Efectos inhibidores mejorados sinérgicamente de la coadministración de lovastatina y doxorrubicina mediada por nanopartículas de pululano a células de cáncer de mama triple negativo

Materiales y métodos

Materiales

Pullulan (200 kDa) era de Hayashibara (Tokio). El clorhidrato de LV y DXR eran de J&K Scientific (Beijing). El hidrocloruro de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDCI) y la 4-dimetilaminopridina (DMAP) eran de Aladdin Reagent (Shanghai). Otros reactivos, como disolventes, fueron de Sinopharm Chemical Reagent Co. (Beijing). Las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 (TNBC) y MDA-MB-453 (no TNBC) se adquirieron del Centro de Recursos Celulares de los Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghai. El Reactivo CellTiterBlue era de Promega (Madison, WI, EE. UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Cat # SH30022.01) era de HyClone (EE. UU.), Y el suero fetal bovino (FBS) (Cat # 04-001-1ACS) era de Biological Industries (Israel).

Síntesis del pululano injertado en LV (PLV)

Primero, el monoéster de ácido succínico de LV (LV-SA) se sintetizó mediante los siguientes pasos. En resumen, se disolvieron 0,60 g de anhídrido succínico (SA, 6,0 mmol) y 2,0 g de LV (5,0 mmol) en 20 ml de piridina anhidra y se agitó durante 48 ha 50ºC. La solución de reacción resultante se vertió lentamente en una solución de HCl glacial de 1500 ml de pH 3 con agitación constante para precipitar una gran cantidad de un precipitado blanco, y el pH de la suspensión se ajustó a pH 3 con HCl concentrado, seguido de filtración al vacío. . Luego, el precipitado se lavó con una solución de HCl glacial de pH-3 y luego con ddH ₂ O a neutral para dar un producto crudo. Finalmente, el producto crudo se recristalizó en un sistema disolvente acetona-agua para obtener LV-SA puro y el rendimiento fue del 72%. El PLV se produjo conjugando el grupo ácido carboxílico de LV-SA con el hidroxilo de pululano en relaciones molares de LV-SA a pululano de 1/2, 1/3 y 1/4. En resumen, se disolvieron 0,5 g (1,03 mmol) de LV-SA preparado, 0,15 g de DMAP (1,23 mmol) y 0,24 g de EDCI (1,23 mmol) en 20 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y se agitaron a 50ºC durante 4 h. Se disolvió pululano (0,33 g, 1/2; 0,50 g, 1/3; 0,67 g, 1/4) en DMSO para obtener una solución al 2% (p / v). Luego, se añadió lentamente la solución de pululano a la solución de reacción para la reacción a 50ºC durante 48 h. Las mezclas de reacción se colocaron en bolsas de diálisis (MWCO =8 ~ 12 kDa) y se dializaron frente a etanol al 25% / agua y agua. Luego, las muestras se liofilizaron [32]. Los conjugados de PLV con una relación de alimentación diferente de LV a pululano se caracterizaron mediante análisis FTIR utilizando un espectrofotómetro FTIR (pastillas de KBr, Nicolet, TM Nexus 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los conjugados de PLV también fueron confirmados por ¹ Se calculó la espectroscopia de RMN H (disolvente DMSO-d6, BRUKER AVANCE-500, Bruker, Billerica, MA, EE. UU.) Y se calculó el grado de sustitución (DS) de LV para cada conjugado.

Preparación y caracterización de NP

Se disolvió una cantidad de 50 mg de conjugado de PLV en 12,5 ml de DMSO con agitación suave a 37ºC (para hinchar completamente el conjugado) para obtener una solución de conjugado de 4 mg / ml. Se diluyó una cantidad de 5 ml de solución de conjugado a 2 mg / ml con DMSO para diálisis frente a 1000 ml de agua destilada durante 8 h con 10 intercambios utilizando una bolsa de diálisis (8 ~ 14 kDa). Luego, la solución se sonicó usando un sonificador de tipo sonda (pulverizador ultrasónico de células GA92-IIDA, Suzhou Jiangdong Precision Instruments) a 100 W con pulsaciones (pulso en 2.0 s, apagado 2.0 s) durante 2 min en un baño de agua helada. . Se obtuvieron NP de PLV autoensambladas y las muestras se almacenaron a 4 ° C. Para preparar las NP de PLV / DXR, se disolvieron 2 mg de DXR en 5 ml de DMSO y luego se agregaron gota a gota a 5 ml de solución de conjugado, luego se prepararon las NP de PLV / DXR por el mismo método. En un procedimiento típico para preparar NP de PLV / DXR cargadas con FITC, se disolvió 1 mg de DXR en 2 ml de DMSO y luego se añadió gota a gota a 2,5 ml de solución de conjugado. Luego, se añadió gota a gota 1 ml de solución de FITC (0,6 mg / ml) en DMSO y se prepararon NP de PLV / DXR cargadas con FITC mediante el mismo método.

Los NP de PLV, los NP de PLV / DXR y los NP de PLV / DXR cargados con FITC se filtraron a través de membranas de 0,45 μm, luego se determinaron los tamaños de partículas, los potenciales zeta y los índices de polidispersidad (PDI) mediante la dispersión dinámica de la luz (DLS, Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Las características morfológicas de los PLV NP se observaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM; Tecnai G2 20 S-Twin, FEI Hong Kong) a un voltaje de aceleración de 80 kV.

Determinación de la capacidad de carga y la eficiencia de atrapamiento

Se sonicó una solución PLV / DXR NP (5 ml) durante 5 min (pulso en 2,0 s, apagado en 2,0 s) para liberar el fármaco de las NP. La absorbancia de DXR en la solución se midió a 480 nm usando un espectrofotómetro UV-visible (Shimadzu UV-2550, Kyoto, Japón) para calcular las concentraciones de fármaco. La eficiencia de encapsulación DXR (EE) y la capacidad de carga (LC) se calcularon de la siguiente manera:

Liberación de fármacos in vitro

El perfil de liberación de DXR de PLV / DXR NP se midió en una solución tampón de fosfato 0,1 M a 37 ° C mediante el método de diálisis descrito [33]. Normalmente, se transfirieron 6 ml de NP de PLV / DXR (equivalentes a 139,4 mg de DXR) a una bolsa de diálisis (MWCO =3500 Da) y luego se incubaron a 37 ° C en 15 ml de PBS (pH 7,4 y 5,4). En momentos predeterminados, se retiraron 3 ml de solución tampón externa y se reemplazaron con 3 ml de PBS reciente (pH 7,4 o 5,4). La cantidad de DXR liberada se midió mediante espectrofotometría de fluorescencia. La tasa de porcentaje de liberación del fármaco ( Q %) se calculó de la siguiente manera:

donde W es el peso NP, C _n es la concentración de la muestra en Tn , V es el volumen total de medio de liberación, V _n es el volumen de la muestra (2 mL) y C _i es la concentración de la muestra en T _i ( yo =0, 0.5, 1,… n horas, tanto V ₀ y C ₀ son iguales a cero).

Cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y MDA-MB-453 se cultivaron en medio completo DMEM que contenía FBS al 10% en condiciones de humedad de 37 ° C, CO ₂ al 5% y normoxia (21% O ₂ ). Todas las células experimentales se derivaron de células en fase de crecimiento logarítmica.

Citotoxicidad in vitro

Células MDA-MB-231 y MDA-MB-453 sembradas en placas de 96 pocillos (4 × 10 ³ células / pocillo en un volumen de 100 μl) se cultivaron en condiciones de cultivo de rutina durante 24 h. A continuación, se añadieron NP de PLV / DXR con diversas concentraciones de fármaco (la relación de masa de DXR y LV fue de 8,13) y se incubaron durante 48 h. Por último, se añadieron 20 μL de reactivo CellTiter Blue (Promega) utilizado para medir la proliferación celular y se incubaron durante 1 a 4 ha 37 ° C. Se midió la absorbancia a 530/590 nm usando un lector de microplacas automático. La viabilidad celular se expresó como un porcentaje de la absorbancia con respecto a la de los grupos de control sin tratamiento.

Análisis de efectos sinérgicos in vitro

El análisis de isobolas se utilizó para evaluar cuantitativamente el sinergismo y el antagonismo producido por los fármacos emparejados. De acuerdo con el principio de dosis equivalente de Tallarida y el modelo aditivo de Loewe, se genera una isobole, que es una línea para definir el efecto aditivo de los fármacos emparejados [34, 35]. En la práctica, como describimos anteriormente [8], primero adquirimos las curvas de dosis-efecto para DXR libre y LV libre y después de transformar la dosis y el efecto del fármaco, usamos regresión lineal para obtener ecuaciones de regresión lineal para calcular las dosis combinadas de los pares medicamentos que dan un efecto específico. Los datos para graficar la isobole se ilustran en la Tabla 1. Los puntos en la isobole establecen el DXR / LV en diferentes proporciones para producir un efecto máximo del 50%. Un IC ₅₀ de la dosis de fármaco emparejada ubicada debajo de la isobole indica un efecto sinérgico, mientras que un IC ₅₀ por encima de la isobole indica un efecto antagónico.

Captación celular in vitro

Los NP PLV / DXR FITC se obtuvieron mediante diálisis. La captación celular de PLV / DXR FITC NP se probó utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Se sembraron células MDA-MB-231 y MDA-MB-453 (2 × 10 ⁵ / pocillo) en placas de 2,5 cm y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. A continuación, las células se incubaron con concentraciones de PLV-DXR FITC NP a 37 ° C durante 1, 2 y 4 h. A continuación, se retiró el medio de cultivo y se lavó dos veces con PBS frío. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 5 min y se montaron en portaobjetos utilizando medio de montaje que contenía DAPI. Luego, la captación celular de NP se visualizó mediante microscopía de fluorescencia.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± DE y fueron analizados por la t de Student prueba. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas en P <0.05.

Resultados

Citotoxicidad in vitro y efecto sinérgico de DXR y LV

Para evaluar el efecto inhibidor de LV y DXR contra la proliferación de células TNBC y no TNBC, se evaluó la viabilidad celular mediante el ensayo de azul de Alamar. Primero, determinamos el efecto inhibidor de LV y DXR en las dos líneas celulares de TNBC mediante una prueba de drogas libre. Se obtuvo una serie de relaciones de concentración LV / DXR estableciendo la concentración de un fármaco constante y cambiando la del otro fármaco. Para la línea celular MDA-MB-231, tanto LV como DXR conferían una inhibición dependiente de la concentración, pero LV tenía un efecto inhibidor significativo a concentraciones de hasta 3.0 μM (Fig. 1).

Citotoxicidad de doxorrubicina libre (DXR) y lovastatina libre (LV) en células de cáncer de mama. Citotoxicidad in vitro de DXR, LV y DXR y LV libres combinados contra MDA-MB-231 ( a , b ) y MDA-MB-453 ( c , d ) células cancerosas

El IC ₅₀ Los valores para LV bajo diferentes tratamientos de DXR y para DXR bajo diferentes tratamientos de LV se muestran en la Tabla 2, y también graficamos estos IC ₅₀ valores (Fig. 2a) para reflejar visualmente el efecto combinado de DXR / LV. El IC ₅₀ para DXR libre solo fue de 0,865 µM, y el de LV libre solo fue de 10,07 µM. Cuando la concentración de DXR aumentó de 0,125 a 0,625 μM (aumento de cinco veces), el IC ₅₀ para LV disminuyó de 10,92 a 0,28 μM (reducción de 39 veces), y cuando la concentración de DXR aumentó de 0,625 a 3,125 μM (aumento de cinco veces), el IC ₅₀ El valor de LV disminuyó de 0,28 a 0,0004085 μM (reducción de 685 veces). De manera similar, cuando la concentración de LV aumentó de 1.0 a 3.0 μM (aumento de tres veces), el IC ₅₀ El valor de DXR disminuyó de 1,005 a 0,3033 μM (reducción de 3,3 veces) y cuando la concentración del VI aumentó de 3,0 a 10 μM (aumento de 3,3 veces), el IC ₅₀ El valor de DXR disminuyó de 0,3033 a 0,007196 μM (reducción de 42 veces). Por lo tanto, para la misma tasa de inhibición de la proliferación celular MDA-MD-231, DXR podría reducir significativamente la cantidad de LV necesaria, y LV también podría reducir significativamente la cantidad de DXR necesaria. Este hallazgo es esencial para la quimioterapia tumoral porque la DXR es un fármaco quimioterapéutico muy potente con efectos secundarios adversos indeseables y debe mantenerse en concentraciones bajas, y el LV tiene efectos secundarios adversos mínimos [36]. Para las células MDA-MB-453, DXR mostró una inhibición dependiente de la concentración, pero LV no mostró una inhibición significativa a las concentraciones examinadas. Además, DXR tuvo un efecto inhibidor significativo sobre las células MDA-MB-453 a concentraciones de hasta 3,0 µM, que fue mucho menos eficaz que para las células MDA-MB-231 (Fig. 1). Recientemente hemos descubierto que LV inhibe selectivamente un panel de líneas celulares TNBC en comparación con líneas celulares no TNBC [8]; por lo tanto, la combinación de LV y DXR podría ser adecuada para tratar células TNBC pero no células que no son TNBC.

Sinergismo de DXR y LV. IC ₅₀ valores para DXR y LV con diferentes concentraciones de LV y DXR calculadas por GraphPad Prism 7 ( a ) y el método isobole ( b )

Para evaluar más cuantitativamente el sinergismo de DXR y LV, utilizamos el método isobole. Con diferentes relaciones DXR / LV para lograr un efecto máximo del 50% (Tabla 1), graficamos una isobole que indicaba el efecto aditivo de la relación DXR / LV (Fig. 2b). El IC ₅₀ las dosis de DXR / LV a 0.025 / 7.09, 0.3033 / 3.0 y 0.625 / 0.28 (μM / μM) estaban por debajo de la isobole, lo que sugiere que DXR / LV en estas proporciones produciría un efecto sinérgico. Por lo tanto, este efecto sinérgico (1 + 1> 2) permitiría lograr dosis farmacológicas minimizadas estadísticamente farmacológicamente con una eficacia farmacológica maximizada [37]. Estas tres relaciones sinérgicas parecían representar estos resultados:(1) una dosis baja de DXR (0.025 μM) podría mejorar mejor la eficacia terapéutica del LV porque 0.025 μM DXR podría producir una pendiente negativa mayor para la curva de dosis-efecto del LV (Fig. . 2b); (2) con una alta concentración de DXR, agregar una pequeña cantidad de LV podría ayudar en gran medida al efecto DXR contra las células MDA-MB-231 porque el IC ₅₀ para DXR solo fue 0.865 μM, pero agregar solo 0.28 μM LV redujo el IC ₅₀ de DXR a 0,625 µM, es decir, 0,28 µM LV reemplazó completamente la eficacia de 0,24 µM DXR (Tabla 2); y (3) cuando la dosis de LV fue aproximadamente 10 veces mayor que la de DXR, la relación DXR / LV debería tener el mejor efecto sinérgico porque el punto (0.3033, 3.0) estaba más alejado de la isobole (Fig. 2b).

Síntesis y caracterización estructural de conjugados PLV

Los conjugados anfifílicos de PLV se sintetizaron como se muestra en el Esquema 2. Se obtuvo PLV por esterificación de pululano y LV. Las estructuras de los conjugados PLV fueron confirmadas por FTIR y ¹ Espectros de H RMN (Fig. 3). Según el análisis FTIR (Fig. 3a), se produjeron con éxito conjugados de PLV. Para los espectros de los conjugados PLV, además de mantener los picos característicos del pululano (1644, 1642 y 1648 cm ⁻¹ ), los picos mejorados a 1459 cm ⁻¹ y 1360 cm ⁻¹ también mostró los picos de vibración de flexión de –CH ₃ y –CH ₂ -, respectivamente, para LV. Además, observamos un desplazamiento elevado en el número de ondas de –C =O picos de absorción de estiramiento (unión de éster en LV) a 1725 cm ⁻¹ de conjugados de PLV debido al enlace éster recién generado, y estos picos se mejoraron con una relación molar aumentada de LV a pululano (Fig. 3a).

Síntesis química de conjugados anfifílicos de PLV. LV y anhídrido succínico (SA) reaccionaron bajo la catálisis de piridina para formar LV-SA a 50 ° L. Luego, LV-SA se unió al pululano mediante un enlace éster bajo la catálisis de EDC y DMAP para formar el polímero PLV

Caracterización estructural de conjugados de pululano-lovastatina (PLV). un Espectros FTIR para pululano, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) y PLV (1/4), con un máximo de 1644, 1642 y 1648 cm ⁻¹ como picos característicos del pululano. Las líneas de puntos en 1360, 1459 y 1725 cm ⁻¹ mostrar los picos de vibración de flexión de –CH ₃ - y –CH ₂ - para LV. b ¹ Espectros de RMN H para pululano, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) y PLV (1/4)

Confirmamos la síntesis exitosa de conjugados PLV por ¹ Espectros de H RMN (Fig. 3b). El ¹ Los espectros de H-NMR mostraron los picos característicos del pululano y los nuevos picos asignados al CH ₃ , CH ₂ , y CH protones de la fracción LV a 0.5 ~ 2.7 ppm (marco rojo), lo que indica la conjugación exitosa de LV con pululano. Usamos los picos característicos del pululano a 4.94 ~ 5.14 ppm (a) correspondientes a los protones de enlace glicosídico α-1,6 y α-1,4 de C ₁ definir las unidades de glucosa en pululano [38]. Las señales a 4,12 ppm (b) correspondían al protón del C ₁₃ en LV. Por lo tanto, el DS de los residuos de LV por 100 unidades de glucosa de pululano se calculó mediante la relación de C ₁₃ protones (4.05 ~ 4.15 ppm) de LV a protones de azúcar (4.94 ~ 5.14 ppm) con la siguiente ecuación:DS = I _{4.05 ~ 4.15} / Yo _{4.94 ~ 5.14} × 100%. Los datos de DS para LV se encuentran en la Tabla 3.

Caracterizaciones de PLV NP

El conjugado de PLV sintetizado podría autoensamblarse en micelas en una solución acuosa. El tamaño medio y el índice de polidispersidad (PDI) fueron 177,2 nm y 0,138, respectivamente, para PLV (1/2) NP; 189,7 nm y 0,160 para NP PLV (1/3); y 219,8 nm y 0,050 para PLV (1/4) NP (Tabla 3; Fig. 4a, b). Además, el potencial zeta para PLV (1/2), PLV (1/3) y PLV (1/4) NP fue - 11,66, - 10,51 y - 8,30 mV, respectivamente. El tamaño de los NP de PLV disminuyó con el aumento de DS del LV, sin cambios significativos en el potencial zeta. El cambio de tamaño se atribuye principalmente al fortalecimiento de la interacción hidrófoba entre los grupos del VI, lo que da como resultado la formación de núcleos hidrófobos más compactos [39]. Previamente estudiamos NP de pululano con diferentes valores de DS de colesterol y descubrimos que, hasta cierto punto, cuanto mayor es la DS hidrófoba del polímero anfifílico, menor es el tamaño de las NP formadas [33]. En este estudio, debido a que el DS del grupo hidrofóbico LV fue mayor, el tamaño de los NP también fue menor. Además, las imágenes TEM (Fig. 4c) mostraron que las NP tenían generalmente una forma esférica con buena monodispersidad. Los NP PLV (1/2), con el DS más alto que conduce a la carga LV más alta y el tamaño más pequeño, fueron seleccionados para los siguientes experimentos.

Caracterización de nanopartículas (NP). un Tamaño de partícula y distribución de PLV. b Potencial zeta de PLV. c Imagen de microscopía electrónica de transmisión de PLV (1/2). d Tamaño de partícula y distribución de PLV / DXR y PLV / DXR cargados con FITC. e Potencial zeta de PLV / DXR y PLV / DXR cargado con FITC. f Fotografía de PLV, PLV / DXR y PLV / DXR cargados con FITC

Los NP de PLV / DXR también exhibieron una morfología esférica y un tamaño mayor, 225,6 nm, que los NP de PLV vacíos. La eficiencia de encapsulación y la capacidad de carga de los NP PLV / DXR fue de 20,92% y 1,93%, respectivamente. La interacción hidrofóbica entre el núcleo hidrofóbico de las NP y el grupo hidrofóbico del fármaco determina la cantidad de carga de fármaco en las NP. Teniendo en cuenta que la solubilidad en agua del clorhidrato de DXR utilizado en este experimento fue ligeramente mayor, la interacción hidrofóbica entre DXR y el núcleo hidrofóbico de las NP fue débil, lo que llevó a una menor cantidad de DXR realmente encapsulada en las NP. Para aclarar aún más la captación de NP por las células tumorales, se cargó FITC en NP PLV / DXR. Con carga de FITC, el tamaño medio de las NP PLV / DXR cargadas con FITC fue de 253,8 nm y el potencial zeta medio - 15,09 mV (Fig. 4d, e).

Liberación de fármacos in vitro

Para revelar el comportamiento de liberación de DXR de NP PLV / DXR, se evaluaron perfiles de liberación de DXR in vitro en PBS a pH 7,4 y 5,4, imitando las condiciones en tejidos fisiológicos normales y el microambiente intracelular, respectivamente. Los NP de PLV / DXR exhibieron dos fases de liberación de DXR:una liberación rápida en las primeras 8 horas y una liberación sostenida a partir de entonces (Fig. 5), que es consistente con el perfil de liberación de NP típicos. Además, con una disminución del pH de 7,4 a 5,4, la liberación acumulada de DXR se aceleró significativamente hasta un 76,15% y 97,90%, respectivamente, a las 72 h. Por lo tanto, la liberación de DXR a partir de NP PLV / DXR fue sensible al pH hasta cierto punto, lo que es especialmente útil para mejorar la eficacia terapéutica y reducir los efectos secundarios in vivo [40].

Perfiles de liberación in vitro de DXR de PLV / DXR en solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 frente a 5,4 en diferentes momentos después de la diálisis

Captación celular de NP PLV / DXR cargados con FITC

Obtuvimos imágenes de microscopía de fluorescencia de células MDA-MB-231 (Fig.6a) y MDA-MB-453 (Fig.6b) a las 0.5, 1 y 4 h, respectivamente, después de la exposición a NP PLV / DXR cargadas con FITC y encontraron un aumento dependiente del tiempo en la intensidad de la fluorescencia roja y verde de 0,5 a 4 h después del tratamiento con NP (Fig. 6), lo que indica una captación celular dependiente del tiempo de NP cargadas con DXR y FITC, respectivamente. Además, la cantidad de FITC que ingresa a las células MDA-MB-231 fue mayor que la que ingresó a las células MDA-MB-453. La cuantificación adicional de la intensidad de la fluorescencia reveló una diferencia significativa en la captación de DXR entre las células MDA-MB-231 y MDA-MB-453 1 h después del tratamiento con NP (Fig. 6c).

Captación de fármacos cargados en NP PLV / DXR por células de cáncer de mama. Imágenes de microscopía de fluorescencia de PLV / DXR cargadas con FITC tomadas por MDA-MB-231 ( a ) y MDA-MB-453 ( b ) celdas a las 0.5, 1 y 4 h (azul para DAPI, rojo para DXR, verde para FITC). c Análisis cuantitativo de la captación celular de DXR en células MDA-MB-231 y MDA-MB-453 después del tratamiento con PLV / DXR

Citotoxicidad in vitro de NP PLV / DXR

Después de confirmar el efecto inhibidor de DXR y LV sobre la viabilidad de las células MDA-MB-231 y MDA-MB-453 y demostrar el efecto sinérgico de DXR y LV, determinamos la citotoxicidad in vitro de los NP de PLV / DXR en estas dos células. líneas. Se incubaron células MDA-MB-231 y MDA-MB-453 con NP de PLV / DXR a una concentración equivalente a la del DXR libre. La citotoxicidad de los NP de PLV / DXR aumentó con el aumento de la concentración de DXR y fue mayor para las células MDA-MB-231 que para las células MDA-MB-453 (Fig. 7a). Este hallazgo es consistente con la tendencia de citotoxicidad de los fármacos libres (Fig. 7b) e indica que la carga de fármacos libres en los NP no afectó el comportamiento inhibitorio de los fármacos. Los NP de PLV / DXR tenían un mayor efecto inhibidor sobre la proliferación de MDA-MB-231 que las células MDA-MB-453, lo que era consistente con el efecto inhibidor preferencial de LV sobre TNBC. La inhibición del crecimiento de las células MDA-MB-231 fue mayor con PLV / DXR NP que con DXR libre (IC ₅₀ 0,6012 frente a 0,865 μM), lo que sugiere que las NP podrían facilitar la captación y retención celular del fármaco cargado dentro de la célula, provocando una mayor citotoxicidad en comparación con el fármaco libre.

Citotoxicidad in vitro del fármaco administrado por NP frente al fármaco libre. Citotoxicidad de PLV / DXR ( a ) y DXR gratuito ( b ) contra células MDA-MB-231 y MDA-MB-453

Discusión

En este estudio, los NP de PLV / DXR preparados para la elaboración de perfiles de liberación de fármacos in vitro liberaron DXR de forma sostenible en 72 h, que fue robusto a pH 5,4 (97,9%). Los NP de PLV / DXR inhibieron más fuertemente la proliferación de células TNBC MDA-MB-231 que las células no TNBC MDA-MB-453. Ambas líneas celulares mostraron una captación de NP dependiente del tiempo, pero las células MDA-MB-231 absorbieron más NP que las células MDA-MB-453. Por lo tanto, la entrega conjunta de NP a base de pululano de LV y DXR podría inhibir de manera eficiente la proliferación de células de cáncer de mama TNBC, lo que puede sugerir un poderoso sistema de administración de fármacos para el tratamiento de TNBC.

Recientemente, el uso de LV en la prevención y el tratamiento de TNBC ha ganado reconocimiento, y los estudios han demostrado además que LV inhibe preferentemente la proliferación de células de TNBC e induce la apoptosis [10, 41]. Sin embargo, clínicamente, los LV se encuentran principalmente en preparaciones orales, pero otros medicamentos antitumorales para quimioterapia, incluida la DXR, se encuentran principalmente en forma de inyección. Esta situación da como resultado una eficacia quimioterapéutica indeseable para combinar LV y otros fármacos, por la dificultad de alcanzar el tejido tumoral en la dosis y el tiempo esperados. La formulación de LV como inyección es difícil de lograr debido a su insolubilidad en agua. Por lo tanto, los nano-sistemas de administración son necesarios para que LV se utilice para la eficacia antitumoral y también permitan la coencapsulación de varios fármacos para facilitar la quimioterapia combinada.

Nuestro grupo preparó recientemente un nanocompuesto a base de cerasoma para encapsular el LV, que resolvió el problema de la solubilidad en agua del LV hasta cierto punto, pero la eficiencia de carga del fármaco en general no fue alta (5 ~ 6%) [8]. Zhang y col. desarrolló nanocápsulas conjugadas de camptotecina-floxuridina para cargar LV. Estas nanocápsulas, que constan de dos fármacos quimioterapéuticos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU., Lograron una capacidad de carga de fármaco ultra alta para camptotecina-floxuridina (68,3%), pero la eficiencia de carga para LV todavía era baja (2,8%) [29]. En el presente estudio, utilizamos LV para la modificación hidrofóbica del pululano para obtener conjugados PLV anfifílicos y luego preparamos NP PLV / DXR, que no solo resolvieron el problema de la solubilidad en agua del LV, sino que también arrojaron una alta capacidad de carga de fármaco (15,69%). para LV y 1,93% para DXR).

La estrategia de encapsular dos o más fármacos antitumorales en un nanoportador ha sido ampliamente aceptada para la administración eficaz de fármacos [42]. Sui y col. utilizaron NP de pululano injertado con DXR cargando sorafenib para lograr una quimioterapia sinérgica contra el carcinoma de mama murino [30]. Nuestro estudio utilizó una metodología similar para los NP PLV / DXR, que muestra una mayor eficacia inhibidora para las células MDA-MB-231 en comparación con DXR solo. Sin embargo, los NP de PLV / DXR no mostraron efectos sinérgicos, lo que podría estar relacionado con el retraso de la endocitosis de NP y la liberación de LV, que merece un estudio más detenido.

El índice de combinación se ha utilizado ampliamente para cuantificar los efectos sinérgicos de dos fármacos [43, 44, 45]. El método de análisis de isobologramas utilizado en la evaluación cuantitativa de los efectos sinérgicos puede evitar de forma eficaz resultados falsos positivos [35]. En este estudio, analizamos la relación de sinergia óptima de un rango de relaciones DXR / LV basados ​​en análisis de isobologramas.

Nuestra investigación proporciona un fundamento para el diseño de un sistema de co-entrega más eficiente para provocar efectos inhibidores mejorados sinérgicamente sobre TNBC. Dado que nuestro trabajo es preliminar y se basa en la premisa de que el efecto EPR es factible, se justifican más investigaciones de la eficacia in vivo de este novedoso sistema de co-entrega en TNBC utilizando modelos de crecimiento de tumores de mama ortotópicos y modelos de xenoinjertos derivados de pacientes.

Conclusión

En este estudio, desarrollamos nuevos NP con doble carga de fármaco injertando químicamente LV en pululano y encapsulando físicamente DXR, que tenía una excelente monodispersidad, alta capacidad de carga de fármaco y buen comportamiento de liberación de fármaco. Los NP PLV / DXR mostraron un comportamiento de liberación sostenible sensible al pH de DXR. Los NP de PLV / DXR internalizaron e inhibieron más eficazmente la proliferación de TNBC MDA-MB-231 que las células no TNBC MDA-MB-453. Además, demostramos el efecto sinérgico de una mezcla libre de DXR / LV, que proporciona un régimen de quimioterapia de combinación para un posible tratamiento clínico futuro de TNBC.

Disponibilidad de datos y materiales

Las conclusiones de este manuscrito se basan en los datos que se presentan y se muestran en este documento.

Abreviaturas

¹ RMN H:

Resonancia magnética nuclear de protones

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMAP:

4-dimetilaminopridina

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DS:

Grados de sustitución

DXR:

Doxorrubicina

EDCI:

Clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida

EE:

Eficiencia de encapsulación

EPR:

Permeabilidad y retención mejoradas

ER:

Receptor de estrógeno

FBS:

Suero fetal bovino

FTIR:

Infrarrojos por transformada de Fourier

HER2:

Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano

LC:

Capacidad de carga

LV:

Lovastatina

LV-SA:

Monoéster de ácido succínico de lovastatina

NP:

Nanopartícula

PDI:

Índices de polidispersidad

PLV:

Lovastatina encapsulada en pululano

NP PLV / DXR:

Nanopartículas de PLV cargadas con doxorrubicina

PR:

Receptor de progesterona

SA:

Anhídrido succínico

TNBC:

Cáncer de mama triple negativo

Dinámica de magnetización modulada por la interacción Dzyaloshinskii-Moriya en la unión de túnel magnético de torsión de transferencia de giro de interfaz doble Efecto del dopaje p fácil sobre las características eléctricas y optoelectrónicas de los transistores de efecto de campo ambipolares WSe2