Nanofibras de curcumina electrohiladas in situ: Acción antibacteriana dual para esterilizar bacterias resistentes a fármacos

Resumen

La infección bacteriana especialmente causada por bacterias multirresistentes aún pone en peligro la vida humana. La terapia fotodinámica (PDT) puede matar bacterias eficazmente, y la PDT basada en nanofibras puede reducir eficazmente el daño a tejidos normales. Sin embargo, los fotosensibilizadores recubiertos en superficies de fibras se liberarían a la herida, causando algunos efectos secundarios. Y las nanofibras preparadas por método tradicional exhiben pobre adhesión en la herida, lo que reduce severamente el efecto PDT debido a su efecto de corto alcance. Aquí, nanofibras compuestas de curcumina núcleo-cáscara se preparan por método de electrohilado in situ mediante un dispositivo de electrohilado portátil autofabricado. Las nanofibras compuestas obtenidas muestran adhesividad superior en diferentes superficies biológicas que la de método de preparación tradicional. Tras irradiación 808-nm, estas nanofibras compuestas producen eficazmente oxígeno singlete (¹O₂) sin desprendimiento de curcumina. Tras exposición de estas nanofibras compuestas a bacterias resistentes a fármacos, exhiben comportamientos antibacterianos duales y matan eficientemente las bacterias resistentes. Estas membranas de nanofibras antibacterianas duales con excelente adhesividad pueden beneficiar la aplicación de infección de herida como apósito antibacteriano.

Antecedentes

La infección bacteriana sin tratamiento oportuno causará septicemia, y la sepsis pone en serio peligro la vida y salud [1-3]. Aunque los antibióticos pueden matar bacterias, el uso prolongado de antibióticos llevará al desarrollo de bacterias resistentes a fármacos, como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) [4-6]. MRSA, como tipo de bacteria multirresistente, es una de las bacterias comunes que causan infección de herida [7]. En esta situación, es necesario encontrar estrategias para matar bacterias seguramente sin desarrollar resistencia. Ya se ha probado que la terapia fotodinámica (PDT) es un método efectivo de esterilización [8-11]. Sin embargo, la mayoría de fotosensibilizadores para PDT requieren luz ultravioleta o excitación de longitud de onda corta [12, 13]. Dado que la profundidad de penetración de luz en organismo depende de la longitud de onda, la profundidad de penetración de luz ultravioleta y visible es superficial, mientras que la profundidad de penetración de luz infrarroja cercana (NIR) es profunda relativamente. Lo peor, la luz ultravioleta y de longitud de onda corta quemarán seriamente tejidos humanos. Para lograr tratamientos antibacterianos seguros y en tejido profundo, desarrollar fotosensibilizadores excitados por luz NIR es una demanda y tendencia. Nanopartículas de conversión ascendente (UCNPs) pueden convertir luz NIR en luz de longitud de onda corta [14, 15]. Debido a esta propiedad, los fotosensibilizadores pueden diseñarse para combinar con conversión ascendente para lograr excitación NIR. UCNPs se usan como estación de conversión de longitud de onda que convierte luz NIR a longitud de onda corta para excitar fotosensibilizadores y producir oxígeno singlete (¹O₂) [16-19]. Sin embargo, estudios previos mayormente sobre preparación de estructura de nanopartículas con fotosensibilizadores recubiertos. Fotosensibilizadores desnudos en la capa más externa de nanopartículas son fáciles de desprender [20, 21], y también tiene algunos efectos secundarios en tejidos biológicos por contacto directo, como inhibir crecimiento de colágeno tisular [22, 23]. De hecho, los fotosensibilizadores pueden lograr esterilización debido a su producción de oxígeno singlete, lo que significa que no hay necesidad de que los fotosensibilizadores contacten directamente con bacterias o tejidos biológicos. Por tanto, podemos diseñar un espaciador para separar fotosensibilizadores de tejidos biológicos para evitar posibles efectos secundarios.

El electrohilado es un método rápido y eficiente para preparar nanofibras, incluyendo nanofibras orgánicas e inorgánicas [24-28]. Durante el proceso de preparación de nanofibras, las nanopartículas se combinan fácilmente con fibras para formar nanofibras compuestas. Hay principalmente dos métodos para formar nanofibras compuestas. Uno es dopar partículas dentro de las nanofibras [29], y el otro es cargar partículas sobre las superficies de nanofibras [30, 31]. Considerando el propósito de separar fotosensibilizadores de tejidos biológicos, incorporar fotosensibilizadores en las nanofibras es más preferible comparado a fotosensibilizadores cargados en superficies de fibras, que es fácil de desprender. Sin embargo, si las nanofibras son hidrofóbicas que no pueden infiltrar, el oxígeno singlete es difícil de producir y entregar a superficies de fibras logrando propiedad antibacteriana [32]. Pero nanofibras hidrofílicas son fáciles de disolver cuando contaminadas por fluido intersticial. Por tanto, es necesario combinar fotosensibilizadores NIR con nanofibras y asegurar que las nanofibras fotodinámicas puedan matar bacterias eficazmente, especialmente bacterias resistentes a fármacos.

En este estudio, la curcumina se usa como fotosensibilizador por sus amplias fuentes de extractos orgánicos. Nanoestructura núcleo-cáscara de UCNPs se usa como estación de transferencia de longitud de onda, y muestra alta eficiencia de conversión para producir ¹O₂. Las nanofibras compuestas UCNPs@Curcumina se preparan por método de electrohilado in situ mediante un dispositivo de electrohilado autofabricado. La adhesión de nanofibras compuestas obtenidas por este método en diferentes superficies biológicas es mejor que el método tradicional de preparación por electrohilado. Tras irradiación 808-nm, estas nanofibras compuestas pueden producir eficazmente ¹O₂ sin desprendimiento de curcumina. Tras contaminación de estas nanofibras compuestas con bacterias resistentes a fármacos de MRSA, ocurrirán comportamientos antibacterianos duales que matan eficazmente las bacterias resistentes.

Métodos

Materiales

Cloruro de tulio, cloruro de iterbio, cloruro de neodimio y cloruro de itrio se compraron de Sigma-Aldrich. Metanol, etanol, ciclohexano, curcumina, diclorometano, acetona, polivinilpirrolidona (PVP), policaprolactona (PCL) y polietilenoimina (PEI) se compraron de Sinopharm Chemical Reagents. Todos los materiales se usaron sin purificación adicional.

Síntesis de Núcleo-Cáscara NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Curcumina

Nanopartículas de conversión ascendente (UCNPs) de NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd se sintetizaron usando métodos de co-precipitación [33, 34]. Posteriormente, 200 mg de UCNPs preparados, 90 mg de PEI, y 180 mg de curcumina se agregaron y disolvieron en diclorometano. Los reactivos se agitaron uniformemente por 20 h a temperatura ambiente, y los productos obtenidos se purificaron por centrifugación y lavados dos veces por etanol.

Preparación de Nanofibras Compuestas de Curcumina Vía Electrohilado In Situ

Un gramo de PCL, 0.16 g de PVP, y 0.1 g de NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Curcumina se agregaron en 5 mL de acetona. Tras 12 h de agitación, se obtuvo una solución precursora homogénea para electrohilado. Tomando 3 mL de la solución precursora en jeringa de 5 mL, se usó un equipo de electrohilado portátil autofabricado para electrohilar, que consiste en aguja metálica de 0.4 mm de diámetro, dos pilas alcalinas, y un convertidor de alto voltaje que puede convertir 3 V de pila a 10 kV para electrohilado. La distancia de electrohilado entre colector y aguja de electrohilado fue aproximadamente 10 cm.

Detección de Formación de ¹O₂

Sensor verde de oxígeno singlete (SOSG) se utilizó para detectar la formación de ¹O₂. Un cuadrado de 9 × 9 mm de membrana de nanofibra nanocompuesta preparada con diferente concentración de UCNPs@Curcumina se agregó en una cubeta de cuarzo, y luego se agregaron 3 mL de metanol conteniendo 25 μM de SOSG. Después, la cubeta se irradió bajo láser 808-nm con diferente tiempo de irradiación. El espectrofotómetro de fluorescencia con longitud de onda de excitación 504 nm se usó para medir la intensidad de fluorescencia de esta solución, que refleja el nivel de oxígeno singlete.

Ensayo Antibacteriano

Bacterias resistentes a fármacos de MRSA y Escherichia coli se usaron para evaluar la capacidad antibacteriana. Brevemente, cepas bacterianas se cultivaron en medio caldo soya tripticasa. Los medios de cultivo conteniendo cepas bacterianas se incubaron a 37 °C por 15 h. Tras cultivo, la concentración de cepa bacteriana fue 1 × 10⁶ UFC/mL. En total, 100 μL de solución bacteriana se colocó en cada pozo de placa de 96 pozos en mesa ultra-limpia estéril. Luego, un trozo de membrana de fibra circular con 6 mm de diámetro se agregó a cada pozo de la placa de 96 pozos. Tras 20 min de irradiación láser 808-nm, la solución bacteriana en la placa se diluyó 10 veces con agua estéril. 10 μL de diluyente se colocó en placa de agar nutritivo para obtener placa de agar uniformemente recubierta. La placa de agar tratada se cultivó en incubadora bacteriana a temperatura constante a 37 °C por 18 h y luego se fotografiaron. En el grupo control, los pasos fueron los mismos que arriba, excepto que no se usó irradiación láser 808-nm. Cada grupo se repitió con 5 placas.

Caracterización

Imágenes TEM y SEM se tomaron de microscopios electrónicos JEM-2010 y SU-1510. Espectro de fluorescencia se midió en espectrofotómetro de fluorescencia Edinburgh FLS1000. El espectro de absorción se registró en espectrómetro Shimadzu UV2550. Espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier se tomó en espectrómetro Nicolet iS50. El potencial zeta se midió con analizador WJL-608. La hidrofilicidad con método de gota sésil se probó por equipo PT-602Atest.

Resultados y Discusión

Caracterización de Nanopartículas y Nanofibras Compuestas

La Fig. 1a muestra imagen TEM de nanopartículas NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd (UCNPs). Demuestra distribución de tamaño uniforme de UCNPs con diámetro promedio ~45 nm. El potencial zeta de estas nanopartículas se probó further +19 mV (Archivo adicional 1: Fig. S1). Tras recubrir UCNPs con curcumina, Fig. 1b muestra estructura núcleo-cáscara y el espesor de cáscara de curcumina es ~5 nm. Posteriormente, estas nanopartículas núcleo-cáscara de curcumina se incrustaron en fibras PCL/PVP. La Fig. 1c muestra imagen SEM de estas nanofibras compuestas preparadas por dispositivo de electrohilado portátil autodiseñado. El diámetro de nanofibras continuas y sin fractura preparadas por este dispositivo es ~400 nm, y la uniformidad de fibra es similar a la de dispositivos de electrohilado tradicionales (Archivo adicional 1: Fig. S2). Debe notarse que este dispositivo de electrohilado portátil puede operarse con dos pilas secas de 1.5 V (Archivo adicional 1: Fig. S3), lo que elimina la limitación de usar suministro eléctrico urbano. Combinado con sus otras ventajas de peso ligero (160 g) y tamaño pequeño, beneficiará uso en exteriores. La Fig. 1d muestra imagen TEM de estas nanofibras compuestas, indicando que las nanopartículas tienen buena dispersibilidad en las nanofibras.

La razón para recubrir cáscara NaYF₄:Nd en núcleo NaYF₄:Yb/Tm fue que puede mejorar la fotoluminiscencia (Fig. 2a). Porque los espectros de fluorescencia de UCNPs se solapan bien con los espectros de absorción UV-Vis de curcumina (Fig. 2b), significa que fotoluminiscencia más fuerte de UCNPs puede transferir más energía a curcumina, lo que fue conducente a la excitación de fotosensibilizadores. Además, considerando que luz NIR con longitud de onda 808 nm penetra más profundamente en tejido vivo que luz NIR con longitud de onda 980 nm, la introducción de esta cáscara NaYF₄:Nd puede modular la longitud de onda de excitación de 980 a 808 nm (Archivo adicional 1: Fig. S4), reduciendo así quemaduras indeseables en tejido normal. La medición FTIR se midió further. Como se ve en Fig. 2c, vibraciones de estiramiento de C=O a 1628 cm⁻¹, C-O a 1282 cm⁻¹, y C-O-C a 1028 cm⁻¹ ocurren en las partículas nanocompuestas (línea naranja), que provienen de curcumina (línea verde). Mientras tanto, hay una vibración de estiramiento de C-N a 1125 cm⁻¹, que proviene de PEI (línea azul). Sus diagramas de estructura molecular se ilustran en apéndice (Archivo adicional 1: Fig. S5). Además, hay un C=C débil aproximadamente 1660 cm⁻¹, que corresponde al ácido oleico al mismo tiempo de síntesis de UCNPs. Puede demostrar los componentes de nanofibras compuestas UCNPs@Curcumina.

La Fig. 2d exhibe curvas de atenuación de fluorescencia de UCNPs antes y después de recubrir curcumina. Muestra que la vida de fluorescencia de UCNPs disminuyó de 700 a 390 μs tras recubrir con cáscaras de curcumina. Basado en γ = 1 - τ₂/τ₁, donde τ₂ y τ₁ son la vida de UCNPs antes y después del recubrimiento de curcumina, γ es la eficiencia de transferencia de energía [35]. Así, γ se calculó 44.3%. Tal alta eficiencia de transferencia de energía se obtuvo, que en primer aspecto fue debido al buen solapamiento entre espectros de absorción de curcumina y fotoluminiscencia de UCNPs (Fig. 2b), para que transferencia de energía no radiativa pueda ocurrir entre ellos. El segundo aspecto fue que UCNPs tenía cáscara NaYF₄:Nd que mejora la intensidad de fluorescencia, aumentando así su área integral de solapamiento espectral. El tercer aspecto fue que la distancia entre curcumina y UCNPs era el espesor de recubrimiento (< 5 nm), y esta pequeña distancia fue conducente a la generación de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) altamente eficiente. El método FRET puede obtener hasta 44.3% eficiencia de transferencia de energía, que también puede beneficiar la siguiente producción eficiente de ¹O₂.

Producción de ¹O₂ desde Nanofibras Compuestas

Para evaluar la capacidad de nanofibras nanocompuestas para producir ¹O₂, se usó el método SOSG. Primero, tomamos nanofibras nanocompuestas con concentración de dopaje fija y observamos la generación de ¹O₂ bajo diferentes tiempos de irradiación. Como se muestra en Fig. 3a, para una concentración fija como 0.20% en peso, el tiempo de irradiación es uno de los factores que afectan la generación de ¹O₂. Cuanto mayor el tiempo de irradiación, más ¹O₂ se produjo. Sin embargo, también muestra que aunque la concentración de ¹O₂ aumenta gradualmente con el aumento de tiempo de irradiación, la tasa de aumento se desacelera gradualmente y permanece casi constante tras 20 min, manifestada por un intervalo de curva denso. Este fenómeno puede deberse al rápido consumo local de oxígeno produciendo ¹O₂ con radiaciones NIR sostenidas, resultando en nivel de oxígeno relativamente bajo en área local, y así disminuyendo la tasa de aumento de producción de ¹O₂.

Para observar la influencia de concentración de dopaje en producción de ¹O₂, Fig. 3b se muestra further. Como se muestra en Fig. 3b, para un tiempo de irradiación fijo como 20 min, con aumento de concentración de dopaje, más ¹O₂ se produjo. Sin embargo, la tasa de aumento de ¹O₂ se desaceleró cuando la concentración fue mayor que 0.20% en peso. Estos resultados experimentales sugieren que no hay necesidad de aumentar infinitamente el tiempo de irradiación y concentración de dopaje para producir más ¹O₂. La elección óptima es 0.20% en peso con 20 min y así en los siguientes experimentos se tomará esta concentración y tiempo de irradiación.

Humectabilidad y Adhesividad de Membrana de Nanofibras Electrohiladas In Situ

Considerando que producir ¹O₂ es un proceso que requiere nanopartículas UCNPs@Curcumina en fibras para interactuar con oxígeno en fluido corporal, el ángulo de contacto de esta membrana de fibra se probó further. La Fig. 4a muestra una gota de agua depositada en la superficie de esta membrana de nanofibra compuesta y su humectabilidad tras 20 s. Comparada con membrana de nanofibra pura PCL (Fig. 4b), la membrana de nanofibra compuesta tiene mejor humectabilidad. Interesantemente, tras sumergir membrana de nanofibra compuesta en solución tampón fosfato (PBS), no se detectó UCNPs@Curcumina en PBS por espectrómetro de absorción, lo que significa que no se desprendió curcumina de las fibras. La razón puede ser que la curcumina se recubrió sobre las UCNPs, por lo que el tamaño de UCNPs@Curcumina (~50 nm) era demasiado grande para penetrar la fibra. Comparado con métodos de fotosensibilizadores recubiertos en partículas o fibras, aumentar primero el tamaño de curcumina y luego doparlo en fibras humectables puede evitar eficazmente el desprendimiento de fotosensibilizadores y mejorar la generación y difusión de ¹O₂. Además, considerando que el efecto de corto alcance de PDT y la pobre adhesión de la membrana de fibra preparada por método tradicional de electrohilado a la superficie de herida (Fig. 4c; Archivo adicional 1: Fig. S6), el efecto fotodinámico se vería afectado debido al intervalo entre la membrana de fibra y la superficie. Afortunadamente, estas nanofibras compuestas de curcumina pudieron prepararse por método de electrohilado in situ con buena morfología (Fig. 1c) y también exhibieron buena adhesividad en diferentes superficies de objetos (Fig. 4d). Significa que el método de deposición por electrohilado in situ para preparar la membrana de fibra fotodinámica es más preferible que el método tradicional de hilado en que la membrana de fibra se recoge en lámina y luego se presiona en la superficie de herida.

Efecto Antibacteriano Dual de Nanofibras Compuestas de Curcumina

Las nanofibras nanocompuestas preparadas por el dispositivo han probado ser no tóxicas por ensayo MTT (Archivo adicional 1: Fig. S7). Further, para probar que las fibras tienen buenas propiedades antibacterianas, se usó el método de conteo para evaluar las propiedades antibacterianas de nanofibras compuestas. Como se muestra en Fig. 5, ya sea que se irradie luz 808-nm en fibras puras, no hay propiedad antibacteriana (Fig. 5a, b). Estos resultados muestran que la luz 808-nm en sí no tiene efecto bactericida. Cuando las fibras se dopan con UCNPs, las bacterias no disminuyen, lo que confirma que UCNPs no tienen efecto bactericida (Fig. 5a′, b′). Interesantemente, cuando las fibras se dopan con curcumina, el número de bacterias disminuye en cierta medida, lo que prueba que la curcumina en sí muestra cierta actividad antibacteriana (Fig. 5c, c′). Además, ocurrió un resultado bactericida obvio en fibras dopadas con UCNPs@Curcumina bajo irradiación luz NIR (Fig. 5d′, e′). Combinado con resultados de Fig. 3, estos resultados bactericidas indican que el ¹O₂ producido de UCNPs@Curcumina bajo irradiación 808-nm podría matar bacterias eficazmente. Por otro lado, la actividad antibacteriana de curcumina fue la misma en presencia y ausencia de irradiación 808-nm, debido a que la absorbancia de curcumina estaba en rango de luz visible (Fig. 2b), por lo que luz 808-nm no fue efectiva. Esta también fue la razón por la que la curcumina se diseñó para recubrir la superficie de UCNPs. Además, Fig. 5d, e muestran fibras dopadas con UCNPs@Curcumina al 0.15% y 0.20% en peso, respectivamente. Por comparación, se encuentra que el grupo 0.20% en peso exhibió mejores propiedades bactericidas a 20 min de irradiación, y el efecto antibacteriano alcanzó 95%. Esto es porque el ¹O₂ producido por el fotosensibilizador curcumina en el efecto fotodinámico puede matar bacterias resistentes a fármacos. Este resultado también es consistente con el resultado de ¹O₂ en Fig. 3. Estos datos further indican que fibras dopadas con UCNPs@Curcumina pueden matar MRSA debido a su actividad antibacteriana dual, es decir, fibras dopadas con UCNPs@Curcumina y PDT, y PDT tiene mejor efecto antibacteriano que fibras dopadas con UCNPs@Curcumina. Además, también realizamos experimentos con Escherichia coli, que también confirmó que nanofibras compuestas de curcumina electrohiladas in situ tienen efectos antibacterianos duales en bacterias resistentes a fármacos (Archivo adicional 1: Fig. S8). Y el efecto antiinflamatorio de las nanofibras se verificó further por tinción H&E de MRSA (Archivo adicional 1: Fig. S9). Tras diferentes tratamientos de infección de herida, gran número de neutrófilos se recolectaron en grupo sin nanofibras nanocompuestas, que eran grupos de células púrpuras y azules debido a lesión tisular e infección supurativa. Sin embargo, pequeña cantidad de tejido de granulación y glóbulos rojos aparecieron en grupo de nanofibras, que indirectamente reflejó las propiedades antibacterianas de nanofibras nanocompuestas. Tiene efecto bloqueante en inflamación de infección de herida.

Conclusiones

En resumen, nanofibras compuestas de curcumina núcleo-cáscara se preparan por método de electrohilado in situ mediante un dispositivo de electrohilado portátil autofabricado. Las nanofibras compuestas obtenidas muestran adhesividad superior en diferentes superficies biológicas que la de método de preparación tradicional. El método, primero aumentando el tamaño de curcumina seguido de doparlo en fibra humectable, puede evitar eficazmente el desprendimiento de fotosensibilizadores, mejorando así la producción de ¹O₂ y su difusión, lo que puede proporcionar inspiración para diseñar otros nanomateriales fotodinámicos. Tras contaminación de estas nanofibras compuestas con bacterias resistentes a fármacos, exhiben comportamientos antibacterianos duales y matan eficientemente las bacterias resistentes. Estas membranas de nanofibras antibacterianas duales tienen excelente adhesión y pueden usarse como apósitos antibacterianos en combinación con hemostasia, permitiendo así hemostasia en exteriores.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados durante el estudio actual están disponibles de los autores correspondientes bajo solicitud razonable.

Abreviaturas

PDT:

Terapia fotodinámica

¹O₂:

Oxígeno singlete

MRSA:

Staphylococcus aureus resistente a meticilina

NIR:

Infrarrojo cercano

UCNPs:

Nanopartículas de conversión ascendente

PVP:

Polivinilpirrolidona

PCL:

Policaprolactona

PEI:

Polietilenoimina

SOSG:

Sensor verde de oxígeno singlete

FRET:

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia

PBS:

Solución tampón fosfato