Morfología superficial regulada de nanofibras compuestas de polianilina / ácido poliláctico mediante dopaje de diversos ácidos inorgánicos para mejorar la biocompatibilidad en la ingeniería de tejidos

Resumen

Los armazones nanofibrosos conductivos y degradables tienen un gran potencial para promover el crecimiento, la proliferación y la diferenciación celular bajo un campo eléctrico externo. Aunque todavía existe el problema de la conductividad eléctrica inferior en los fluidos corporales, las nanofibras degradables basadas en polianilina (PANI) pueden promover la adhesión, el crecimiento y la proliferación celular. Para investigar si el efecto es causado por la morfología de PANI, seleccionamos tres ácidos inorgánicos como dopantes en el proceso de polimerización oxidativa in situ de PANI:ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido perclórico. Las nanofibras compuestas de polianilina / ácido poliláctico (PANI / PLA) obtenidas se caracterizaron mediante análisis SEM, FTIR y XPS, y confirmamos que las nanofibras de PLA fueron recubiertas con éxito por PANI sin ningún cambio en la estructura porosa de las nanofibras de PLA. Las propiedades mecánicas y la degradabilidad in vitro indicaron que se debe considerar la oxidación de los dopantes ácidos y que es probable que tenga un mayor efecto de degradación por oxidación en las nanofibras de PLA. La prueba de ángulo de contacto demostró que las nanofibras compuestas PANI / PLA con diferentes morfologías de superficie tienen una buena humectabilidad, lo que implica que cumplen con los requisitos de los andamios de ingeniería de tejidos óseos. La rugosidad de la superficie y la viabilidad celular demostraron que diferentes morfologías de PANI en la superficie pueden promover la proliferación celular. Cuanto mayor sea la rugosidad de la superficie del PANI, mejor será la biocompatibilidad. En consecuencia, la morfología de la superficie regulada de las nanofibras compuestas de PANI / PLA a través del dopaje con diferentes ácidos tiene un efecto positivo sobre la biocompatibilidad en la ingeniería de tejidos.

Introducción

La matriz extracelular (MEC) es un tipo de red macromolecular secretada por las células hacia el estroma extracelular. Presenta la base de células, tejidos y órganos, acompañados de órganos, y se caracteriza por una estructura de rejilla compleja [1, 2]. Además, proporciona un sitio adecuado para la supervivencia y actividad de las células, determinando su forma, controlando su diferenciación, participando en su migración y metabolismo y, en última instancia, afectando su supervivencia, crecimiento y muerte [3, 4]. Las nanofibras de electrohilado pueden simular la acción de la matriz extracelular para regular el comportamiento celular debido a su alta área de superficie específica, propiedades mecánicas apropiadas y biodegradabilidad. Además, las nanofibras de electrohilado pueden ser multifuncionales mediante la modificación de la superficie sobre la base de mantener su estructura porosa. Por lo tanto, las nanofibras de electrohilado se han convertido en un material candidato prometedor en la ingeniería de tejidos, que se aplica ampliamente en la administración de fármacos, la regeneración ortopédica, la regeneración nerviosa y la reparación [5,6,7,8,9,10].

Los polímeros conductores (p. Ej., Polipirrol [PPy], politiofeno [PTH] y polianilina [PANI]) tienen una buena biocompatibilidad in vitro e in vivo, que puede afectar significativamente la adhesión, proliferación y diferenciación celular, así como la regeneración tisular [11,12 , 13]. Entre estos polímeros conductores, el PANI se considera un material potencial para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa debido a su buena procesabilidad, excelente conductividad, buena estabilidad redox y biocompatibilidad [14, 15]. Bajo estimulación eléctrica, PANI puede regular la adhesión, proliferación, migración y diferenciación celular [16, 17]. De hecho, numerosos informes han concluido que las nanofibras compuestas degradables conductoras basadas en PANI promueven el comportamiento celular bajo un campo eléctrico [18,19,20,21]. Sin embargo, esto implica un problema crucial de que la conductividad de PANI en el ambiente fisiológico (pH =7,4) se debilitará debido al PANI dedoped, que, como han demostrado estudios previos, disminuye sus ventajas de actividad eléctrica de promover la proliferación y diferenciación celular [22]. . Si bien esto presenta claramente una limitación de las nanofibras degradables conductoras basadas en PANI en la ingeniería de tejido óseo bajo estimulación eléctrica externa, aún pueden promover la proliferación y el crecimiento celular en un grado significativo [23, 24]. Aquí, especulamos que la morfología de la superficie de PANI aumenta la rugosidad de las nanofibras compuestas, lo que favorece la adhesión, el crecimiento y la proliferación celular.

La polianilina dopada con ácidos inorgánicos generalmente tiene una buena conductividad eléctrica. Sin embargo, los aniones introducidos por varios dopantes ácidos inorgánicos afectarán la conductividad y estructura de la polianilina [25, 26, 27]. En este artículo, tres ácidos inorgánicos comunes, a saber, ácido clorhídrico (HCl, HA), ácido sulfúrico (H ₂ SO ₄ , SA) y ácido perclórico (HClO ₄ , PA), se seleccionaron como dopantes en una polimerización oxidativa in situ PANI. Luego, se investigaron las propiedades mecánicas, humectabilidad, morfología de la superficie, biocompatibilidad y adhesión celular de las nanofibras de PANI / ácido poliláctico (PLA) bajo diferentes dopantes ácidos. Los resultados indicaron que cuanto mayor es la rugosidad de la superficie del PANI, mejor es la proliferación celular, mostrando así una mejor biocompatibilidad.

Métodos / Experimental

Productos químicos

La anilina (AN) se compró a Sigma, PLA ( M w =60.000) de Solarbio, diclorometano (DCM) de Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., y N, N-dimetilformamida (DMF) de Macklin. Mientras tanto, se compró persulfato de amonio (APS) de Aladdin, HCl y H ₂ SO ₄ se adquirieron de Guangzhou Chemical Co., Ltd. y HClO ₄ fue comprado a Macklin.

Preparación de nanofibras de polianilina / ácido poliláctico

Fabricación de nanofibras de ácido poliláctico por electrohilado

Se agregaron partículas de PLA con una masa específica a una solución mixta de DCM y DMF (relación en volumen de 7:3) antes de agitarlas hasta que se disolvieron, y se obtuvo una solución mixta de PLA al 10%. Luego, la solución de PLA se dispensó en una jeringa y se conectó a una fuente de alimentación de alto voltaje. La máquina de electrohilado (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) se configuró con un voltaje de 15 kV y una distancia de 15 cm. Las nanofibras de PLA obtenidas se secaron al vacío durante la noche a 40 ° C.

Preparación de nanofibras de polianilina / ácido poliláctico dopadas con diferentes ácidos inorgánicos

Las nanofibras de PLA se colocaron en la cámara de la máquina de limpieza por plasma (PCE-6, MTI Corporation, EE. UU.) Y se descargaron durante 2 minutos a una potencia de RF de 30 W. En este artículo, tres ácidos inorgánicos comunes, a saber, HCl, H ₂ SO ₄ y HClO ₄ , se utilizaron como dopantes para la polimerización oxidativa in situ en la preparación de nanofibras PANI / PLA [24], y las nanofibras PANI correspondientes se marcaron como PANI-HA, PANI-SA y PANI-PA, respectivamente, mientras que PANI / PLA Las nanofibras nanocompuestas se etiquetaron como PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA y PANI / PLA-PA, respectivamente. El proceso de preparación de las nanofibras compuestas de PLA y PANI / PLA se muestra en la Fig. 1.

Esquema que representa el proceso de preparación de PLA y nanofibras compuestas PANI / PLA

Se prepararon nanofibras nanocompuestas PANI / PLA en condiciones de baño de hielo [16, 28]. El APS y el AN se añadieron a una solución ácida 1 M según una relación molar de 1:1. Aquí, tomamos el HCl como ejemplo para ilustrar el proceso de preparación de nanofibras PANI / PLA. En condiciones de baño de hielo, el AN (930 mg, 0,01 mol) se añadió gota a gota en APS (2280 mg, 0,01 mol) y se disolvió en 50 ml de HCl 1 M. Inmediatamente, la membrana de nanofibras de PLA tratada con plasma se sumergió en la solución y se agitó durante 2 ha 0 ° C. Después de la reacción, la membrana de nanofibras de PLA se limpió varias veces con HCl y etanol para eliminar el PANI no adherido antes de secarse durante la noche a 40 ° C para obtener nanofibras de PANI / PLA-HA, que se dejaron a un lado para su uso posterior. Las nanofibras compuestas PANI / PLA-SA y PANI / PLA-PA se obtuvieron siguiendo un enfoque similar.

Caracterización

Las pruebas de tracción uniaxial para las nanofibras de PLA y las nanofibras compuestas de PANI / PLA se realizaron mediante una prueba de tensión-esfuerzo (Shimadzu AGX-PLUS, Japón). Aquí, la muestra se cortó en forma de mancuerna, con la velocidad de tracción mantenida a una constante de 3 mm / min. El módulo de Young se calculó a partir de la región lineal de deformación de 0 a 15% en la curva de tensión-deformación, y la resistencia a la tracción y la velocidad de rotura de la curva se determinaron a partir de la fractura de la membrana de nanofibras.

La morfología de los andamios de nanofibras se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japón) para observar las diferentes morfologías del PANI dopado con diferentes ácidos inorgánicos. Antes de la observación SEM, las muestras de nanofibras se rociaron con oro durante 60 s para permitir una observación más clara de la morfología. Mientras tanto, la rugosidad de la superficie de las nanofibras compuestas PANI / PLA se midió utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM, Bruker Dimension Edge). Para confirmar que PANI estaba completamente cargado en las nanofibras de PLA, se utilizó la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) para medir el cambio de longitud de onda de 2000 ~ 500 cm ⁻¹ . La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS; Thermo ESCALAB 250) y Al-Kα se utilizaron como fuentes de emisión de rayos X para determinar aún más la composición de la superficie de las nanofibras PANI / PLA, mientras que su humectabilidad se midió en términos del ángulo de contacto de las gotas de agua a temperatura ambiente mediante análisis del ángulo de contacto (OCA 15 plus, Alemania). La degradación de las nanofibras se evaluó mediante un método de pérdida de masa [29, 30]. Las membranas de nanofibras se cortaron en discos de 16 mm y se colocaron en 20 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) con un pH de 7,4 antes de incubar los armazones a 37 ° C durante 7, 14 y 21 días y se secaron hasta un peso constante. .

Biocompatibilidad de andamios nanofibrosos compuestos PANI / PLA

Biocompatibilidad

En este artículo, la biocompatibilidad de los armazones nanofibrosos compuestos de PANI / PLA se caracterizó mediante un experimento de actividad celular de osteosarcoma humano (HOS). Las células HOS se compraron en el banco de células de la Academia de Ciencias de China, Shanghai. Las células HOS se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco bajo en glucosa (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 U / ml y estreptomicina 100 U / ml antes de incubarlas a 37 ° C y CO2 al 5%. . Cuando el crecimiento celular alcanzó un grado de fusión del 90%, las células se pasaron en una proporción de 1:3.

Las células HOS tuvieron que sembrarse en las nanofibras PANI / PLA antes de la prueba de proliferación celular. Aquí, las nanofibras se colocaron en una placa de 96 pocillos de modo que cubrieran completamente el fondo de la placa antes de esterilizarse mediante UV durante 30 min y mediante una solución de etanol al 75% durante 30 min. Luego se lavaron con PBS. Las nanofibras se inocularon luego con un 1 × 10 ⁴ densidad de pozos, mientras que un grupo de blanco y un grupo de control se establecieron simultáneamente. Luego, las células se incubaron en una incubadora de células a 37 ° C durante uno, tres y cinco días, con el medio renovado cada dos días.

La viabilidad celular de las nanofibras PANI / PLA se evaluó usando un ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolio (MTT). Después de la incubación a uno, tres y cinco días, el medio se retiró de la placa de 96 pocillos y se lavó con PBS tres veces antes de agregar 1 ml de DMEM que contenía 10% 5 mg / ml de MTT. Luego, el medio se incubó a 37 ° C durante 4 h y luego se eliminó antes de agregar DMSO para disolver la metilprednisolona. El medio se hizo vibrar durante 10 min y luego se determinó la absorbancia (BioTek Synergy HTX, EE. UU.).

Inmunotinción fluorescente

Las células HOS se incubaron en la incubadora de nanofibras PANI / PLA durante 24 hy se lavaron con PBS tres veces. Luego, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron con PBS tres veces (10 min cada vez) y se añadieron 10 μL de péptido marcado con FITC 100 nM antes de incubar las células durante 30 min a temperatura ambiente y luego se lavaron con PBS tres veces (5 min cada vez). ). La actina extracelular de las células HOS se tiñó y se utilizó microscopía confocal (Tipo A1, Nikon, Japón) para observar la tinción celular con un aumento de 20 ×.

Adhesión celular

La adhesión de las células HOS en los andamios nanofibrosos compuestos PANI / PLA se observó mediante SEM. Aquí, el medio de cultivo se eliminó después del cultivo de células HOS de nanofibras PANI / PLA de 24 horas y luego se lavó con PBS tres veces antes de la adición de PFA al 4%. El medio se fijó durante la noche a 4 ° C, se lavó con PBS tres veces, se deshidrató con una solución de etanol en gradiente (30%, 50%, 70%, 85%, 90% y 100%, respectivamente; 20 min cada vez), y luego se liofilizó durante 24 h. Antes de la observación SEM, las nanofibras se rociaron con platino durante 120 s para permitir una mejor observación.

Actividad de fosfatasa alcalina (ALP)

ALP es uno de los primeros marcadores de diferenciación de osteoblastos que dependen de la expresión de la enzima fosfatasa alcalina. En este documento, la actividad de ALP se realizó utilizando el kit de ensayo de ALP (Beyotime Biotechnology, P0321S) . Las células HOS se cultivaron en diferentes armazones compuestos PANI / PLA para el 7d designado. Las células se lisaron utilizando 50 μL de Tris-HCl (0,1 M, pH 8) con 0,1% (v / v) de Triton X-100. La actividad de ALP se analiza cuantificando la concentración de p -nitrofenol de p -nitrofenil fosfato (PNPP), que se estima registrando la absorbancia a 405 nm. El porcentaje de actividad ALP de las células cultivadas a lo largo de las nanofibras PANI / PLA se calcula comparando la actividad ALP de las células cultivadas en nanofibras PLA prístinas.

Análisis estadístico

La significación estadística de los resultados se evaluó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando GraphPad Prism (versión 8.02). Aquí, se analizaron las diferencias en propiedades mecánicas, biodegradabilidad in vitro y viabilidad celular entre los diferentes andamios nanofibrosos compuestos PANI / PLA. Los resultados se consideraron significativos cuando p <0.05 (∗) y muy significativo cuando p <0,005 (∗∗).

Resultados y discusión

Las propiedades mecánicas de los andamios de ingeniería de tejidos son indicadores importantes en la evaluación de si los andamios pueden resistir la dinámica de fluidos. La presencia de ácidos inorgánicos puede afectar las propiedades físicas y químicas de la matriz PLA de las nanofibras compuestas PANI / PLA en el proceso de polimerización por oxidación química in situ de PANI. Por lo tanto, es necesario explorar las propiedades mecánicas de las nanofibras compuestas PANI / PLA dopadas con ácidos inorgánicos. Aquí, las propiedades mecánicas de las nanofibras compuestas PANI / PLA se evaluaron mediante una prueba de tracción, que se muestra en la Figura 2, que incluye tensión-deformación, módulo de Young, resistencia a la tracción y alargamiento a la rotura. Como se muestra en la Fig.2a, las nanofibras de PLA exhibieron un comportamiento elástico lineal, y las nanofibras compuestas PANI / PLA-HA y PANI / PLA-SA exhibieron un comportamiento claro de rendimiento, mientras que las nanofibras compuestas PANI / PLA-PA se rompieron inmediatamente después de la deformación elástica. . El módulo de Young (Fig. 2b) de las nanofibras compuestas PANI / PLA fue más alto que el de las nanofibras PLA. En comparación con PLA, el aumento en el módulo de elasticidad de PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA y PANI / PLA-PA fue de 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 y 28,43 ± 8,34 MPa, respectivamente. En términos de resistencia a la tracción (Fig. 2c) y relación de rotura a tracción (Fig. 2d), los de PANI / PLA-HA y PANI / PLA-PA disminuyeron, mientras que los de PANI / PLA-SA aumentaron ligeramente; la resistencia a la tracción y el alargamiento a la rotura de PANI / PLA-PA fueron los más bajos. En comparación con las nanofibras de PLA, la resistencia a la tracción de PANI / PLA-HA y PANI / PLA-PA disminuyó en 0,15 ± 0,01 y 0,64 ± 0,03 MPa, respectivamente, mientras que la de PANI / PLA-SA aumentó ligeramente en 0,13 ± 0,05 MPa. El alargamiento a la rotura de PANI / PLA-HA y PANI / PLA-PA disminuyó en 16,93 ± 1,38% y 35,42 ± 3,94%, respectivamente, mientras que el de PANI / PLA-SA aumentó en 3,32 ± 0,13%.

Propiedades mecánicas de nanofibras de PLA y nanofibras compuestas PANI / PLA. un Curvas representativas de tensión-deformación, b Módulo de Young, c resistencia a la tracción a la rotura, d alargamiento a la rotura

Como se muestra en la Fig. 2, los ácidos inorgánicos seleccionados pueden aumentar el módulo elástico de las nanofibras de PLA a través de la conexión del revestimiento de PANI. En términos de resistencia a la tracción y alargamiento a la rotura, en comparación con las nanofibras de PLA, las propiedades mecánicas de PANI / PLA-HA y PANI / PLA-SA variaron en diferentes grados, mientras que las de PANI / PLA-PA disminuyeron más claramente, y tan pronto como a medida que se aplicó la tensión durante la prueba, se produjo una fractura en menos de 5 s. Estos resultados pueden deberse a la oxidación de HClO ₄ , que resultó en la ruptura del enlace éster en la cadena molecular de PLA y la descomposición oxidativa del grupo carboxilo, lo que posteriormente condujo a propiedades mecánicas inferiores [31]. Mientras tanto, las diferentes propiedades mecánicas de PANI / PLA-HA y PANI / PLA-SA pueden estar relacionadas con la diferente densidad del PANI dopado por HCl y H ₂ SO ₄ , mientras que la introducción del APS en el proceso de reacción también puede haber tenido un ligero impacto en las nanofibras de PLA, y el efecto integral de estos factores exhibe diferentes propiedades mecánicas [32].

La adhesión, proliferación y diferenciación celular se ven afectadas por la morfología, y se cree que una superficie rugosa favorece la adhesión celular [33]. La hidrofobicidad de las nanofibras de PLA implica que la polimerización uniforme de PANI presenta una barrera, mientras que el tratamiento superficial de las nanofibras de PLA con plasma puede mejorar significativamente la humectabilidad [34]. Tras la polimerización in situ basada en PANI con diferentes dopantes de ácido inorgánico, se obtuvieron nanofibras compuestas de PANI / PLA con una deposición superficial uniforme.

La morfología de PANI en la superficie de las diferentes fibras de PANI / PLA se observó mediante FE-SEM (Fig. 3). La figura muestra claramente que la superficie de las nanofibras de PLA estaba cubierta por muchas nanopartículas irregulares y que las nanofibras compuestas de PANI / PLA dopadas con los ácidos inorgánicos pudieron mantener una buena morfología de las fibras y una estructura de nanofibras porosas. Las observaciones morfológicas revelaron que las nanofibras compuestas PANI / PLA se cargaron con éxito con PANI, que proporcionó una base para la adhesión y proliferación celular. Mientras tanto, se utilizó AFM para medir la rugosidad de la superficie de las nanofibras compuestas PANI / PLA, como se muestra en la Fig.4. Ra, el valor medio de la rugosidad de la superficie en tres posiciones diferentes de cada muestra, se usa generalmente para evaluar la rugosidad de la superficie de la muestra. Además, el Ra de las nanofibras compuestas PANI / PLA fue mayor que el de las nanofibras PLA, y el Ra de PANI / PLA-PA fue el más alto. Este aumento en la rugosidad de la superficie aceleró el área de la superficie y la polaridad, proporcionando potencialmente más sitios de crecimiento para las células y promoviendo la adhesión celular.

Morfología de a Nanofibras de PLA, b PANI / PLA-HA, c PANI / PLA-SA y d Nanofibras compuestas PANI / PLA-PA

Imagen AFM y rugosidad superficial (Ra) de a Nanofibras de PLA, b PANI / PLA-HA, c PANI / PLA-SA y d Nanofibras compuestas PANI / PLA-PA

La adhesión celular, la migración y la proliferación se ven significativamente afectadas por la humectabilidad de los andamios [35, 36]. En general, la mojabilidad se evalúa en términos del ángulo de contacto entre el andamio y el agua. Dado que PLA es hidrofóbico, medimos el ángulo de contacto de las gotas de agua en la membrana de nanofibras en 1 s, como se muestra en la Fig.5, y se encontró que los ángulos de contacto de las nanofibras PANI / PLA después del tratamiento disminuyeron significativamente. Los ángulos de contacto correspondientes de PLA, PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA y PANI / PLA-PA fueron 112 °, 61,6 °, 36,7 ° y 37,2 °, respectivamente. La morfología PANI de PANI / PLA aumentó la energía superficial del sistema, aumentando el área de contacto en el contacto inicial con el agua, lo que resultó en la disminución del ángulo de contacto y la mejora de la humectabilidad. El ángulo de contacto de las nanofibras compuestas cambió a 0 ° después de 5 s de contacto con el agua, demostrando así una buena hidrofilia. Este andamio hidrófilo también proporcionó condiciones favorables para la adhesión y difusión celular [37] ya que los grupos funcionales que contienen oxígeno (p. Ej., –OH y –COOH) en la superficie del PLA estaban más unidos a la superficie de la nanofibra después del tratamiento con plasma, y el PANI La morfología y los grupos funcionales que contienen oxígeno trabajaron juntos para garantizar que las nanofibras compuestas PANI / PLA finalmente se humedecieran por completo [38, 39].

Ángulo de contacto de a Nanofibras de PLA, b PANI / PLA-HA, c PANI / PLA-SA y d Nanofibras compuestas PANI / PLA-PA

Los espectros FTIR de nanofibras compuestas de PANI puro y PANI / PLA dopadas con diferentes ácidos inorgánicos se muestran en la Fig. 6. En el espectro de PANI dopado puro (Fig. 6a), los picos característicos fuertes en 1,565, 1,485, 1,298 y 1,125 cm ⁻¹ corresponden a un estiramiento C =C de los anillos de quinoides y un estiramiento C =C, un estiramiento C – N y un estiramiento =C – H de los anillos bencenoides, respectivamente. En el espectro PANI dopado puro (Fig. 6b), además del pico PANI característico, también se puede ver un pico PLA (picos de vibración de estiramiento C – O de 1092 y 1184 cm ⁻¹ , C =O estiramiento pico de vibración de 1757 cm ⁻¹ ). Estos resultados indican que PANI se cargó con éxito en la superficie de las nanofibras PANI / PLA dopadas con ácidos inorgánicos. Para investigar más a fondo la composición química de las nanofibras PANI / PLA, se utilizó XPS para analizar su composición superficial. Además, en los espectros XPS (Fig. 7a), los picos claros de N1s eran visibles a ~ 400 eV en nanofibras compuestas PANI / PLA. Además, los picos de Cl2p fueron visibles a ~ 200 eV en PANI / PLA-HA y PANI / PLA-PA, mientras que la intensidad máxima de Cl2p con PANI / PLA-PA fue mayor que con PANI / PLA-HA. Un pico de S2p apareció a ~ 210 eV en los espectros XPS en PANI / PLA-SA. Los espectros XPS indicaron que Cl ^- , SO ₄ ²⁻ y ClO ₄ ^- se doparon sobre las correspondientes nanofibras PANI / PLA. Además, los átomos de nitrógeno imínico de PANI se oxidaron total o parcialmente para producir una serie de estados de oxidación acompañados de diversos grados de protonación. Los cambios en el estado de oxidación y el nivel de protonación de PANI se midieron en términos de espectros de nivel nuclear de N1 (Fig. 7b-d). Cada espectro de N1s puede descomponerse en cuatro componentes principales con energías de unión de aproximadamente 398,7, 399,6, 400,4 y 401,8 eV, que se pueden atribuir a la imina quinonoide (–N =), amina bencenoide (–NH -), amina protonada (- N ⁺ ) e imina protonada (=N ⁺ ), respectivamente [40, 41]. Con referencia al estudio de Kumar [42], se consideró que el pico de ajuste del espectro de N1s estaba afectado por la carga en los aniones unidos por los átomos de N protonados, lo que resultó en una deslocalización y un ligero cambio.

Espectros FTIR de a PANI, b Nanofibras compuestas PLA y PANI / PLA

Espectros XPS ( a ) de andamios nanofibrosos compuestos PANI / PLA preparados y el PANI / PLA-HA ( b ), PANI / PLA-SA ( c ) y PANI / PLA-PA ( d ) de la señal de nivel de núcleo de N1s

Como plantilla para la reparación y regeneración de tejidos, los andamios bioactivos se degradan y excretan fuera del cuerpo después de la reparación inducida de células y tejidos [43]. En este artículo, las propiedades de degradación de los andamios de nanofibras se evaluaron utilizando un método de pérdida de masa, como se muestra en la Fig. 8. La pérdida de masa de todas las muestras aumentó a los 7, 14 y 21 días, y las tasas de pérdida de masa del PLA las nanofibras fueron 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57% y 12,65 ± 0,83%, respectivamente. Mientras tanto, la pérdida de masa de las nanofibras compuestas PANI / PLA-PA aumentó gradualmente después de la polimerización oxidativa in situ, con tasas de pérdida de masa de 31 ± 2,15%, 34 ± 1,86% y 40 ± 2,54% a las 7, 14 y 21 días, respectivamente, que fueron significativamente más altos que los de las nanofibras PANI / PLA-HA y PANI / PLA-SA. En el proceso de polimerización oxidativa in situ de PANI, la presencia del oxidante APS podría haber destruido el enlace éster en PLA e inducido una reacción de hidrólisis, dando como resultado microfisuras en las nanofibras de PLA. Con la prolongación del tiempo de inmersión en PBS, las microfisuras se acumularon gradualmente y la matriz de PLA comenzó a degradarse gradualmente. El PANI cargado en la superficie también se cayó, lo que resultó en una tasa de pérdida de la calidad de las nanofibras. Con el aumento en el tiempo, la tasa de pérdida de masa se hizo más clara. Aquí, la fuerte oxidación de HClO ₄ agravó la degradación del PLA y aceleró la pérdida de masa de las nanofibras PANI / PLA-PA, lo cual es consistente con las propiedades mecánicas presentadas en la Fig. 2.

Propiedades de degradación de PLA y nanofibras PANI / PLA

La biocompatibilidad de los andamios bioactivos es la base para promover la adhesión, el crecimiento y la proliferación celular [44]. En este documento, estudiamos la proliferación celular de HOS en nanofibras compuestas de PLA y PANI / PLA para ilustrar la adhesión y biocompatibilidad concomitantes. Durante el tratamiento químico y la funcionalización [45], una serie de factores de influencia potenciales podrían entrar en juego en la preparación de andamios bioactivos. Por lo tanto, investigar su biocompatibilidad es clave para evaluar su aplicación práctica.

Para investigar la biocompatibilidad de las nanofibras compuestas PANI / PLA, se evaluó su viabilidad celular utilizando un método MTT. La Figura 9 muestra la actividad celular incubada en nanofibras compuestas de PLA y PANI / PLA después de 1, 3 y 5 días. La figura muestra claramente que con la prolongación del tiempo de incubación, la actividad celular de las nanofibras aumentó gradualmente; las células PANI / PLA-PA exhibieron la mejor actividad, y la actividad celular después de un cultivo de cinco días fue la más alta.

Viabilidad celular HOS cultivado durante 1, 3 y 5 días en nanofibras de PLA y nanofibras compuestas de PANI / PLA (* p <0,05; ** p <0,005)

El PLA es biodegradable, pero hidrófobo, lo que significa que no favorece la adhesión, el crecimiento y la proliferación celular. Después del tratamiento con plasma, la superficie de las nanofibras compuestas PANI / PLA se cargó con grupos que contenían oxígeno y la superficie funcional demostró una buena hidrofilia. La morfología anterior y los resultados de AFM indican que el PANI dopado con diferentes ácidos inorgánicos exhibió diferentes morfologías y niveles de rugosidad en la superficie de las nanofibras de PLA. Mientras tanto, las nanofibras compuestas PANI / PLA exhibieron una excelente humectabilidad. Por lo tanto, consideramos que las diferentes morfologías de PANI dopadas con ácidos inorgánicos llevaron a la mejora de la energía superficial y la polaridad de las nanofibras compuestas PANI / PLA, lo que consecuentemente afectó el crecimiento, migración y proliferación celular, resultando en un mejor desempeño en términos de actividad celular [46].

Para estudiar más a fondo el comportamiento celular de las nanofibras compuestas PANI / PLA, se observó el crecimiento y la adhesión de las nanofibras mediante inmunotinción de fluorescencia (Fig. 10) y SEM (Fig. 11). Aquí, comparamos la actina y la morfología celular en la superficie de diferentes nanofibras. Cuando las células crecieron en las fibras PLA y nanofibras PANI / PLA, los haces de actina demostraron un buen estado de estiramiento. Mientras tanto, la densidad celular de las nanofibras compuestas PANI / PLA fue mayor que la de las nanofibras PLA del grupo de control, con la densidad de crecimiento celular siguiendo el orden PANI / PLA-PA> PANI / PLA-SA> PANI / PLA-HA. Las células HOS crecieron sobre las nanofibras PANI / PLA y se adhirieron en una forma multipolar plana. Claramente, muchas células estaban incrustadas en los poros de las fibras PANI / PLA pero estaban mal estiradas en las nanofibras PLA y no podían expandirse por completo. These results indicate that PANI/PLA composite nanofibers could promote the adhesion and proliferation of HOS cells.

Fluorescence micrographic images on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after the incubation of 24 h

SEM micrographs of HOS seeded on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after 24 h

Meanwhile, the cell immunofluorescence staining and cell adhesion results indicated that the different PANI morphologies on the surface of the PANI/PLA composite nanofibers affected the growth, adhesion, and proliferation of the HOS cells, which was consistent with the above results.

As an early osteogenic marker, the ALP test was conducted on PLA and PANI/PLA composite nanofibers scaffolds for 7 days. Compared to the pure PLA nanofibers, the result (Fig. 12) showed that the ALP activity was significantly improved in of PANI/PLA composite nanofibers. Obviously, the ALP activity of PANI/PLA-PA composite nanofibers is the best. These results proved that PANI/PLA composite nanofibers exhibited better biocompatible, which is consistent with the above results of cell adhesion, growth, and proliferation.

Alkaline phosphatase activity on PANI/PLA composite nanofibers scaffolds (ns = no significance)

Conclusiones

In this paper, PANI/PLA composite nanofibers of different surface morphologies were prepared by three types of inorganic acid as dopant in in situ polymerization. We confirmed that PANI could be successfully loaded on the surface of PLA without changing the porous structure of the nanofibers. The mechanical properties and in vitro degradation experiments demonstrated that oxidizing acids can significantly weaken the mechanical properties and accelerate the degradation of polyester nanofibers. Meanwhile, the rougher surface resulted in a better wettability and promoted the cells adhesion, growth, and proliferation, which indicated a better biocompatibility. In conclusion, the regulated PANI morphology via different acids doping has positive effect on biocompatibility in tissue engineering.

Disponibilidad de datos y materiales

The authors declare that the materials and data are promptly available to readers without undue qualifications for material transfer agreements. Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.

Abreviaturas

PANI:: Polianilina
PLA:: Polylactic acid
ECM:: Extracellular matrix
PPy:: Polipirrol
PTH:: Polythiophene
AN:: Aniline
DCM:: Diclorometano
DMF:: N , N -Dimethylformamide
APS:: Persulfato de amonio
HOS:: Human osteosarcoma cells
DMEM:: Medio Eagle modificado de Dulbecco
PBS:: Solución salina tamponada con fosfato
MTT:: 3–2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide
FITC:: Isotiocianato de fluoresceína
FTIR:: Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier
FE-SEM:: Microscopía electrónica de barrido por emisión de campo
XPS:: Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X
ALP:: Alkaline phosphatase

Investigación de deformaciones en las propiedades de transporte dependientes del giro de nanocintas de γ-grafino entre electrodos de oro El microARN-301 inhibido restringe la angiogénesis y el crecimiento celular en el carcinoma de células escamosas de esófago al elevar el PTEN

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

Teñir

Especias