Nano-encapsulación eficiente de agregados celulares isléticos porcinos neonatales usando polímeros PEG-bloque-PLA

Resumen

Investigaciones que demuestran métodos para la nano-encapsulación de agregados celulares isléticos porcinos neonatales (NPCC) usando polimerosomas (PSomes) formados usando polímeros de polietilenglicol-bloque-poli lactida. Aquí, nuestros estudios presentan un procedimiento de nano-encapsulación eficiente con daño y pérdida mínimos de NPCC. Usamos N-hidroxisuccinimida (NHS) en el N-terminal de PSomes para inducir la unión de grupos amina en la matriz extracelular que rodea NPCC. Medio de cultivo F-10 con albúmina sérica bovina se usó en el procedimiento de nano-encapsulación para minimizar daño y pérdida de NPCC. Finalmente, indujimos entrecruzamiento entre PSomes bifuncionales (NHS-/NH₂-PSomes). Medio de cultivo F-10 conteniendo 0,25% BSA con pH 7,3 minimizó el daño y pérdida de NPCC después de nano-encapsulación comparado con el uso de tampón HBSS básico (pH 8,0). También indujimos la nano-encapsulación eficiente a través de conjugación de PSomes usando PSomes bifuncionales (NHS-/NH₂-PSomes).

Introducción

El uso de trasplante de islotes alogénicos en el tratamiento de diabetes tipo 1 está limitado debido a la falta de donantes adecuados. En su lugar, hay un aumento gradual en el uso de islotes animales en xeno-trasplante de islotes, surgiendo los cerdos como especie donante óptima [1]. Cuando los cerdos se usan como donantes durante el trasplante, islotes separados pueden usarse, basados en la edad de los cerdos. A menudo, los agregados celulares isléticos porcinos neonatales (NPCC) son preferidos sobre islotes porcinos adultos (API) debido a su asequibilidad y facilidad de aislamiento. Además, NPCC pueden proliferar gradualmente después del trasplante, prolongando su función in vivo [1, 2]. Sin embargo, cuando NPCC se trasplantan en venas porta de humanos o primates no humanos (NHP), variaciones interespecie pueden causar reacciones inmunes como reacción inflamatoria mediada por sangre instantánea (IBMIR) o rechazo hiperagudo, llevando a pérdida temprana del injerto [3]. Para resolver este problema, se requiere encapsulación de NPCC que pueda inhibir varias respuestas inmunes. Hay tres tipos de encapsulación: macro-, micro- y nano-encapsulación. La macro-encapsulación usa un dispositivo que contiene islotes, que luego se implanta alrededor de vasos sanguíneos para liberar insulina a través de una membrana semipermeable en respuesta a niveles de glucosa en sangre. La micro-encapsulación empaqueta un pequeño número de islotes en una cápsula porosa. Aunque estas encapsulaciones pueden proteger islotes del rechazo inmune, se han reportado efectos secundarios como colapso de membrana o generación de trombos en ensayos in vivo. Los islotes también perturban el flujo de hormonas, nutrientes u oxígeno debido al aumento en la distancia de difusión. La nano-encapsulación es la estrategia de modificación de superficie celular induciendo unión entre células y proteínas exógenas, principalmente polietilenglicol (PEG), en transfusión sanguínea [4].

La nano-encapsulación usando PEG se ha usado ampliamente como método de modificación para mejorar la eficacia y propiedades fisicoquímicas de proteínas o péptidos objetivo [5]. En particular, la nano-encapsulación de islotes puede tener efectos inhibidores en respuesta a ataque de células inmunes y reconocimiento de anticuerpos. PEG se usa ampliamente para recubrimiento celular debido a sus propiedades biocompatibles como no-inmunogenicidad, enmascaramiento de antígenos y efecto anti-incrustación [6]. Entre las nanopartículas usadas para nano-encapsulación de NPCC, los "polimerosomas" (PSomes) basados en PEG-bloque-poli lactida (PEG-b-PLA) son los más adecuados porque son estables y simples de modificar; también pueden incorporar reactivos tanto hidrofílicos como hidrofóbicos en su ensamblaje [7, 8]. La modificación de superficie de islotes usando polímeros (que contienen PEG) se logra a través de unión covalente o no covalente entre la matriz extracelular (MEC) del islote y el grupo funcional polímero conjugado [9].

En estudios previos, una solución salina balanceada de Hank básica (HBSS, pH 8,0) se usó como tampón de reacción de nano-encapsulación de islotes debido a su capacidad para facilitar la unión NHS-NH₂ [10,11,12]. Sin embargo, para minimizar el daño celular a NPCC durante la nano-encapsulación, usamos medio F-10 (medio de cultivo de NPCC) con pH fisiológico (pH 7,3). Además, dado que preservar la cantidad de NPCC después de nano-encapsulación es importante para el trasplante de la cantidad correcta de células, añadimos albúmina sérica bovina (BSA), que recubre el fondo del plato de cultivo celular con un polímero de cadena larga, para aumentar la tasa de recuperación [13]. En nuestro estudio previo, la nano-encapsulación de NPCC con PSomes se realizó mediante grupos funcionales únicos, como NHS o NH₂, que se usan para inducir unión covalente o interacción electrostática con MEC de NPCC, respectivamente. Sin embargo, como la afinidad de unión disminuye con el tiempo, se necesitan estrategias para aumentar la eficiencia de unión [14]. PSome que tiene grupos bifuncionales puede usarse como candidato para aumentar la eficiencia de recubrimiento debido a su capacidad de agregarse. Por lo tanto, indujimos un entrecruzamiento entre PSomes que contienen grupos bifuncionales (NHS-/NH₂-PSome) que pueden unir no solo a la MEC de NPCC, sino también a cada PSome a través de interacción covalente o electrostática, aumentando así la eficiencia de nano-encapsulación.

En este estudio, investigamos la posible aplicación de la nano-encapsulación en NPCC a través de método optimizado en el campo de xeno-trasplante de islotes porcinos.

Materiales y Métodos

Animales

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de MGENPLUS co. ltd. (#2019-1), y todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por el comité. La cirugía se realizó bajo anestesia general, y se tomaron medidas para asegurar que los animales experimentaran dolor mínimo. Los cerdos fueron sacrificados antes de la pancreatectomía.

Aislamiento de Agregados Celulares Isléticos Porcinos Neonatales (NPCC)

NPCC se aislaron de lechones de 3 a 5 días de edad. Brevemente, los lechones fueron anestesiados usando ketamina (10 mg/kg, Yuhan, Seúl, Corea) e hidrocloruro de xilazina (1 mg/kg, Rompun; Bayer Korea, Seúl, Corea) inyectados en el músculo femoral y luego sacrificados inyectando cloruro de potasio (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) en el corazón. El páncreas se expuso a través de una incisión abdominal, se extrajo y se sumergió en solución salina balanceada de Hank (HBSS, Biosesang, Gyeonggi-do, Corea) con 8,3 mM bicarbonato de sodio, 10 mM N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanesulfónico ácido) (HEPES) (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) y 0,5% antibiótico-antimicótico (Biowest, MO, EE. UU.). El páncreas se picó en fragmentos de 1-2 mm³ y se digirió en colagenasa tipo V (1 mg/ml, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) en HBSS durante 10 min. HBSS frío conteniendo 10% suero fetal bovino (FBS) (Biowest, MO, EE. UU.) se añadió al tejido pancreático digerido para detener la actividad enzimática. Los tejidos pancreáticos digeridos se lavaron en HBSS, y tras resuspensión, los tejidos se filtraron a través de un pluriStrainer 500 μm (pluriSelect, Leipzig, Alemania) y se lavaron en HBSS. Finalmente, NPCC se sembraron y cultivaron en 5% CO₂ a 37 °C en medio F-10 (Gibco, CA, EE. UU.) suplementado con 0,25% albúmina sérica bovina (BSA) (genDepot, TX, EE. UU.), 10 mM nicotinamida, 10 mM D-glucosa, 2 mM L-glutamina, 2 mM cloruro de calcio dihidrato, 50 μM isobutilmetilxantina (IBMX), 20 μg/ml ciprofloxacino (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) y 1% antibiótico-antimicótico. NPCC se cultivaron durante 5 días [15], añadiéndose 10 nM exendina-4 (Prospec, Ness-Ziona, Israel) al medio de cultivo cada día.

Evaluación In Vitro de NPCC y NPCC Nano-encapsulados

Tras el cultivo, el número de NPCC se contó como equivalente de islote (IEQ) usando retícula en ocular. La viabilidad se evaluó usando tinción naranja de acridina (AO, 0,67 μM, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) y yoduro de propidio (PI, 75 μM, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.). Para realizar el ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS), se seleccionaron 20-30 NPCC y se pre-incubaron con baja concentración de D-glucosa (2,8 mM) en tampón bicarbonato Krebs-Ringer (KRBB) durante 1 h. NPCC se incubaron luego con baja D-glucosa (2,8 mM) en tampón KRBB durante 1 h seguido por solución de alta D-glucosa (28,0 mM) en KRBB durante 1 h. Los sobrenadantes se recolectaron para medir la secreción de insulina bajo concentraciones bajas y altas de glucosa [11]. La cantidad de insulina secretada de cada muestra se midió usando un Kit ELISA Quantikine de Insulina Humana/Canina/Porcina (R&D systems, MN, EE. UU.). El índice de estimulación (SI) se calculó dividiendo las cantidades de insulina a alta glucosa (28,0 mM) por la de baja glucosa (2,8 mM).

Preparación de Polimerosoma (PSome)

Para preparar PSomes, copolímeros de N-hidroxisuccinimida-poli(etilenglicol)-bloque-poli(lactida) (10 mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) o copolímeros de amina-poli(etilenglicol)-bloque-poli(lactida) (10 mg/ml, NH₂-PEG-b-PLA; Nanosoft polymers, NC, EE. UU.) se disolvieron en 1 ml de dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.). Además, para preparar PSome bifuncional, cada copolímero (NHS o NH₂-PEG-b-PLA) disuelto en DMSO se mezcló en proporciones. Agua destilada (DH2O) se añadió a la solución de polímero para hacer una concentración final de 1 mg/ml. La solución de polímero se sonicó en un ultrasonificador (Sea han ultrasonic, Seúl, Corea) durante 5 min. 1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina, sal 4-clorobenzenosulfonato (DiD; Biotium, CA, EE. UU.) se añadió a la solución de polímero durante la sonicación para permitir visualización. Finalmente, la mezcla se dializó en DH2O durante 3 días.

Nano-encapsulación

El PSome se diluyó en tampón de reacción de nano-encapsulación (ya sea HBSS (pH 7,3 o pH 8,0) o medio F-10 simple sin suplementos (pH 7,3 o pH 8,0), con o sin 0,25% BSA). La nano-encapsulación se realizó añadiendo el PSome a NPCC en medio de cultivo. Para esto, 10.000 IEQ de NPCC se sembraron en un plato de cultivo celular de 6 pocillos (SPL, Gyeonggi-do, Corea), y PSome diluido se añadió a NPCC e incubó en 5% CO₂ a 37 °C durante 1 h. Un grupo de control negativo (NC) (NPCC sin recubrimiento sin PSomes) se incubó bajo la misma condición que el grupo experimental. Tras la incubación, los NPCC nano-encapsulados se cosecharon y cultivaron en medio de cultivo F-10.

Eficiencia de NPCC Nano-encapsulados

Los NPCC nano-encapsulados con PSome conjugado con DiD se visualizaron usando microscopía de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania) o microscopía confocal de barrido láser (CLSM; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). La intensidad de PSome conjugado con DiD unido a NPCC se cuantificó calculando la intensidad de fluorescencia media (MFI) usando software ImageJ (NIH, Bethesda, EE. UU.). Los núcleos en células se contra-tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Ensayo de Permeabilidad de Polimerosoma

Los NPCC nano-encapsulados con NHS-PSome en F-10 o F-10 (0,25% BSA) se incubaron con dextrano conjugado con fluoresceína isotiocianato (FITC) de pesos moleculares variables (10, 20, 70 y 250 kDa) durante 2 h. La penetración de dextrano conjugado con FITC en NPCC nano-encapsulados con NHS-PSome se confirmó para cada peso molecular mediante microscopio confocal de barrido láser.

Ensayo de Viabilidad Celular de Polimerosoma

Los THP-1 (línea celular monocítica humana) nano-encapsulados con NHS-PSome en RPMI 1640 (Biowest, MO, EE. UU.) se incubaron durante 1 h. La viabilidad de THP-1 nano-encapsulados con NHS-PSome se midió según el protocolo presentado en kit de ensayo de proliferación celular MTT (iNtRon Biotechnology, Seongnam-si, Corea).

Análisis Estadístico

Se realizó prueba t no pareada en GraphPad Prism 6.0. La significancia estadística se expresó como *, **, ***, y **** indicando el valor P de ≤ 0,05, ≤ 0,01, ≤ 0,001 y ≤ 0,0001.

Resultados

Cultivo y Evaluación Funcional de NPCC

NPCC se cultivaron durante 5 días, y se realizaron controles de calidad, incluyendo viabilidad y GSIS. El número total de NPCC fue 21.014,0 IEQ/g/páncreas. La viabilidad, usando tinción AO/PI, fue 89,9%. GSIS, que se realizó para confirmar la capacidad de respuesta de NPCC a la concentración de glucosa, dio un índice de estimulación promedio (SI) de 2,3 (Tabla 1, Archivo adicional 1: Fig. S1).

Concentración de PSome Requerida para Nano-encapsulación Eficiente de NPCC

Para determinar la concentración de PSome requerida para nano-encapsulación eficiente, añadimos concentraciones variables de NHS-PSome a NPCC. NHS-PSome se almacenó a una concentración de 1 mg/ml en DH₂O y se diluyó 1:5, 1:10, 1:20 y 1:40 para dar concentraciones finales que variaban de 0,2 a 0,025 mg/ml. La eficiencia de nano-encapsulación se midió por MFI de NPCC nano-encapsulados con PSome cargado con DiD. La concentración final de 0,1 mg/ml (dilución 1:10) mostró la mayor intensidad de fluorescencia a 2 días post-nano-encapsulación (Fig. 1a y b) y la nano-encapsulación subsiguiente de NPCC se realizó a esta concentración.

Mejora de la Eficiencia de Nano-encapsulación en Medio F-10 con pH Fisiológico

La nano-encapsulación de islotes pancreáticos (que contienen NPCC) a menudo se realiza en tampón HBSS básico (pH 8,0 o superior) para mejorar la afinidad de unión entre NH2 en MEC de islotes y NHS conjugado en polímero. Sin embargo, la nano-encapsulación en tampón HBSS básico puede potencialmente dañar NPCC. Así, para minimizar el daño de NPCC y determinar el efecto del pH en la unión NHS-NH₂, NPCC fueron nano-encapsulados a través de NHS-PSome en tampones HBSS o medios de cultivo F-10 simples (usados en este estudio para cultivar NPCC) con pH 7,3 (fisiológico) o pH 8,0 (básico), respectivamente. Cuando NPCC fueron nano-encapsulados en F-10, la morfología normal de NPCC se mantuvo (Fig. 2a), y la eficiencia de nano-encapsulación basada en MFI aumentó significativamente comparada con el grupo HBSS independientemente del pH en días 0 y 6 (Fig. 2b). Aunque los grupos HBSS mostraron diferencia significativa entre pH 7,3 y 8,0 en día 6, la intensidad de nano-encapsulación disminuyó significativamente comparada con el grupo F-10. Por lo tanto, usamos medio de cultivo F-10 fisiológico (pH 7,3) como tampón de reacción de nano-encapsulación en experimentos subsiguientes para minimizar el daño potencial de NPCC.

Aumento de la Tasa de Recuperación de NPCC Tras Nano-encapsulación

Aunque el daño celular de NPCC se minimizó en F-10, la cantidad de NPCC recolectados después de nano-encapsulación se redujo marcadamente. Para resolver este problema, añadimos 0,25% BSA a medio F-10 durante cultivo y nano-encapsulación de NPCC usando NHS-PSome. Inicialmente confirmamos si añadir 0,25% BSA en medio F-10 afecta la eficiencia de recubrimiento y la permeabilidad selectiva, permitiendo el paso de moléculas pequeñas (dextrano conjugado con FITC de 10 y 20 kDa) mientras bloquea moléculas más grandes (dextrano conjugado con FITC de 70 y 250 kDa), como función esencial de PSome. Como resultado, el recubrimiento conformal se mostró en imágenes de CLSM (Fig. 3a, Mid) y la permeabilidad selectiva se mantuvo normalmente (Fig. 3b, dextrano conjugado con FITC) en NPCC nano-encapsulados con NHS-PSome con F-10 conteniendo 0,25% BSA comparado con F-10, aunque MFI se redujo ligeramente (Fig. 3b). Las cantidades de NPCC recolectados después de nano-encapsulación mostraron una tasa de recuperación significativamente mayor (71,9%) en F-10 con 0,25% BSA que en F-10 sin BSA (42,3%) (Fig. 3c). La viabilidad (NC: 89,5%, NHS-PSome: 90,3%) y la secreción de insulina estimulada por glucosa (NC: 2,1, NHS-PSome: 1,6) de NPCC en F-10 con 0,25% BSA también se mantuvieron después de nano-encapsulación (Fig. 4a, b, Archivo adicional 1: Fig. S2). Nuestros resultados indican que la adición de 0,25% BSA puede aumentar significativamente la tasa de recuperación de NPCC después de nano-encapsulación y no afectó la eficiencia de recubrimiento o función de PSome.

Estabilidad Mejorada de Nano-encapsulación Mediante Entrecruzamiento de PSomes

Para inducir una nano-encapsulación más estable de NPCC, intentamos conjugar PSomes que tienen dos grupos funcionales diferentes. Primero, realizamos nano-encapsulación de NPCC añadiendo simultáneamente diferentes proporciones de PSomes que contienen grupos bifuncionales NHS y NH₂ (NHS-/NH₂-PSome) en un PSome (Esquema 1). La eficiencia de nano-encapsulación se confirmó por el MFI de DiD conjugado en NPCC nano-encapsulados con PSome. Las imágenes resultantes de microscopía de fluorescencia no mostraron diferencias significativas entre grupos 9:1, 5:5 y 1:9 de NPCC nano-encapsulados con NHS-/NH2-PSome (9:1, 5:5, 1:9) en día 0 y día (Fig. 5a). Sin embargo, en los resultados de CLSM, el grupo 5:5 pareció sobre-recubierto y 1:9 mostró recubrimiento insuficiente mientras el grupo 9:1 formó un recubrimiento conformal, en día 1 (Fig. 5b). Por lo tanto, determinamos la proporción óptima de NHS-/NH2 en PSome como 9:1. Cuando se realizaron ensayos funcionales para el grupo 9:1, nuestros resultados mostraron que la viabilidad del grupo 9:1 disminuyó significativamente comparada con el control NC (92,1%), pero la viabilidad se mantuvo en niveles normales (87,8%). La función SI del grupo 9:1 fue normal (3,0) comparada con el control NC (3,7) (Fig. 5c,d).

Discusión

La diabetes mellitus, comúnmente conocida como diabetes, es una enfermedad metabólica caracterizada por altos niveles de glucosa en sangre. La diabetes tipo 1 resulta del fallo de las células beta en el páncreas para producir suficiente insulina [16]. El trasplante de islotes pancreáticos que contienen células β productoras de insulina se ha usado recientemente para curar diabetes tipo 1. Sin embargo, el trasplante de islotes alogénicos está limitado debido a la escasez de donantes; en su lugar, el xeno-trasplante usando islotes de animales no humanos ha emergido como fuente alternativa de tejido donante. Debido a sus similitudes fisiológicas con humanos, facilidad de cría en masa y disponibilidad de cría en instalaciones libres de patógenos, los cerdos son considerados un modelo animal óptimo para xeno-trasplante de islotes [1]. Especialmente, NPCC se han usado valiosamente tan buenos como API. Aunque la madurez de NPCC es menor que la de API, NPCC tienen algunas ventajas sobre API incluyendo, tener un procedimiento de aislamiento de islotes relativamente simple e económico, capacidad de desarrollar resistencia a ambientes hipóxicos y proliferación in vivo después del trasplante [1,2,3]. Por estas razones, usamos cerdos neonatales de 3-5 días como fuente de islotes en este estudio.

Desafortunadamente, una vez que islotes de cerdo se implantan en vasos sanguíneos de humanos o primates no humanos, reacciones inmunes severas como IBMIR o rechazo hiperagudo a menudo ocurren. IBMIR usualmente ocurre debido a varios factores tisulares (TF) expresados en islotes de cerdo que median coagulación en vasos sanguíneos humanos vía activación de una vía extrínseca. Antígenos alfa-galactosa o no-gal expresados en la superficie de células de cerdo también pueden ser objetivos de anticuerpos naturales humanos, seguidos por una activación de cascada de complemento llamada rechazo hiperagudo. Como resultado, los injertos se pierden tras hipoxia por formación de coágulos de la vía de coagulación y muerte celular por activación de complemento en el huésped [3]. Para resolver estos problemas, la encapsulación, un método de recubrimiento de islotes pancreáticos con materiales biocompatibles para protegerlos contra ataque por anticuerpos o reacciones de complemento, se ha intentado. Primero, la macro-encapsulación usa un dispositivo con membrana semipermeable que contiene el islote y se implanta junto a vasos sanguíneos donde libera insulina en el torrente sanguíneo en respuesta a niveles de glucosa en sangre [4]. Segundo, la micro-encapsulación, principalmente usando alginato, tiene permeabilidad selectiva y puede permitir el paso de oxígeno y nutrientes a través de su superficie porosa, mientras bloquea múltiples citoquinas e infiltración de células inmunes. Sin embargo, como usan cápsulas del mismo tamaño independientemente del tamaño de islotes, es difícil recubrir conformalmente los islotes. Además, puede ocurrir fibrosis, encerrando el injerto tras el trasplante [17]. Por último, la modificación de superficie de islotes (nano-encapsulación) usa principalmente polietilenglicol (PEG) que tiene propiedad "efecto sigilo" que bloquea la interacción de materiales recubiertos con polímero "sigilo" (PEG) y componentes en la sangre (células inmunes) in vivo [11, 18]. Nuestra estrategia de nano-encapsulación de NPCC usa copolímeros PEG modificados (PEG-b-PLA, Polimerosoma, PSome). Además, PSome tiene propiedades tanto hidrofílicas como hidrofóbicas y puede incorporar inmunosupresores o factores involucrados en diferenciación o crecimiento celular [8].

La nano-encapsulación de islotes usando PEG se ha realizado en tampón HBSS básico (pH 8,0 o superior) para mejorar la afinidad de unión entre NHS en PEG y NH₂ en MEC de islote [10,11,12]. Sin embargo, ya que estas condiciones no pueden proporcionar un ambiente de cultivo celular adecuado, intentamos nano-encapsulación en un ambiente que imita la condición de cultivo de NPCC. Para abordar los problemas anteriores, probamos medio F-10 simple, medio base de cultivo de NPCC, con pH fisiológico (sin suplementos) usado como tampón de reacción de nano-encapsulación. La nano-encapsulación en F-10 con pH fisiológico mostró una eficiencia de recubrimiento similar y mantuvo morfología normal de NPCC comparada con la condición de cultivo usando tampón HBSS básico (Fig. 3). Por lo tanto, podemos proponer una plataforma que minimice el daño de NPCC durante la nano-encapsulación en un ambiente que imita el cultivo de NPCC.

Aunque el método de nano-encapsulación para minimizar daño de NPCC se estableció, la cantidad residual de NPCC recolectados después de nano-encapsulación disminuyó cuando la nano-encapsulación se realizó en platos de Petri. Esto significa que se requieren más NPCC para nano-encapsulación para trasplante. Según reportes previos, los rendimientos de islotes mejoraron en algunas cepas de ratones usando BSA durante el aislamiento [19]. También, BSA se usó como cultivo en suspensión por pre-recubrimiento de la superficie de platos de cultivo celular en cultivos de células hepatoma de rata [13]. Por lo tanto, para aumentar la cantidad de NPCC después de nano-encapsulación, 0,25% BSA se añadió en tampón de reacción de nano-encapsulación F-10, misma concentración de BSA usada para cultivar NPCC. Como resultado, la tasa de recuperación de NPCC aumentó significativamente después de nano-encapsulación (Fig. 4). Esto significa que el número correcto de islotes (que contienen NPCC) después de la nano-encapsulación puede predecirse y trasplantarse minimizando la pérdida de islotes (que contienen NPCC). En resumen, este estudio usando F-10 con 0,25% BSA para nano-encapsulación mostró que (i) la morfología normal de NPCC se mantuvo, (ii) la unión entre PSome conjugado con NHS y NH2 en MEC de NPCC no se interferió y (iii) la tasa de recuperación de NPCC después de nano-encapsulación aumentó.

Finalmente, intentamos mejorar la estabilidad de nano-encapsulación a través de (i) conjugación entre PSomes y (ii) unión entre PSomes y MEC de NPCC. Primero, polímeros NHS- y NH2-PEG-b-PLA se mezclaron proporcionalmente para formar PSome bifuncional (NHS-/NH2-PSome) que puede unir tanto a PSome como a MEC de NPCC. Postulamos que la conjugación podría lograrse eficientemente por grupos bifuncionales dentro de un PSome en lugar de conjugar dos PSomes con grupos mono-funcionales debido a la interrupción potencial causada por unión entre PSomes con el mismo grupo funcional (NHS-NHS y NH2-NH2). Como se ve en los resultados, el recubrimiento conformal de NPCC se logró a una proporción de 9:1 de NPCC nano-encapsulados con NHS-/NH2-PSome, y la viabilidad y funcionalidad se mantuvieron (Fig. 5). Sin embargo, se necesitan más estudios para cuantificar la fuerza del enlace PSome, para probar que la nano-encapsulación con PSomes bifuncionales resultó en encapsulación más estable que con PSomes mono-funcionales. Por lo tanto, sugerimos que nuestras condiciones efectivas de nano-encapsulación imitando el ambiente de cultivo de NPCC pueden usarse en la estrategia de nano-encapsulación usando islotes que contienen NPCC (Archivo adicional 1).

Conclusión

Este estudio se realizó para determinar un método óptimo de nano-encapsulación de islotes pancreáticos (NPCC) usando polimerosomas (PSomes) basados en PEG. Primero, usar medio de cultivo F-10 con pH 7,3 puede mantener la morfología normal de NPCC después de nano-encapsulación comparado con el uso de tampón HBSS básico (pH 8,0), minimizando así daño a NPCC durante la encapsulación. Segundo, añadir 0,25% BSA a medio F-10 mejoró el rendimiento de NPCC aproximadamente 1,7 veces tras nano-encapsulación. Finalmente, indujimos una nano-encapsulación más estable a través de la conjugación de PSomes bifuncionales (NHS-/NH2-PSomes). Los métodos de nano-encapsulación presentados en este artículo pueden ser aplicables en nano-encapsulación de islotes pancreáticos usando nanopartículas basadas en PEG.

Disponibilidad de datos y materiales

No aplicable.

Abreviaturas

DiD:

1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina, sal 4-clorobenzenosulfonato

AO:

Naranja de acridina

API:

Islotes porcinos adultos

BSA:

Albúmina sérica bovina

BF:

Campo brillante

CLSM:

Microscopía confocal de barrido láser

DAPI:

4',6-Diamidino-2-fenilindol

DMSO:

Dimetil sulfóxido

DH2O:

Agua destilada

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

FBS:

Suero fetal bovino

FITC:

Fluoresceína isotiocianato

GSIS:

Secreción de insulina estimulada por glucosa

HBSS:

Solución salina balanceada de Hank

IBMIR:

Reacción inflamatoria mediada por sangre instantánea

IEQ:

Equivalente de islote

IBMX:

Isobutilmetilxantina

KRBB:

Tampón bicarbonato Krebs-Ringer

MFI:

Intensidad de fluorescencia media

HEPES:

N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanesulfónico ácido)

NC:

Control negativo

NPCC:

Agregados celulares isléticos porcinos neonatales

NHS:

N-hidroxisuccinimida

NHP:

Primates no humanos

PLA:

Poli lactida

PEG:

Polietilenglicol

PSome:

Polimerosomas

PI:

Yoduro de propidio

SI:

Índice de estimulación

TF:

Factor tisular