El efecto fototérmico sinérgico BRAF de silenciamiento genético dirigido inhibe el crecimiento celular del hepatoma mediante el uso del nuevo nanosistema GAL-GNR-siBRAF

Material y métodos

Línea de celda

La línea celular de carcinoma hepatocelular de ratón Hepa1-6 se adquirió en Stem Cell Bank, Academia China de Ciencias. Las células se cultivaron en medio DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) que contenía FBS al 10% a 37 ° C con CO ₂ al 5% .

Síntesis de ARNip de BRAF

La secuencia para el ARNip que se dirige al gen BRAF es 5'-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3 'y fue sintetizada por Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, EE. UU.). El gen de luciferasa dirigido disponible comercialmente siGL2 se utilizó como un ARNip de control negativo.

Síntesis de CTAB-GNR

Se sintetizaron nanobarras de oro solubles en agua utilizando una vía de crecimiento mediada por semillas [34]. La solución de semillas se fabricó de la siguiente manera:1 ml de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (0,2 M) (Sinopharm) se mezcló suavemente con 1 ml de HAuCl ₄ (0,5 mM) (Sinopharm). Se agitó la solución a 28 ° C, se mezcló bien y se agregaron 0,12 ml de NaBH ₄ frío. (0.01 M) (Sinopharm) hasta que la solución de semilla obtenida se volvió marrón y permaneció en reserva. Luego, la solución de crecimiento se sintetizó de la siguiente manera:50 ml de CTAB (0,2 M) y 50 ml de HAuCl ₄ (1 mM), 2,5 ml de AgNO ₃ (4 mM) (Sinopharm) se mezclaron ligeramente a 28ºC. Después de una mezcla suave y completa, se agregaron 670 μL de ácido ascórbico (0.079 M) cuando el color de la solución cambiará de amarillo oscuro a incoloro. Se añadieron ciento veinte microlitros de la solución de semillas con agitación suave a 28 ° C, y el color se volvió gradualmente transparente de púrpura a negro púrpura. Después de 24 h de agitación a temperatura constante, la solución se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 min para eliminar CTAB adicional y se liofilizó al vacío en polvo GNR para uso futuro.

Síntesis de MUA-PEI y GAL-PEI-MUA

Se disolvió ácido mercaptoundecanoico (MUA; 654 mg) en 30 ml de cloroformo (CHCl ₃ ) y luego se incubó con 100 mmol de clorhidrato de 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) y 100 mmol de N-hidroxisuccinimida (NHS) durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 100 mmol de polietilenimina (PEI) a la solución anterior. Después de 24 h de reacción a temperatura ambiente, se usó un volumen igual de agua desionizada para extraer el PEI-MUA soluble en agua. Se utilizó el mismo método para completar la activación de d-galactosa en solución acuosa. Luego, se añadió un exceso de d-galactosa activada (500 mmol) a la solución de PEI-MUA soluble en agua anterior, y la reacción se llevó a cabo suficientemente a temperatura ambiente durante 24 h para obtener una GAL-PEI-MUA soluble en agua. complejo.

Síntesis de GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) y PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

Se suspendió polvo liofilizado de CTAB-GNR (10 mg) en 10 ml de complejos PEI-MUA o GAL-PEI-MUA solubles en agua. CTAB fue reemplazado por enlace Au-S cuando se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La solución se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min para eliminar el exceso de sobrenadante y el precipitado se lavó tres veces con agua destilada. Los polvos de PEI-GNR o GAL-GNR se prepararon mediante liofilización, se pesaron y disolvieron en agua sin ribozimas, y luego se observó el efecto de resonancia del plasma mediante un analizador de enzimas multifuncional (Spectra Max M5e, MD, EE. UU.).

Microscopía electrónica de transmisión

El GNR o GAL-GNR se suspendió en agua destilada y la resuspensión se colocó sobre una rejilla de cobre. Después de que las muestras de la malla de cobre se secaron completamente al aire durante 30 minutos, se obtuvieron imágenes de la malla de cobre utilizando un microscopio electrónico de transmisión (LIBRA 120, Carl Zeiss, Alemania).

Análisis ultravioleta-visible

El GNR, PEI-GNR o GAL-GNR se suspendió en agua destilada. El efecto de resonancia de plasmón de superficie de nanomateriales en el rango de longitud de onda de 600 a 900 nm se examinó utilizando un lector de microplacas multifunción (SpectraMax M5e, MD, EE. UU.).

Análisis del potencial zeta y del diámetro hidrodinámico

El GNR, PEI-GNR o GAL-GNR se suspendió en agua destilada, y luego se midieron el potencial zeta y el diámetro hidrodinámico del nanomaterial en un Zetasizer Nano ZS.

Análisis de resonancia magnética nuclear

El polvo liofilizado GAL-GNR se disolvió en agua pesada (99%, Sigma) para hacer una suspensión homogénea, y luego la suspensión se transfirió a un tubo de muestra de RMN. La composición de GAL-GNR se determinó por resonancia magnética nuclear (RMN) (Bruker, 600 mhz, Alemania).

Ensayo de cambio de gel

Se mezclaron GAL-GNR y siBRAF según la relación de masa (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 min, se añadió el tampón de carga de ADN a la mezcla. Todas las muestras se agregaron a un gel de agarosa al 2% que contenía 0.01% de Goldview (Bioshop, EE. UU.) Y luego se sometieron a electroforesis a 90 V durante 30 min. El grado de envoltura de siBRAF se visualizó en el sistema de imágenes en gel.

Estabilidad del ARNip en suero

La mezcla de GAL-GNR-siBRAF (6:1) se incubó en suero murino fresco a 37 ° C durante 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 hy 48 h respectivamente. El grupo siBRAF desnudo más suero murino fresco se trató en las mismas condiciones. Se añadió un volumen igual de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2% a la solución de GAL-GNR-siBRAF. Después de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente, se añadió tampón de carga de ADN y todas las muestras se cargaron en un gel de agarosa al 2% (que contenía Goldview al 0,02% (Bioshop, EE. UU.)) Y se sometieron a electroforesis a 90 V durante 30 min. El brillo de la tira del siBRAF se visualizó en un sistema de imágenes en gel.

Ensayo de inhibición competitiva de GAL-GNR-siBRAF

2 × 10 ⁵ Las células Hepa1-6 se cultivaron en microplacas de 12 pocillos durante la noche. Luego, las células se pretrataron con ácido lactobiónico durante 12 hy luego se transfectaron con GAL-GNR - siBRAF (marcado con Cy3) durante 30 min. La intensidad de la fluorescencia intracelular se determinó mediante microscopio de fluorescencia (barra de escala =200 μm).

Capacidad de parto dirigido al cáncer de hígado de GAL-GNR-siBRAF

Se incubó un microgramo de siBRAF etiquetado con cy3 con PEI-GNR (30 μg / mL), GAL-GNR (30 μg / mL) durante 20 min a temperatura ambiente, y luego se agregó al medio de células Hepa1-6. Después de la incubación durante 30 minutos, las células se lavaron con FBS al 50% tres veces y se midió la intensidad de la fluorescencia en las células con un microscopio de fluorescencia.

Efectos fototérmicos

Se disolvieron completamente veinte, 40, 60, 80 y 100 μg de GAL-GNR y 100 μg de polvo liofilizado de GNR en 1 ml de agua destilada. La solución se añadió a una placa de 24 pocillos y se irradió continuamente con una fuente de láser de infrarrojo cercano de 803 nm (2 W / cm ² ) durante 15 min. La temperatura de cada grupo se registró con un termómetro infrarrojo cada 0,5 min durante los primeros 5 min, y luego se marcó la temperatura cada 1 min.

Ensayo MTT

Doscientos microlitros de células (3,5 × 10 ⁴ / mL) se cultivó en microplacas de 96 pocillos durante 24 hy luego se cultivó con diferentes concentraciones de GNR o GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg / mL). Después de 24 o 48 h de incubación, se agregaron 20 μL de MTT al sistema de cultivo y se incubó durante 4 h más. Los cristales de color púrpura se disolvieron en 150 μL de DMSO, seguido de un análisis espectrofotométrico a 490 nm utilizando una referencia de 650 nm en un lector de microplacas (SpectraMax M5e, MD, EE. UU.).

Prueba de tinción con calceína-AM y PI

Células Hepa1-6 (1,5 × 10 ⁵ ) se mantuvieron durante la noche en una placa de 12 pocillos y se trataron con PBS, láser, GAL-GNR-siBRAF (30 μg / mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2 (30 μg / mL:1 μg) + láser o GAL -GNR-siBRAF (30 μg / mL:1 μg) + láser durante 4 h, y luego irradiado con luz infrarroja cercana (808 nm, 2 W / cm ² ) durante 15 min. La citotoxicidad de GAL-GNR se detectó mediante experimentos de tinción con calceína-AM (células vivas) y PI (células muertas). La fluorescencia verde de calceína-AM y la fluorescencia roja de PI se fotografiaron bajo microscopía de fluorescencia.

PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN celular total se extrajo usando Trizol (reactivo Trizol, Invitrogen) y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc. La Q-PCR se realizó utilizando cebadores directos e inversos específicos de genes (0,5 μL × 10 μM cada uno) en el sistema Stratagene Mx3000P qRT-PCR (Agilent Technologies, Lexington, MA, EE. UU.). Se utilizó SYBR green PCR MasterMix (Life Technologies) de acuerdo con el esquema del fabricante. Se utilizó el gen de mantenimiento de la β-actina como referencia interna. Las secuencias del cebador fueron β-actina:5'AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3 '(directo) y 5'ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3' (inverso); BRAF:5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3 ′ (hacia adelante) y 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3 ′ (hacia atrás). La diferencia de expresión génica se calculó y mostró por 2 ^−∆∆Ct método.

Western Blot

La proteína total de las células Hepa1-6 se obtuvo mediante tampón RIPA (Cell signaling, Pickering, Ontario, Canadá) y se cuantificó mediante ácido bicinconínico (BCA). La proteína se separó en SDS-PAGE al 12% y se transfirió a fluoruro de polivinilideno (PVDF). El gen de mantenimiento de la β-actina se utilizó como referencia interna para detectar la expresión de la proteína BRAF. La banda de proteína y la referencia interna de la proteína diana se detectaron mediante quimioluminiscencia ECL.

Prueba de Scratch

La Hepa1-6 transfectada (1,7 × 10 ⁵ / ml) se sembraron células en placas de 12 pocillos durante la noche. Las células que se adhirieron completamente a la placa se rasparon con una punta de pipeta de 10 μl. Las células se lavaron dos veces con PBS y se reemplazaron con medio que contenía FBS al 2%. El promedio de la línea de la herida se observó al microscopio después de 0, 24 y 48 h. Cada prueba de rayado se realizó por triplicado.

Ensayo Transwell para migración e invasión

Se utilizaron cámaras transwell de ocho micrómetros (Corning Life Science) para evaluar la migración e invasión celular. Se añadió Hepa1-6 suspendido en 200 μL de medio sin suero a las cámaras superiores a una densidad de 1,7 × 10 ⁵ mL células / pocillo, y luego se agregaron 500 μL de medio que contenía 12% de FBS a la cámara inferior. Después de la incubación durante 24 a 48 h, las células se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% durante 30 min, y luego las células se tiñeron con una solución de violeta cristal al 1% durante 30 min. Finalmente, las células fueron fotografiadas y contadas bajo un microscopio invertido. Para el ensayo de invasión celular, los experimentos de invasión celular requieren recubrimiento de gel ECM y los pasos restantes son consistentes.

Estadísticas

Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Los datos se expresaron como media ± DE y t de Student prueba (de dos colas) para determinar la diferencia entre los dos métodos. Se utilizó una prueba ANOVA de una vía para la comparación de múltiples grupos. Los datos se consideraron estadísticamente significativos en p <0.05 (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001).

Resultados

Síntesis y caracterización del nanoportador GAL-GNR-siBRAF

Diseñamos un nuevo nanoportador GAL-GNR que es capaz de entregar pequeños ARN de interferencia (ARNip) a las células del hígado y mantener el efecto fototérmico de las nanovarillas de oro simultáneamente. El procedimiento de síntesis de GAL-GNR se muestra en el Esquema 1. Este sistema dirigido al hígado contiene tres componentes funcionales. En primer lugar, la parte básica de GAL-GNR es un esqueleto de GNR, que tiene aproximadamente 30 nm de longitud y 10 nm de diámetro, como se muestra en la imagen TEM (Fig.1a) y GNR químicamente conjugado (GAL-GNR) no mostró significancia cambio dimensional y todavía poseía una buena dispersabilidad (Fig. 1b). Los datos del tamaño de partícula mostraron que el tamaño promedio de GNR fue de 30.23 nm, lo cual fue consistente con los resultados de la microscopía electrónica, y el tamaño de GAL-GNR (50 nm) y PEI-GNR (42.35 nm) fue mayor que GNR desde la conjugación de GAL y PEI aumentó la hidratación entre partículas (Fig. 1c). En segundo lugar, el CTAB biológicamente tóxico en la superficie de GNR fue reemplazado por MUA-PEI cargado positivamente que puede cargarse con ARNip cargado negativamente. La medición del potencial zeta mostró que la carga superficial de GNR aumentó de 35,6 a 42,7 mV o 41,8 mV cuando los GNR se modificaron con PEI o GAL-PEI respectivamente, lo que indica que GAL-GNR poseía una gran capacidad para unirse a ARNip (figura 1d). En tercer lugar, aplicamos GAL como molécula guía para conjugar nanoportadores de GNR, que se pueden utilizar para la localización específica del carcinoma hepatocelular. Se usó espectroscopía de absorción UV-Vis para detectar la estructura de GNR modificado de manera preliminar. La longitud de onda del espectro de absorción inicial de GNR sin modificar fue de 763 nm; Inicialmente se observó un desplazamiento de 7 nm en la longitud de onda con la modificación MUA-PEI, y otro desplazamiento de 8 nm al final de la síntesis, cuando la modificación de GNR con GAL con éxito (Fig. 1e). Con el fin de confirmar GAL en el nano-sistema, se utilizó la imagen de RMN para analizar los grupos químicos. Los resultados mostraron que la señal H de la galactosa solo se encontró en el espectro GAL-GNR en el espectro de hidrógeno NMR, que fue δ:3.60, 3.65, 3.70, 3.78, 3.90, 4.53. Los espectros de RMN confirmaron la estructura química de GAL, en la que GAL se conjugó con éxito a la superficie de GNR (Fig. 1f).

Procedimiento sintético GAL-GNR. un El proceso sintético de MUA-PEI. b Activación de d-galactosa y reacción química con MUA-PEI. c El producto sintético final de GAL-GNR

Caracterización de GNR y GAL-GNR. un Micrografía TEM de GNR (escala =0,5 μm / 50 nm). b Micrografía TEM de GAL-GNR (escala =0,5 μm / 50 nm). c Análisis del tamaño de partículas de diferentes GNR modificados. d Análisis de potencial zeta de diferentes GNR modificados (GAL-GNR). e Espectros de absorción UV-Vis normalizados de diferentes GNR modificados y agua. f Espectros de absorbancia de RMN de GAL-GNR

Habilidad y estabilidad de encapsulación de ARNip de GAL-GNR

El nanoesqueleto de GAL-GNR se modificó mediante PEI con carga positiva, que se puede combinar con ARNip con carga negativa a través de la interacción electrostática. Usamos el ensayo de cambio de gel para evaluar la capacidad de unión de ARNip de GAL-GNR. El siRNA libre puede moverse a lo largo del pasaje del gel mientras que el siRNA unido se ralentiza o se detiene por completo. Además, el ARNip unido ya no se unirá eficazmente al bromuro y, por tanto, la intensidad de la fluorescencia disminuirá en consecuencia. El resultado de la electroforesis en gel mostró que la proporción óptima para saturar GAL-GNR con siBRAF es 6:1 (p / p) (Fig. 2a).

Ensayos de desplazamiento de gel. un Capacidad de carga de ARNip de GAL-GNR. Se mezcló un microgramo de ARNip en volúmenes iguales con diferentes proporciones de masa de GAL-GNR. Después de la incubación durante 30 min, se utilizó un ensayo de migración en gel para evaluar la capacidad de carga de ARNip de GAL-GNR. b Estabilidad del ARNip en suero de ratón. Se inoculó un microgramo de ARNip de BARF con GAL-GNR en una proporción de masa de 1:6 y posteriormente se añadió a suero murino reciente. Después de la reacción de 0, 3, 6, 12, 24 y 48 ha 37 ° C, se extrajo el ARNip de GAL-GNR-siBARF mediante SDS al 2% y se visualizaron con bromuro de etidio

El ARNip desnudo es muy degradable, especialmente in vivo. Una función importante del sistema de administración es proteger el ARNip de la degradación. Por lo tanto, probamos el efecto protector del nanoportador GAL-GNR sobre el ARNip en suero fresco en consecuencia. En comparación con el ARNip desnudo, el ARNip unido se almacenó en suero durante períodos de tiempo más largos. Como se muestra en la Fig. 2b, el ARNip desnudo podría existir en el suero hasta por 12 h, mientras que el ARNip unido todavía era abundante después de 48 h. El resultado demostró que GAL-GNR puede prevenir eficazmente que el ARNip se degrade en el suero, lo que garantiza la administración dirigida in vivo.

Citotoxicidad de nanomateriales

La baja toxicidad biológica es otra propiedad importante de los nanomateriales, que permite su uso en el tratamiento del cáncer. Para evaluar la biocompatibilidad de esta nueva nanoestructura GAL-GNR, probamos su citotoxicidad. Como se muestra en la Fig. 3, las células muertas de Hepa1-6 en el grupo tratado con GNR no modificado se observaron inicialmente a una concentración baja de 30 µg / ml. Después de la incubación con 75 μg / mL GNR durante 24 h, la tasa de muerte celular fue de hasta 56,09% y la mortalidad aumentó a 75,5% después de la incubación durante 48 h. Por el contrario, la modificación de GAL redujo significativamente la citotoxicidad. Después de incubar GAL-GNR durante 48 h, más del 80% de las células seguían vivas incluso a alta concentración (105 μg / ml). Estos datos sugirieron que el nanoportador GAL-GNR tenía una alta biocompatibilidad en comparación con GNR, lo que garantiza la seguridad de la aplicación.

Toxicidad de GAL-GNR. Las células Hepa1-6 se trataron con GNR (CTAB-GNR) o GAL-GNR durante 24 o 48 h a las concentraciones indicadas. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT ( n =5)

Entrega de ARNip dirigida a células de hepatoma y silenciamiento de genes de BRAF in vitro

La capacidad de administrar ARNip a las células cancerosas es una de las funciones más importantes de los nanomateriales. Para investigar el potencial de GAL-GNR en la entrega de ARNip, detectamos la eficacia del silenciamiento génico utilizando siBRAF cargado por GAL-GNR en células Hepa1-6. En comparación con el grupo en blanco, la expresión de BRAF en células transfectadas con GAL-GNR-siGL2 (control negativo) no tiene cambios mientras que las células transfectadas con GAL-GNR-siBRAF tuvieron una disminución significativa (Fig. 4a). Además, el efecto de silenciamiento dependía de la dosis, lo que se correlaciona con el aumento de la concentración de GAL-GNR. Los resultados de qPCR demostraron que la concentración ideal transfectada de GAL-GNR-siBRAF era de 30 μg / mL, y la eficiencia de silenciamiento puede alcanzar el 90,29%, similar al grupo de lipofectamina 2000 (control positivo). El resultado de la transferencia Western fue consistente con qPCR, y la expresión de la proteína de BRAF se reguló negativamente después de 48 h de transfección (Fig. 4b).

Entrega de ARNip dirigida a células de hepatoma y silenciamiento génico de BRAF in vitro. un El ARNm de la expresión de BRAF después de la transfección GAL-GNR-siBRAF. Se transfectaron células Hepa1-6 con diversas concentraciones de GA-GNR que portaban la misma cantidad de ARNip de BRAF (1 µg) durante 24 h. La expresión de ARNm de BRAF se determinó mediante qPCR. La barra de error representa la desviación estándar de tres experimentos (*** p <0,001). b La expresión de la proteína de BRAF en Hepa1-6 después de la transfección GAL-GNR-siBRAF. Se transfectaron células Hepa1-6 con GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 o PBS durante 48 h, los niveles de BRAF y β-actina se determinaron mediante transferencia Western. c y d Capacidad de administración dirigida al cáncer de hígado de GAL-GNR-siBRAF. Se incubó un microgramo de siBRAF etiquetado con cy3 con lip2000, PEI-GNR (30 μg / mL), GAL-GNR (30 μg / mL) durante 20 min a temperatura ambiente y luego se añadió al medio de células Hepa1-6. Para el ensayo de inhibición competitiva, las células Hepa1-6 se pretrataron con ácido lactobiónico durante la noche. La intensidad de la fluorescencia intracelular se observó bajo el microscopio de fluorescencia (barra de escala =200 μm) y las expresiones de ARNm de BRAF se cuantificaron mediante q-PCR. La barra de error representa la desviación estándar de tres experimentos (* p <0.05)

El ácido lactobiónico es similar al GAL en estructura que puede combinarse competitivamente con el receptor de asialoglicoproteína (ASGPR) que se expresa en la superficie de la membrana celular del carcinoma hepatocelular [35]. Para confirmar la eficacia de dirección específica de GAL-GNR, las células Hepa1-6 se preincubaron con ácido lactobiónico y luego se transfectaron con GAL-GNR-siBRAF. Las células no tratadas se usaron como control en blanco y el reactivo de transfección clásico lipofectamine 2000 se usó como control positivo. Como se muestra en la Fig. 4c, la intensidad de la fluorescencia roja de las células transfectadas con GAL-GNR fue similar a la del grupo de control positivo, mientras que la intensidad de la fluorescencia de las células transfectadas con PEI-GNR se redujo significativamente. Por otro lado, las células transfectadas con GAL-GNR-siBRAF solo mostraron una fluorescencia roja más fuerte de Cy3 que las células Hepa1-6 pretratadas con ácido lactobiónico (Fig. 4c), y el resultado de qPCR fue consistente con el de los resultados de fluorescencia roja ( Figura 4d). Estos resultados ilustraron además que GAL promovió eficazmente la endocitosis de ARNip por las células Hepa1-6 y se puede aplicar como fracción diana de HCC.

El impacto de GAL-GNR-siBRAF en la proliferación, migración e invasión de células Hepa1-6

BRAF juega un papel importante en la vía MAPK, que es responsable de regular la proliferación, migración e invasión celular [36]. Para evaluar el impacto de GAL-GNR-siBRAF en células de carcinoma hepatocelular, analizamos primero la proliferación celular mediante ensayos MTT. Como se muestra en la Fig. 5a, la proliferación de células hepa1-6 transfectadas con GAL-GNR-siBRAF disminuyó significativamente en comparación con las células tratadas con GAL-GNR-siGL2 (control negativo) o con PBS. A continuación, investigamos el efecto de GAL-GNR-siBRAF sobre la migración celular mediante ensayos de scratch y transwell. Compared with negative control cells, the migration ability of Hepa1-6 cells that transfected with GAL-GNR-siBRAF was evidently reduced (Fig. 5b–d).

The impact of silencing BRAF gene on Hepa1-6 cells by GAL-GNR-siBRAF. un Proliferation of Hepa1-6 Cells. Hepa1-6 cells were transfected with GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, or PBS, and the cell proliferation was measured by MTT assay (n =5). The error bar represents the standard deviation of three experiments (*p <0.05). b Scratch test of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above and then scraped with a 10 μL tip. The cell scratch images were taken at different time points (scale bar =200 μm). c y e Migration and invasion of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above. Cell migration and invasion ability was determined by transwell assay, and imagines were taken at different time points (scale bar =200 μm). d y f Columnar statistical analysis of cell migration and invasive capacity (***p <0.001)

To further investigate the potential of GAL-GNR-siBRAF on the invasion, transwell assays were performed. The results showed that hepa1-6 cells transfected with GAL-GNR-siBRAF haven significantly decreased the invasion of Hepal-6, as compared with GAL-GNR-siGL2 or PBS (Fig. 5e and f). The above results implied that knockdown of BRAF gene using GAL-GNR-siBRAF complexes can effectively reduce migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

Combination Treatment with Photothermal Effect and Gene Silencing of GAL-GNR-siBRAF

Our previous studies have demonstrated that gold nanomaterials can generate thermal energy under near infrared radiation [37]; this phenomenon is called photothermal effect due to LSPR properties of the GNR. Our results showed that, with the increase of GAL-GNR concentration, the heat production capacity of GAL-GNR was enhanced. When the concentration of GAL-GNR is 100 μg/mL, the temperature quickly rises from 24 to over 60 °C. In addition, there was no significant difference in heat production capacity between GNR and GAL-GNR (Fig. 6a).

Photothermal effect induced by GAL-GNR and combination treatment of photothermal effect and gene silencing on liver cancer cells. un 803 nm near-infrared laser source (2 W/cm ² ) was used to irradiate the solution of GNR, GAL-GNR, or distilled water (blank control) for 15 min. The temperature was detected by infrared thermometer at different time point. b Hepa1-6 cells were treated with PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Laser, or GAL-GNR-siBRAF + Laser, respectively. Green fluorescence of calcein AM (live cells) and red fluorescence of PI (dead cells) were observed under fluorescence microscope

The novel nano-system GAL-GNR-siBRAF possesses three individual characteristics:specific targeting of liver cancer, siRNA-based gene silencing of BRAF, and GNR-offered photothermal effects. Thus, we further study the synergistic therapeutic effect of GAL-GNR-siBRAF in anti-tumor treatment. Hepa1-6 cells without GAL-GNR kept higher viability even under near infrared radiation, suggesting laser itself had no significant effect on tumor cells. Once the laser irradiation was carried out on the basis of GAL-GNR-siGL2 treatment, the photothermal effect showed powerful killing ability on Hepa1-6 cells. Although BRAF gene silencing alone induced cell death, the effect was not conclusive. The treatment of cells with the nano-material GAL-GNR-siGL2 plus laser irradiation resulted in much stronger cell-killing ability than BRAF gene silencing individual (Fig. 6b). These data indicates that the BRAF gene silencing and photothermal effect can synergistically increase the potential of killing tumor cells.

Discussion

Difficulties in tumor-targeted delivery are major obstacles in the clinical treatment of tumors. This study demonstrated for the first time that we have developed a novel multifunctional nanocarrier GAL-GNR-siBRAF, and it was provided with many advantages. The modified GAL-GNR not only possessed good biocompatibility but also maintained the LSPR phenomena of GNR skeleton and still has excellent photothermal conversion ability. GNR modified with GAL can home hepatocellular carcinoma cells through ASGPR, which has great potential in targeted molecular therapy of hepatocellular carcinoma. Further studies showed that BRAF gene silencing inhibited the proliferation, migration, and invasion of hepatoma cells. It is worth noting that GAL-GNR-siBRAF shows a stronger cell killing ability in the combination of photothermal effect and gene silencing of BRAF.

RNA interference (RNAi) has attracted much attention due to its crucial role in gene expression and regulation. Using siRNA to knock down sequence-specific genes in cancer cells for gene therapy is an effective and specific targeted gene therapy, and which has become a new therapeutic tool for many diseases including cancer [29, 31]. However, low stability in serum and poor cell uptake limit siRNA in clinical application [38]. On the other hand, siRNA possess negative charge that prevents it from binding negatively charged cell membranes, and siRNA itself is unlikely to be delivered directly into cells [32, 39]. In addition, there are problems associated with low transfection efficiency and poor cell internalization in siRNA therapy [40]. These barriers impede the delivery of siRNA to target cells. To enhance siRNA stability and to strengthen gene silencing efficacy, we synthesized a novel nanocarrier, GAL-GNR-siBRAF, which includes three components (Scheme 1). This nanocarrier has low molecular size (about 30-nm longitude and 10-nm diameter) and good dispersibility (Fig. 1). Additionally, GAL-GNR-siBRAF could effectively load large amount of siRNA at low concentration (Fig. 2a) and protect siRNA degradation from RNase in serum; the siRNA was evidenced by stability for at least two days at 37 °C in the presence of fresh murine serum (Fig. 2b).

Good biocompatibility is essential for nanomaterials used in the field of biotherapy. CTAB is an essential active reagent in the synthesis of gold nanorods although it has apparent cytotoxicity that limits its biological application [41]. In order to reduce the cytotoxicity of the material, we manipulated the GNR by external modification of positive charge PEI and targeting adaptor GAL (d-galactose). Our results showed that, compared with unfunctionalized GNR, GAL-modified GNR has a better biocompatibility. The cell viabilities maintained over 80% even at very high concentrations (105 μg/mL) of GAL-GNR for 48 h (Fig. 3). In addition, the small molecular size and cylindrical shape of the nanorod facilitate its penetration through the cell membrane into the cell [37, 38, 42]. This phenomenon is particularly evident in targeted therapy of cancer cells. Nano-construct modified with the galactose-targeting moieties resulted in high accumulation of GAL-GNR-siBRAF in tumor cells, inducing effective downregulation of BRAF gene expression (Fig. 4). Moreover, according to the competitive inhibition experiments, we found that GAL-GNR entered cells mainly through ASGPR surface receptors of Hepa1-6 cells (Fig. 4c).

It was reported that HCC with high expression of BRAF and RAF1 tends to have rapid proliferation and growth [41, 43, 44]. B-Raf and Raf1 mainly act on the downstream of ERK/MAPK pathway, regulating nuclear factors through cascade amplification. Activation of this pathway accelerates the proliferation and differentiation of HCC cells abnormally [41, 44, 45]. RAF gene can also promote the expression of matrix metalloproteinases (MMPs), which can change the adhesion of tumor cells, degrade extracellular matrix (ECM) and basement membrane, and promote the invasion and metastasis of tumors [44, 45]. BRAF kinase regulates the RAS-RAF-MEK-ERK pathway, which promotes tumor cell proliferation, invasion and metastasis, and allows cell death through apoptosis [5, 46, 47]. In previous work, we found that BRAF gene was highly expressed in Hepa1-6 cells (data were not shown). It is speculated that the knock down of BRAF expression in Hepa1-6 will block the RAS-RAF-MEK-ERK pathway and lead biological changes of Hepa1-6. To verify our hypothesis, we transfected hepatocellular carcinoma cells with GAL-GNR-siBRAF and found that it can restrain the cell proliferation, migration, and invasion significantly (Fig. 5), providing a new strategy for clinical treatment of hepatocellular carcinoma.

Another important advantage of GNR is that it possesses local surface plasmon resonance (LSPR), which can convert absorbed light energy into heat energy under near infrared light irradiation, thereby killing and destroying cells [42]. Then, we explored the light-to-heat conversion ability of GAL-GNR, and the results showed that the modified GAL-GNR can induce heat energy effectively under the irradiation of near infrared light (Fig. 6a). Next, we further investigated the synergistic effects of GAL-GNR-siBRAF. Whereas BRAF gene silencing showed limited cytotoxicity, the treatment of GAL-GNR-siGL2 + laser had a much stronger killing ability on tumor cells. At the same time, the combination of photothermal hyperthermia and BRAF gene silencing could cause more than 85% cell death (Fig. 6b) which indicates that the synergy of GAL-GNR-siBRAF and photothermal effects could be an ideal strategy to inhibit liver cancer.

Conclusion

This study showed that GAL-GNR-siBRAF overcome the obstacle of siRNA degradation, effectively increased the stability of siRNA in serum in vitro. In addition, GAL-GNR-siBRAF can target deliver siRNA to hepatocellular carcinoma cells and knockdown the expression of BRAF and inhibit the cell proliferation, invasion, and migration significantly. More importantly, GAL-GNR-siBRAF, as a new multifunctional nanocarrier, can greatly enhance the ability of killing tumor cells when combined with near-infrared light. In conclusion, GAL-GNR-siBRAF has great potential in treatment of hepatocellular carcinoma and provides new ideas for clinical application of liver cancer.

Disponibilidad de datos y materiales

All data generated and materials used in this study are included in the manuscript and corresponding additional files.

Abreviaturas

GAL:

d-galactose

GNR:

Golden nanorods

siBRAF:

Small interfering RNA specific for BRAF

HCC:

Carcinoma hepatocelular

ASGPR:

Asialoglycoprotein receptor

TACE:

Transcatheter arterial chemoembolization

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

CTAB:

cetyltrimethylammonium bromide

MUA:

Mercaptoundecanoic acid

EDC:

1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PEI:

Polietilenimina

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

NMR:

Nuclear magnetic resonance

FBS:

Suero fetal bovino

DMSO:

Dimethyl Sulfoxide

BCA:

Bicinchoninic acid

PVDF:

Fluoruro de polivinilideno

Rendimiento mejorado de SERS y actividad catalítica de nanoestructuras dendríticas bimetálicas de Au / Ag basadas en dendritas de Ag Toxicidad de nanopartículas relacionada con especies de oxígeno reactivo en el campo biomédico