidad fototérmica bajo luz infrarroja cercana, y siRNA que silencia específicamente BRAF (siBRAF). El nanotransportador GAL-GNR-siBRAF mostró alta capacidad de carga de siRNA e inhibió la degradación de siRNA en suero. Comparado con nanobarras de oro desnudas, GAL-GNR-siBRAF poseía menor biotoxicidad y mayor eficacia de silenciamiento genético. El tratamiento con GAL-GNR-siBRAF redujo significativamente la expresión de BRAF y deterioró la proliferación, migración e invasión de células de cáncer de hígado. Además, los efectos fototérmicos combinados y el silenciamiento de BRAF por GAL-GNR-siBRAF dieron lugar efectivamente a la muerte de células tumorales. Por lo tanto, nuestro estudio desarrolló un nuevo tipo de nanomaterial multifuncional dirigido GAL-GNR-siBRAF para el tratamiento del cáncer de hígado, que proporciona ideas para el desarrollo de nuevos métodos de tratamiento clínico.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (HCC) es un importante problema de salud global. Es el sexto cáncer más común en el mundo y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer. La mayoría de los casos de HCC ocurren en Asia Oriental y África subsahariana. Sin embargo, la incidencia ha ido aumentando en algunos países desarrollados, incluyendo Francia, Reino Unido, Japón y EE. UU. El tratamiento estándar para HCC temprano es la resección quirúrgica del tumor. Tras la cirugía, la tasa de supervivencia a 5 años puede oscilar entre 89 y 93%. Desafortunadamente, solo un pequeño porcentaje de pacientes con HCC (alrededor del 20-30%) son diagnosticados en etapa temprana; la mayoría de los pacientes con HCC (>70%) se encuentran en etapa avanzada y no pueden someterse a resección quirúrgica. Otras opciones de tratamiento incluyen trasplante de hígado, quimioembolización transarterial (TACE) y quimioterapia sistémica. Sin embargo, el trasplante de hígado está limitado por la oferta, y la embolia TACE incompleta puede llevar al fracaso del tratamiento, con efectos secundarios significativos de la quimioterapia sistémica y un pronóstico general pobre. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos métodos de tratamiento para el carcinoma hepatocelular.

La vía de señalización RAS/RAF juega un papel esencial en el desarrollo del cáncer de hígado, y BRAF es uno de los genes esenciales asociados al cáncer en esta vía. Las alteraciones genéticas en estos genes a menudo resultan en dos trastornos en cascada. La activación anormal de la vía de señalización RAS/RAF se asocia con mal pronóstico en pacientes con cáncer. BRAF es el gen mutado con más frecuencia en la familia RAF, y dirigirse a la vía RAS/RAF es una estrategia terapéutica novedosa para el tratamiento del HCC. Desde que el inhibidor de la quinasa RAF sorafenib ha demostrado ser útil en el tratamiento del HCC, las mutaciones de BRAF se han convertido en el objetivo preferido para la terapia del HCC. Más específicamente, las mutaciones de BRAF se han convertido en un objetivo deseable para el tratamiento del HCC avanzado, ya que el desarrollo clínico del inhibidor de la quinasa RAF sorafenib se ha encontrado en el tratamiento del HCC en Asia, Europa y EE. UU. Comparado con placebo, sorafenib aumentó la supervivencia global prolongando la supervivencia global media de pacientes con HCC avanzado. Sin embargo, sorafenib tiene una capacidad de direccionamiento tumoral pobre, lo que puede llevar a efectos adversos como presión arterial alta, pérdida de cabello y náuseas. Quedan por explorar fármacos que se dirijan al cáncer de hígado con alta especificidad y bloqueen RAF.

El receptor asialoglicoproteico (ASGPR), también conocido como receptor de galactosa hepático, es una lectina de tipo C expresada en la superficie sinusoidal de los hepatocitos. Se considera que ASGPR es un objetivo esencial para nanoestructuras hepáticas porque juega un papel importante en la unión, internalización y eliminación de sustancias con residuos de galactosa terminal. Varios monosacáridos (galactosa, manosa, lactosa, N-acetilgalactosamina y ácido siálico) se han reportado que interactúan con ASGPR en diversos grados, y la galactosa mostró mayor afinidad por ASGPR. Debido a que ASGPR está fuertemente expuesto en la superficie de las células parenquimatosas hepáticas, el receptor tiene una fuerte afinidad por la galactosa y los profármacos o sistemas de administración galactosilados dirigidos al hígado. Nanopartículas de galactosa, micelas de galactosa y liposomas de galactosa han sido identificados como sistemas de administración de fármacos con direccionamiento hepático, que se dirigen específicamente a células de carcinoma hepatocelular.

Las nanobarras de oro (GNR) son nanopartículas de oro en forma de varilla que tienen ventajas significativas como nanotransportadores. Las nanobarras de oro tienen excelente biocompatibilidad y pueden usarse para administración estable de siRNA; tienen una gran área superficial específica, lo que permite la modificación flexible de adaptadores específicos de direccionamiento tumoral; la resonancia de plasmones de superficie localizada (LSPR) tiene alta eficiencia de conversión fototérmica bajo irradiación de luz infrarroja cercana y se ha convertido en un excelente material fototérmico anti-tumor. La máxima eficiencia fototérmica puede lograrse ajustando la relación de aspecto de las nanobarras de oro. La toxicidad in vitro e in vivo de las nanopartículas de oro depende de su tamaño, carga superficial y recubrimiento superficial. Sin embargo, el bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) es un agente activo esencial en la síntesis de nanobarras de oro, que tiene citotoxicidad aparente y limita las aplicaciones biológicas.

La interferencia de RNA (RNAi) se ha convertido en un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer porque elimina o silencia eficazmente genes diana mediante pequeño RNA interferente (siRNA). Recientemente, las moléculas de siRNA han entrado en la fase de ensayos en humanos y se consideran formas prometedoras de tratar múltiples cánceres y tumores con genes mutantes. Sin embargo, la aplicación de siRNA aún enfrenta enormes desafíos como la inestabilidad en suero (degradación por nucleasas en el entorno extracelular) y efectos fuera de blanco. Además, los siRNAs están cargados negativamente, lo que les impide unirse a membranas celulares cargadas negativamente. Debido a estas características, el siRNA en sí es poco probable que se entregue directamente a las células. La estabilidad del siRNA puede mejorarse mediante modificación química del siRNA o insertando cargadores de siRNA en materiales de transporte protectores.

En este estudio, hemos construido recientemente un nanotransportador multifuncional GAL-GNR-siBRAF. El sistema utiliza nanobarras de oro con capacidad de generación de calor óptico como núcleo interno y GAL (d-galactosa) modificada externamente con direccionamiento específico de tumores hepáticos. Este sistema redujo la toxicidad biológica de CTAB en la superficie de las nanobarras de oro y mostró alta capacidad de carga de siRNA y puede usarse para silenciar el gen BRAF en el cáncer de hígado eficazmente. La aplicación de GAL-GNR-siBRAF atenuó significativamente la proliferación, invasión y migración de células de cáncer de hígado. Además, GAL-GNR-siBRAF indujo simultáneamente silenciamiento genético de BRAF y efectos fototérmicos que lograron eficacia sinérgica en la capacidad de eliminación de células tumorales, proporcionando una nueva forma de pensar para el desarrollo de tratamiento clínico del cáncer de hígado.

Materiales y Métodos

Línea Celular

La línea celular de carcinoma hepatocelular murino Hepa1-6 se adquirió del Banco de Células Madre, Academia China de Ciencias. Las células se cultivaron en medio DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) que contenía 10% FBS a 37 °C con 5% CO₂.

Síntesis de siRNA BRAF

La secuencia para siRNA dirigido al gen BRAF es 5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′ y fue sintetizada por Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, EE. UU.). El siRNA dirigido al gen luciferasa siGL2 disponible comercialmente se usó como control negativo de siRNA.

Síntesis de CTAB-GNR

Las nanobarras de oro solubles en agua se sintetizaron usando una vía de crecimiento mediada por semillas. La solución de semillas se fabricó de la siguiente manera: 1 mL de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (0.2 M) se mezcló suavemente con 1 mL de HAuCl₄ (0.5 mM). La solución se agitó a 28 °C, se mezcló completamente y se añadió 0.12 mL de NaBH₄ frío (0.01 M) hasta que la solución de semillas obtenida se volvió marrón y se mantuvo en reserva. La solución de crecimiento se sintetizó luego de la siguiente manera: 50 mL de CTAB (0.2 M) y 50 mL de HAuCl₄ (1 mM), 2.5 mL de AgNO₃ (4 mM) se mezclaron ligeramente a 28 °C. Tras una mezcla suave completa, se añadió 670 μL de ácido ascórbico (0.079 M) cuando el color de la solución cambió de amarillo oscuro a incoloro. Ciento veinte microlitros de la solución de semillas se añadieron bajo agitación suave a 28 °C, y el color se volvió gradualmente transparente de púrpura a púrpura-negro. Tras 24 h de agitación a temperatura constante, la solución se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 min para eliminar CTAB adicional y se liofilizó en polvo de GNR para uso futuro.

Síntesis de MUA-PEI y GAL-PEI-MUA

El ácido mercaptoundecanoico (MUA; 654 mg) se disolvió en 30 mL de cloroformo (CHCl₃) y luego se incubó con 100 mmol de clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) y 100 mmol de N-hidroxisuccinimida (NHS) durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadió 100 mmol de polietilenoimina (PEI) a la solución anterior. Tras 24 h de reacción a temperatura ambiente, se usó un volumen igual de agua desionizada para extraer el PEI-MUA soluble en agua. El mismo método se usó para completar la activación de d-galactosa en solución acuosa. Luego, se añadió un exceso de d-galactosa activada (500 mmol) a la solución anterior de PEI-MUA soluble en agua, y la reacción se llevó a cabo suficientemente a temperatura ambiente durante 24 h para obtener un complejo GAL-PEI-MUA soluble en agua.

Síntesis de GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) y PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

Polvo liofilizado de CTAB-GNR (10 mg) se suspendió en 10 mL de complejos PEI-MUA o GAL-PEI-MUA solubles en agua. CTAB fue reemplazado por enlace Au-S al agitar a temperatura ambiente durante 24 h. La solución se centrifugó a 12,000 rpm durante 15 min para eliminar el sobrenadante en exceso, y el precipitado se lavó tres veces con agua destilada. Los polvos PEI-GNR o GAL-GNR se prepararon por liofilización, se pesaron y disolvieron en agua libre de ribonucleasa, y luego se observó el efecto de resonancia plasmónica mediante analizador enzimático multifuncional (Spectra Max M5e, MD, EE. UU.).

Microscopía Electrónica de Transmisión

El GNR o GAL-GNR se suspendió en agua destilada, y la resuspensión se colocó en una rejilla de cobre. Tras secarse completamente las muestras en la malla de cobre al aire durante 30 min, la malla de cobre se imagenó usando un microscopio electrónico de transmisión (LIBRA 120, Carl Zeiss, Alemania).

Análisis Ultravioleta-Visible

El GNR, PEI-GNR o GAL-GNR se suspendió en agua destilada. El efecto de resonancia plasmónica de superficie de los nanomateriales en el rango de longitud de onda de 600 a 900 nm se examinó usando un lector de microplacas multifunción (SpectraMax M5e, MD, EE. UU.).

Análisis de Potencial Zeta y Diámetro Hidrodinámico

El GNR, PEI-GNR o GAL-GNR se suspendió en agua destilada, y luego se midieron el potencial zeta y el diámetro hidrodinámico del nanomaterial en un Zetasizer Nano ZS.

Análisis de Resonancia Magnética Nuclear

El polvo liofilizado de GAL-GNR se disolvió en agua pesada (99%, Sigma) para hacer una suspensión homogénea, y la suspensión se transfirió luego a un tubo de muestra de RMN. La composición de GAL-GNR se determinó por resonancia magnética nuclear (RMN) (Bruker, 600 MHz, Alemania).

Ensayo de Movilidad en Gel

GAL-GNR y siBRAF se mezclaron según la relación de masa (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Tras incubación a temperatura ambiente durante 30 min, se añadió tampón de carga de ADN a la mezcla. Todas las muestras se añadieron a gel de agarosa al 2% que contenía 0.01% Goldview (Bioshop, EE. UU.) y luego se electroforesaron a 90 V durante 30 min. El grado de envoltura de siBRAF se visualizó en el sistema de imagen de gel.

Estabilidad de siRNA en Suero

La mezcla de GAL-GNR-siBRAF (6:1) se incubó en suero murino fresco a 37 °C durante 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h respectivamente. El grupo de siBRAF desnudo más suero murino fresco se trató bajo la misma condición. Se añadió un volumen igual de 2% dodecilsulfato sódico (SDS) a la solución de GAL-GNR-siBRAF. Tras incubación durante 30 min a temperatura ambiente, se añadió tampón de carga de ADN, y todas las muestras se cargaron en gel de agarosa al 2% (conteniendo 0.02% Goldview (Bioshop, EE. UU.)) y se electroforesaron a 90 V durante 30 min. El brillo de la banda de siBRAF se visualizó en un sistema de imagen de gel.

Ensayo de Inhibición Competitiva de GAL-GNR-siBRAF

2 × 10⁵ células Hepa1-6 se cultivaron en microplacas de 12 pocillos durante la noche. Luego, las células se pre-trataron con ácido lactobiónico durante 12 h y luego se transfirieron con GAL-GNR-siBRAF (etiquetado con Cy3) durante 30 min. La intensidad de fluorescencia intracelular se determinó mediante microscopio de fluorescencia (barra de escala = 200 μm).

Capacidad de Administración Dirigida a Cáncer de Hígado de GAL-GNR-siBRAF

Un microgramo de siBRAF etiquetado con Cy3 se incubó con PEI-GNR (30 μg/mL), GAL-GNR (30 μg/mL) durante 20 min a temperatura ambiente, y luego se añadió al medio de células Hepa1-6. Tras incubación durante 30 min, las células se lavaron con 50% FBS tres veces, y la intensidad de fluorescencia en las células se midió bajo microscopio de fluorescencia.

Efectos Fototérmicos

Veinte, 40, 60, 80 y 100 μg de GAL-GNR y 100 μg de polvo liofilizado de GNR se disolvieron completamente en 1 mL de agua destilada. La solución se añadió a una placa de 24 pocillos y se irradió continuamente con fuente láser infrarroja cercana de 803 nm (2 W/cm²) durante 15 min. La temperatura de cada grupo se registró con un termómetro infrarrojo cada 0.5 min durante los primeros 5 min, y luego la temperatura se marcó cada 1 min.

Ensayo MTT

Doscientos microlitros de células (3.5 × 10⁴/mL) se cultivaron en microplacas de 96 pocillos durante 24 h y luego se cultivaron con diferentes concentraciones de GNR o GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/mL). Tras 24 o 48 h de incubación, se añadieron 20 μL de MTT al sistema de cultivo e incubaron durante 4 h adicionales. Los cristales púrpura se disolvieron en 150 μL DMSO, seguido de análisis espectrofotométrico a 490 nm usando una referencia de 650 nm en un lector de microplacas (SpectraMax M5e, MD, EE. UU.).

Prueba de Tinción Calceína-AM y PI

Células Hepa1-6 (1.5 × 10⁵) se mantuvieron durante la noche en una placa de 12 pocillos y se trataron con PBS, láser, GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2 (30 μg/mL:1 μg) + láser o GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg) + láser durante 4 h, y luego se irradiaron con luz infrarroja cercana (808 nm, 2 W/cm²) durante 15 min. La citotoxicidad de GAL-GNR se detectó mediante experimentos de tinción con calceína-AM (células vivas) y PI (células muertas). La fluorescencia verde de calceína-AM y la fluorescencia roja de PI se fotografiaron bajo microscopía de fluorescencia.

PCR Cuantitativo en Tiempo Real

El RNA celular total se extrajo usando Trizol (reactivo Trizol, Invitrogen) y se usó como plantilla para síntesis de cDNA. El qPCR se realizó usando primers forward y reverse específicos del gen (0.5 μL × 10 μM cada uno) en el sistema qRT-PCR Stratagene Mx3000P (Agilent Technologies, Lexington, MA, EE. UU.). SYBR green PCR MasterMix (Life Technologies) se usó según el esquema del fabricante. El gen de mantenimiento β-actina se usó como referencia interna. Las secuencias de los primers fueron β-actina: 5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′ (forward) y 5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′ (reverse); BRAF: 5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (forward) y 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (reverse). La diferencia de expresión génica se calculó y mostró mediante el método 2⁻ΔΔCt.

Western Blot

La proteína total de células Hepa1-6 se obtuvo mediante tampón RIPA (Cell signaling, Pickering, Ontario, Canadá) y se cuantificó por ácido bicinconínico (BCA). La proteína se separó en SDS-PAGE al 12% y se transfirió a fluoruro de polivinilideno (PVDF). El gen de mantenimiento β-actina se usó como referencia interna para detectar la expresión de proteína BRAF. La banda de proteína y la referencia interna de la proteína diana se detectaron por quimioluminiscencia ECL.

Prueba de Rayado

Las células Hepa1-6 transfiridas (1.7 × 10⁵/mL) se sembraron en placas de 12 pocillos durante la noche. Las células que se adhirieron completamente a la placa se rayaron con una punta de pipeta de 10 μL. Las células se lavaron dos veces con PBS y se reemplazaron con medio que contenía 2% FBS. El promedio de la línea de herida se observó bajo microscopio tras 0, 24 y 48 h. Cada prueba de rayado se realizó en triplicado.

Ensayo Transwell para Migración e Invasión

Cámaras Transwell de 8 micrómetros (Corning Life Science) se usaron para evaluar la migración e invasión celular. Células Hepa1-6 suspendidas en 200 μL de medio libre de suero se añadieron a las cámaras superiores a una densidad de 1.7 × 10⁵ células/mL/pocillo, y luego se añadieron 500 μL de medio que contenía 12% FBS a la cámara inferior. Tras incubación durante 24-48 h, las células se fijaron con solución de paraformaldehído al 4% durante 30 min, y luego las células se tiñeron con solución de violeta de cristal al 1% durante 30 min. Finalmente, las células se fotografiaron y contaron bajo microscopio invertido. Para el ensayo de invasión celular, los experimentos de invasión requieren recubrimiento de gel ECM, y los pasos restantes son consistentes.

Estadísticas

Todos los experimentos se realizaron en triplicado. Los datos se expresaron como media ± DE y prueba t de Student (bilateral) para determinar la diferencia entre los dos métodos. Se usó prueba ANOVA de una vía para comparación de múltiples grupos. Los datos se consideraron estadísticamente significativos a p < 0.05 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

Resultados

Síntesis y Caracterización del Nanotransportador GAL-GNR-siBRAF

Diseñamos un nanotransportador GAL-GNR novedoso capaz de entregar pequeño RNA interferente (siRNA) a células hepáticas y mantener el efecto fototérmico de las nanobarras de oro simultáneamente. El procedimiento de síntesis de GAL-GNR se muestra en el Esquema 1. Este sistema dirigido al hígado contiene tres componentes funcionales. Primero, la parte básica de GAL-GNR es un esqueleto de GNR, que mide aproximadamente 30 nm de longitud y 10 nm de diámetro, como se muestra en la imagen TEM (Fig. 1a) y el GNR conjugado químicamente (GAL-GNR) no mostró cambio dimensional significativo y aún poseía buena dispersibilidad (Fig. 1b). Los datos de tamaño de partícula mostraron que el tamaño promedio de GNR fue 30.23 nm, consistente con los resultados de microscopía electrónica, y el tamaño de GAL-GNR (50 nm) y PEI-GNR (42.35 nm) fue mayor que GNR ya que la conjugación de GAL y PEI aumentó la hidratación entre partículas (Fig. 1c). Segundo, el CTAB biológicamente tóxico en la superficie de GNR fue reemplazado por MUA-PEI cargado positivamente que puede cargar siRNA cargado negativamente. La medición de potencial zeta mostró que la carga superficial de GNR aumentó de 35.6 a 42.7 mV o 41.8 mV cuando los GNR se modificaron con PEI o GAL-PEI respectivamente, indicando que GAL-GNR poseía fuerte capacidad para unir siRNA (Fig. 1d). Tercero, aplicamos GAL como molécula guía para conjugar nanotransportadores GNR, que pueden usarse para direccionamiento específico de carcinoma hepatocelular. La espectroscopía de absorción UV-Vis se usó para detectar preliminarmente la estructura de GNR modificada. La longitud de onda del espectro de absorción inicial de GNR sin modificar fue 763 nm; se observó un desplazamiento de 7 nm en la longitud de onda inicialmente con la modificación MUA-PEI, y otro desplazamiento de 8 nm se observó al final de la síntesis, cuando la modificación de GNR con GAL tuvo éxito (Fig. 1e). Para confirmar GAL en el nanosistema, se usó imagen RMN para analizar los grupos químicos. Los resultados mostraron que la señal de H de galactosa solo se encontró en el espectro de GAL-GNR en el espectro de hidrógeno RMN, que fue δ: 3.60, 3.65, 3.70, 3.78, 3.90, 4.53. Los espectros RMN confirmaron la estructura química de GAL, en la que GAL se conjugó exitosamente a la superficie de GNR (Fig. 1f).

Procedimiento sintético de GAL-GNR. a Proceso sintético de MUA-PEI. b Activación de d-galactosa y reacción química con MUA-PEI. c Producto sintético final de GAL-GNR.

Caracterización de GNR y GAL-GNR. a Micrografía TEM de GNR (escala = 0.5 μm/50 nm). b Micrografía TEM de GAL-GNR (escala = 0.5 μm/50 nm). c Análisis de tamaño de partícula de diferentes GNR modificados. d Análisis de potencial zeta de diferentes GNR modificados (GAL-GNR). e Espectros de absorción UV-Vis normalizados de diferentes GNR modificados y agua. f Espectros de absorbancia RMN de GAL-GNR.

Capacidad de Encapsulación de siRNA y Estabilidad de GAL-GNR

El nanoesqueleto GAL-GNR fue modificado por PEI cargado positivamente, que puede combinarse con siRNA cargado negativamente mediante interacción electrostática. Usamos ensayo de movilidad en gel para evaluar la capacidad de unión de siRNA de GAL-GNR. El siRNA libre puede moverse a lo largo del pasillo del gel mientras que el siRNA unido se ralentiza o detiene totalmente. Además, el siRNA unido ya no se unirá efectivamente a bromuro, y por tanto, la intensidad de fluorescencia disminuirá en consecuencia. El resultado de electroforesis en gel mostró que la relación óptima para saturar GAL-GNR con siBRAF es 6:1 (p/p) (Fig. 2a).

Ensayo de movilidad en gel. a Capacidad de carga de siRNA de GAL-GNR. Un microgramo de siRNA se mezcló en volúmenes iguales con diferentes relaciones de masa de GAL-GNR. Tras incubación durante 30 min, se usó un ensayo de migración en gel para evaluar la capacidad de carga de siRNA de GAL-GNR. b Estabilidad de siRNA en suero murino. Un microgramo de siRNA BRAF se inoculó con GAL-GNR a la relación de masa 1:6 y posteriormente se añadió a suero murino fresco. Tras reacción de 0, 3, 6, 12, 24 y 48 h a 37 °C, el siRNA de GAL-GNR-siBRAF se extrajo con 2% SDS y se visualizó con Bromuro de Etidio.

El siRNA desnudo es muy degradable, especialmente in vivo. Una función importante del sistema de administración es proteger el siRNA de la degradación. Por tanto, probamos el efecto protector del nanotransportador GAL-GNR sobre el siRNA en suero fresco consecuentemente. Comparado con el siRNA desnudo, el siRNA unido se almacenó en suero por períodos más largos. Como se muestra en Fig. 2b, el siRNA desnudo pudo existir en suero hasta 12 h mientras que el siRNA unido seguía siendo abundante tras 48 h. El resultado demostró que GAL-GNR puede prevenir eficazmente la degradación de siRNA en suero, asegurando la administración dirigida in vivo.

Citotoxicidad de Nanomateriales

La baja toxicidad biológica es otra propiedad importante de los nanomateriales, que les permite ser usados en tratamiento del cáncer. Para evaluar la biocompatibilidad de esta nueva nanoestructura GAL-GNR, probamos su citotoxicidad. Como se muestra en Fig. 3, se observaron células muertas de Hepa1-6 en el grupo tratado con GNR sin modificar inicialmente a una concentración baja de 30 μg/mL. Tras incubación con 75 μg/mL GNR durante 24 h, la tasa de muerte celular fue hasta 56.09%, y la mortalidad aumentó a 75.5% tras incubación durante 48 h. Por el contrario, la modificación con GAL redujo la citotoxicidad significativamente. Tras incubar GAL-GNR durante 48 h, más del 80% de células seguían vivas incluso a alta concentración (105 μg/mL). Estos datos sugirieron que el nanotransportador GAL-GNR tenía alta biocompatibilidad en comparación con GNR, asegurando la seguridad de la aplicación.

Toxicidad de GAL-GNR. Células Hepa1-6 tratadas con GNR (CTAB-GNR) o GAL-GNR durante 24 o 48 h a las concentraciones indicadas. La viabilidad celular se midió mediante ensayo MTT (n = 5).

Administración Dirigida de siRNA a Células de Hepatoma y Silenciamiento Genético de BRAF In Vitro

La capacidad de entregar siRNA a células cancerosas es una de las funciones más importantes de los nanomateriales. Para investigar el potencial de GAL-GNR en la administración de siRNA, detectamos la eficacia de silenciamiento genético usando siBRAF cargado por GAL-GNR en células Hepa1-6. Comparado con el grupo blanco, la expresión de BRAF en células transfiridas con GAL-GNR-siGL2 (control negativo) no cambió, mientras que las células transfiridas con GAL-GNR-siBRAF tuvieron una disminución significativa (Fig. 4a). Además, el efecto de silenciamiento fue dependiente de la dosis, lo que se correlaciona con el aumento de la concentración de GAL-GNR. Los resultados de qPCR demostraron que la concentración ideal de transfición de GAL-GNR-siBRAF fue 30 μg/mL, y la eficiencia de silenciamiento puede alcanzar 90.29%, similar al grupo de lipofectamina 2000 (control positivo). El resultado de western blot fue consistente con qPCR, y la expresión de proteína BRAF se reguló a la baja tras 48 h de transfición (Fig. 4b).

Administración dirigida de siRNA a células de hepatoma y silenciamiento genético de BRAF in vitro. a Expresión de mRNA de BRAF tras transfición con GAL-GNR-siBRAF. Células Hepa1-6 transfiridas con diversas concentraciones de GAL-GNR llevando la misma cantidad de siRNA BRAF (1 μg) durante 24 h. La expresión de mRNA de BRAF se determinó por qPCR. La barra de error representa la desviación estándar de tres experimentos (***p < 0.001). b Expresión de proteína BRAF en Hepa1-6 tras transfición con GAL-GNR-siBRAF. Células Hepa1-6 transfiridas con GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 o PBS durante 48 h, los niveles de BRAF y β-actina se determinaron por Western blot. c y d Capacidad de administración dirigida a cáncer de hígado de GAL-GNR-siBRAF. Un microgramo de siBRAF etiquetado con Cy3 se incubó con lip2000, PEI-GNR (30 μg/mL), GAL-GNR (30 μg/mL) durante 20 min a temperatura ambiente y luego se añadió al medio de células Hepa1-6. Para ensayo de inhibición competitiva, células Hepa1-6 se pre-trataron con ácido lactobiónico durante la noche. La intensidad de fluorescencia intracelular se observó bajo microscopio de fluorescencia (barra de escala = 200 μm), y las expresiones de mRNA de BRAF se cuantificaron por q-PCR. La barra de error representa la desviación estándar de tres experimentos (*p < 0.05).

El ácido lactobiónico es similar a GAL en estructura y puede combinarse competitivamente con el receptor asialoglicoproteico (ASGPR) expresado en la superficie de la membrana de células de carcinoma hepatocelular. Para confirmar la eficiencia de direccionamiento específica de GAL-GNR, células Hepa1-6 se pre-incubaron con ácido lactobiónico y luego se transfirieron con GAL-GNR-siBRAF. Células no tratadas se usaron como control blanco, y el reactivo de transfición clásico lipofectamina 2000 se usó como control positivo. Como se muestra en Fig. 4c, la intensidad de fluorescencia roja de células transfiridas con GAL-GNR fue similar al grupo de control positivo, mientras que la intensidad de fluorescencia de células transfiridas con PEI-GNR se redujo significativamente. Por otro lado, células transfiridas solo con GAL-GNR-siBRAF mostraron fluorescencia roja de Cy3 más fuerte que células Hepa1-6 pre-tratadas con ácido lactobiónico (Fig. 4c), y el resultado de qPCR fue consistente con el de los resultados de fluorescencia roja (Fig. 4d). Estos resultados ilustraronさらに que GAL promovió eficazmente la endocitosis de siRNA por células Hepa1-6 y puede aplicarse como parte de direccionamiento de HCC.

Impacto de GAL-GNR-siBRAF en Proliferación, Migración e Invasión de Células Hepa1-6

BRAF juega un papel importante en la vía MAPK, responsable de regular la proliferación, migración e invasión celular. Para evaluar el impacto de GAL-GNR-siBRAF en células de carcinoma hepatocelular, analizamos primero la proliferación celular mediante ensayos MTT. Como se muestra en Fig. 5a, la proliferación de células hepa1-6 transfiridas con GAL-GNR-siBRAF disminuyó significativamente comparada con células GAL-GNR-siGL2 (control negativo) o tratadas con PBS. A continuación, investigamos el efecto de GAL-GNR-siBRAF en la migración celular mediante ensayos de rayado y Transwell. Comparado con células de control negativo, la capacidad de migración de células Hepa1-6 transfiridas con GAL-GNR-siBRAF se redujo evidentemente (Fig. 5b-d).

Impacto del silenciamiento del gen BRAF en células Hepa1-6 por GAL-GNR-siBRAF. a Proliferación de células Hepa1-6. Células Hepa1-6 transfiridas con GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 o PBS, y la proliferación celular se midió mediante ensayo MTT (n = 5). La barra de error representa la desviación estándar de tres experimentos (*p < 0.05). b Prueba de rayado de células Hepa1-6. Células Hepa1-6 transfiridas durante 24 h como se describió arriba y luego rayadas con punta de 10 μL. Las imágenes de rayado celular se tomaron en diferentes puntos de tiempo (barra de escala = 200 μm). c y e Migración e invasión de células Hepa1-6. Células Hepa1-6 transfiridas durante 24 h como se describió arriba. La capacidad de migración e invasión celular se determinó mediante ensayo Transwell, e imágenes se tomaron en diferentes puntos de tiempo (barra de escala = 200 μm). d y f Análisis estadístico columnar de capacidad de migración e invasión celular (***p < 0.001).

Para investigarさらに el potencial de GAL-GNR-siBRAF en la invasión, se realizaron ensayos Transwell. Los resultados mostraron que células hepa1-6 transfiridas con GAL-GNR-siBRAF disminuyeron significativamente la invasión de Hepal-6, comparado con GAL-GNR-siGL2 o PBS (Fig. 5e y f). Los resultados anteriores implicaron que el silenciamiento del gen BRAF usando complejos GAL-GNR-siBRAF puede reducir eficazmente la migración e invasión de células de carcinoma hepatocelular.

Tratamiento Combinado con Efecto Fototérmico y Silenciamiento Genético de GAL-GNR-siBRAF

Nuestros estudios previos han demostrado que los nanomateriales de oro pueden generar energía térmica bajo radiación infrarroja cercana; este fenómeno se llama efecto fototérmico debido a las propiedades LSPR de GNR. Nuestros resultados mostraron que, con el aumento de la concentración de GAL-GNR, la capacidad de producción de calor de GAL-GNR se mejoró. Cuando la concentración de GAL-GNR es 100 μg/mL, la temperatura sube rápidamente de 24 a más de 60 °C. Además, no hubo diferencia significativa en la capacidad de producción de calor entre GNR y GAL-GNR (Fig. 6a).

Efecto fototérmico inducido por GAL-GNR y tratamiento combinado de efecto fototérmico y silenciamiento genético en células de cáncer de hígado. a Fuente láser infrarroja cercana de 803 nm (2 W/cm²) usada para irradiar solución de GNR, GAL-GNR o agua destilada (control blanco) durante 15 min. La temperatura se detectó con termómetro infrarrojo en diferentes puntos de tiempo. b Células Hepa1-6 tratadas con PBS, láser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Láser, o GAL-GNR-siBRAF + Láser, respectivamente. Fluorescencia verde de calceína AM (células vivas) y fluorescencia roja de PI (células muertas) observadas bajo microscopio de fluorescencia.

El nuevo nanosistema GAL-GNR-siBRAF posee tres características individuales: direccionamiento específico de cáncer de hígado, silenciamiento genético de BRAF basado en siRNA, y efectos fototérmicos ofrecidos por GNR. Así, estudiamosさらに el efecto terapéutico sinérgico de GAL-GNR-siBRAF en tratamiento anti-tumor. Células Hepa1-6 sin GAL-GNR mantuvieron mayor viabilidad incluso bajo radiación infrarroja cercana, sugiriendo que el láser en sí no tuvo efecto significativo en células tumorales. Una vez que la irradiación láser se realizó sobre la base del tratamiento GAL-GNR-siGL2, el efecto fototérmico mostró poderosa capacidad de eliminación en células Hepa1-6. Aunque el silenciamiento genético de BRAF solo indujo muerte celular, el efecto no fue concluyente. El tratamiento de células con el nanomaterial GAL-GNR-siGL2 más irradiación láser resultó en capacidad de eliminación celular mucho más fuerte que el silenciamiento genético de BRAF individual (Fig. 6b). Estos datos indican que el silenciamiento genético de BRAF y el efecto fototérmico pueden aumentar sinérgicamente el potencial de eliminación de células tumorales.

Discusión

Las dificultades en la administración dirigida a tumores son obstáculos mayores en el tratamiento clínico de tumores. Este estudio demostró por primera vez que hemos desarrollado un nanotransportador multifuncional novedoso GAL-GNR-siBRAF, y se le proveyó muchas ventajas. El GAL-GNR modificado no solo poseía buena biocompatibilidad sino que también mantuvo los fenómenos LSPR del esqueleto GNR y aún tiene excelente capacidad de conversión fototérmica. GNR modificado con GAL puede dirigirse a células de carcinoma hepatocelular a través de ASGPR, lo que tiene gran potencial en terapia molecular dirigida de carcinoma hepatocelular. Estudios adicionales mostraron que el silenciamiento genético de BRAF inhibió la proliferación, migración e invasión de células de hepatoma. Vale la pena notar que GAL-GNR-siBRAF muestra una capacidad de eliminación celular más fuerte en la combinación de efecto fototérmico y silenciamiento genético de BRAF.

La interferencia de RNA (RNAi) ha atraído mucha atención debido a su papel crucial en la expresión y regulación génica. Usar siRNA para eliminar genes específicos de secuencia en células cancerosas para terapia génica es una terapia génica dirigida efectiva y específica, y se ha convertido en una nueva herramienta terapéutica para muchas enfermedades incluyendo cáncer. Sin embargo, la baja estabilidad en suero y la pobre captación celular limitan el siRNA en aplicación clínica. Por otro lado, el siRNA posee carga negativa que le impide unirse a membranas celulares cargadas negativamente, y el siRNA en sí es poco probable que se entregue directamente a las células. Además, hay problemas asociados con baja eficiencia de transfición y pobre internalización celular en terapia con siRNA. Estas barreras impiden la entrega de siRNA a células diana. Para mejorar la estabilidad del siRNA y fortalecer la eficacia de silenciamiento génico, sintetizamos un nanotransportador novedoso, GAL-GNR-siBRAF, que incluye tres componentes (Esquema 1). Este nanotransportador tiene bajo tamaño molecular (aproximadamente 30 nm de longitud y 10 nm de diámetro) y buena dispersibilidad (Fig. 1). Además, GAL-GNR-siBRAF pudo cargar eficazmente gran cantidad de siRNA a baja concentración (Fig. 2a) y proteger la degradación de siRNA por RNasa en suero; el siRNA fue evidenciado por estabilidad por al menos dos días a 37 °C en presencia de suero murino fresco (Fig. 2b).

La buena biocompatibilidad es esencial para nanomateriales usados en el campo de la bioterapia. CTAB es un reactivo activo esencial en la síntesis de nanobarras de oro aunque tiene citotoxicidad aparente que limita su aplicación biológica. Para reducir la citotoxicidad del material, manipulamos el GNR mediante modificación externa de PEI de carga positiva y adaptador de direccionamiento GAL (d-galactosa). Nuestros resultados mostraron que, comparado con GNR no funcionalizado, GNR modificado con GAL tiene mejor biocompatibilidad. Las viabilidades celulares se mantuvieron sobre 80% incluso a concentraciones muy altas (105 μg/mL) de GAL-GNR durante 48 h (Fig. 3). Además, el pequeño tamaño molecular y forma cilíndrica de la nanobarra facilitan su penetración a través de la membrana celular hacia la célula. Este fenómeno es particularmente evidente en terapia dirigida de células cancerosas. Nano-constructo modificado con partes de direccionamiento de galactosa resultó en alta acumulación de GAL-GNR-siBRAF en células tumorales, induciendo regulación a la baja efectiva de expresión del gen BRAF (Fig. 4). Además, según los experimentos de inhibición competitiva, encontramos que GAL-GNR entró a las células principalmente a través de receptores de superficie ASGPR de células Hepa1-6 (Fig. 4c).

Se reportó que HCC con alta expresión de BRAF y RAF1 tiende a tener proliferación y crecimiento rápidos. B-Raf y Raf1 actúan principalmente en la vía ERK/MAPK aguas abajo, regulando factores nucleares a través de amplificación en cascada. La activación de esta vía acelera anormalmente la proliferación y diferenciación de células HCC. El gen RAF también puede promover la expresión de metaloproteinasas de matriz (MMPs), que pueden cambiar la adhesión de células tumorales, degradar matriz extracelular (ECM) y membrana basal, y promover la invasión y metástasis de tumores. La quinasa BRAF regula la vía RAS-RAF-MEK-ERK, que promueve la proliferación, invasión y metástasis de células tumorales, y permite la muerte celular a través de apoptosis. En trabajo previo, encontramos que el gen BRAF se expresaba altamente en células Hepa1-6 (datos no mostrados). Se especula que el silenciamiento de expresión de BRAF en Hepa1-6 bloqueará la vía RAS-RAF-MEK-ERK y conducirá a cambios biológicos de Hepa1-6. Para verificar nuestra hipótesis, transfirimos células de carcinoma hepatocelular con GAL-GNR-siBRAF y encontramos que puede restringir significativamente la proliferación, migración e invasión celular (Fig. 5), proporcionando una nueva estrategia para tratamiento clínico de carcinoma hepatocelular.

Otra ventaja importante de GNR es que posee resonancia de plasmones de superficie localizada (LSPR), que puede convertir energía de luz absorbida en energía térmica bajo irradiación de luz infrarroja cercana, matando y destruyendo células. Luego, exploramos la capacidad de conversión luz-calor de GAL-GNR, y los resultados mostraron que GAL-GNR modificado puede inducir energía térmica eficazmente bajo irradiación de luz infrarroja cercana (Fig. 6a). A continuación, investigamosさらに los efectos sinérgicos de GAL-GNR-siBRAF. Mientras que el silenciamiento genético de BRAF mostró citotoxicidad limitada, el tratamiento de GAL-GNR-siGL2 + láser tuvo capacidad de eliminación mucho más fuerte en células tumorales. Al mismo tiempo, la combinación de hipertermia fototérmica y silenciamiento genético de BRAF pudo causar más del 85% de muerte celular (Fig. 6b), lo que indica que la sinergia de GAL-GNR-siBRAF y efectos fototérmicos podría ser una estrategia ideal para inhibir el cáncer de hígado.

Conclusiones

Este estudio mostró que GAL-GNR-siBRAF supera el obstáculo de degradación de siRNA, aumentando eficazmente la estabilidad de siRNA en suero in vitro. Además, GAL-GNR-siBRAF puede entregar siRNA dirigido a células de carcinoma hepatocelular y silenciar la expresión de BRAF e inhibir significativamente la proliferación, invasión y migración celular. Más importante, GAL-GNR-siBRAF, como nuevo nanotransportador multifuncional, puede aumentar enormemente la capacidad de eliminación de células tumorales cuando se combina con luz infrarroja cercana. En conclusión, GAL-GNR-siBRAF tiene gran potencial en tratamiento de carcinoma hepatocelular y proporciona nuevas ideas para aplicación clínica de cáncer de hígado.