Nanopartículas de oro con quitosano, quitosano N-acilado y oligosacárido de quitosano como portadores de ADN

Diagrama esquemático de cada síntesis: a - b síntesis química para nanopartículas de oro con quitosano en su forma simple (CO-AuNPs) y con grupos acilo hidrofóbicamente modificados (Acyl-CO-AuNPs) y c - f Síntesis verde / en un solo recipiente para quitosano de cadena corta (oligosacárido de quitosano, COS @ n-AuNPs)

Materiales

Trihidrato de cloruro de oro (III) (HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ O), borohidruro de sodio (NaBH ₄ ), quitosano de bajo peso molecular (50-190 kDa, 75% de grado de desacetilación) y oligosacárido de quitosano (bajo peso molecular, 5 kDa) se obtuvieron de Sigma Aldrich. Toda la cristalería se lavó y se dejó en un baño de agua regia recién preparada (HCl:HNO ₃ , 3:1 v / v ) durante 24 h, y se enjuaga bien con agua Mili-Q antes de su uso, para eliminar cualquier rastro de metal [39].

Nanopartículas de quitosano y oro (CO-AuNP)

La síntesis de nanopartículas de quitosano-oro se llevó a cabo siguiendo a Huang et. Alabama. Metodología de [9]. Para ello, se añadieron 20 mg de solución de quitosano de bajo peso molecular (2 mg / ml) a 10 ml de ácido acético al 1% y se mezclaron con vórtex hasta disolución completa y se almacenaron durante la noche. Se filtraron dos mililitros de la solución obtenida usando un filtro de jeringa de polietersulfona de 0.22 μm, luego se mezcló con 1 ml de HAuCl ₄ 10 mM. ∙ 3H ₂ O solución agitando fuertemente durante 30 min. 0,4 ml de NaBH ₄ 100 mM recién preparado se utilizó una solución fría como agente reductor; se añadió gota a gota mientras se agitaba, y se observó un rápido cambio de color de amarillo a rojo vino; después de eso, la agitación continuó durante un tiempo total de 2 h (Fig. 2a).

Nanopartículas aciladas de quitosano y oro (Acyl-CO-AuNP)

Cloruro de caproilo (C ₆ H ₁₁ ClO, Sigma Aldrich) se utilizó para la síntesis de nanopartículas de quitosano-oro aciladas.

Gelación

La acilación de quitosano (de bajo peso molecular) se realizó siguiendo el método informado por Remant Bahadur et al. [6] con ligeras modificaciones. Para ello, se añadieron 0,83 g de quitosano a 100 ml de solución de ácido acético al 1% bajo agitación magnética que continuó durante 24 h. Se filtraron cinco mililitros de esta solución con un filtro de jeringa de polietersulfona de 0,22 µm, y luego se ajustó su pH a 7,2 con una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 M añadida lentamente con agitación vigorosa. Se añadió un mililitro de cloruro de caproilo a 5 ml de esta última solución y la mezcla resultante se agitó durante 5 h. El pH de la mezcla se ajustó a 6,8–7 con una solución de hidróxido. El gel obtenido se precipitó con acetona y se centrifugó a 5000 rpm durante 20 min a 4ºC. El exceso de ácido caproico se eliminó lavando tres veces con metanol (50–60 ° C) y decantando, dejándolo secar durante 3 días en la estufa. Este gel se utilizó para la síntesis de nanocompuestos.

Nanocomposites

Un mililitro de HAuCl ₄ 10 mM ∙ 3H ₂ Se añadió solución de O a 2 ml de gel diluido al 0,33% en una solución de HCl 0,1 M, agitando durante 1 h. Finalmente, agregando a esto los últimos 0.4 ml de NaBH 0.1-M ₄ solución fría recién preparada mientras se agitaba, la formación de nanopartículas de oro era evidente con el color rosa / rojo cambiando antes de completar 2 h de agitación continua (Fig. 2b).

Nanopartículas de oro y oligosacárido de quitosano (COS @ n-AuNPs)

Los COS @ n-AuNP se prepararon siguiendo una metodología modificada informada por Manivasagan et al. [20]. Se añadió oligosacárido de quitosano (COS) a 10 ml de HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ O y se agitó durante 60 min a 80 ° C. Se realizaron cuatro síntesis variando la cantidad de COS (100 y 200 mg) y la concentración de oro en el HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ Solución de O (0,003 y 0,017% en peso). La Tabla 1 muestra los parámetros utilizados en la síntesis de AuNP para cada experimento. La formación de nanopartículas de oro fue evidente con el cambio de color rojo vino / rosado-rojo, registrando cambios de color en diferentes momentos en cada caso, dependiendo de la cantidad de agente reductor y precursor de oro. Los nanocomposites obtenidos se purificaron centrifugando a 12.000 g durante 30 minutos (Fig. 2c – f).

Caracterización de nanocompuestos

Espectroscopia infrarroja

El quitosano usado para CO-AuNP, el quitosano acilado para Acil-CO-AuNP y el oligosacárido de quitosano para series de COS @ n-AuNP se caracterizaron por espectrometría FTIR (Spectrum One, Perkin Elmer) para confirmar la acilación del polímero Acyl-CO comparando el intensidad de bandas características de grupos funcionales entre muestras. El grado de sustitución (SD) se estimó a partir de la información de los espectros de IR, según Remant Bahadur et. Alabama. [6].

ξ-Potential

Se utilizó Zetasizer (Nano Z, Malvern) para evaluar el potencial de la superficie compuesta. Se espera que los nanocomposites tengan un potencial positivo para una adhesión exitosa al ADN para formar complejos. ξ- Se evaluó el potencial antes y después de la formación del complejo para confirmar los cambios después de la adhesión del ADN. Se utilizaron 1,5 ml de muestras diluidas apropiadas para las mediciones del potencial de superficie, utilizando una celda capilar (DTS 1060, Malvern).

Espectroscopia UV-Vis

Se obtuvieron espectros UV-Vis (UV-1800 m, Shimadzu), en un rango de 400 a 700 nm, para la confirmación preliminar de la formación de nanopartículas de oro mediante la banda de resonancia del plasmón superficial alrededor de 530 nm. De forma complementaria, los espectros de nanocomposites recién preparados se utilizaron para evaluar cualitativamente la fotoestabilidad de las muestras; Esto se hizo comparando con los espectros obtenidos de las mismas muestras 150 días después de la síntesis, siguiendo los cambios alrededor de la banda de resonancia del plasmón de superficie, eligiendo una muestra para cada método y utilizando COS @ 2-AuNP como el más representativo de COS @ n-AuNP. serie. Se utilizó una celda de cuarzo como recipiente de la muestra y agua desionizada como blanco.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Se utilizó microscopía TEM (JEM 1010, JEOL) para determinar la forma y la distribución del tamaño de partícula. Para las imágenes TEM, se prepararon muestras de nanocompuestos depositando 10 μl de solución sobre un soporte de rejilla de cobre de malla 200, cubierto con formvar y secando a temperatura ambiente durante 15 min. Se seleccionaron y analizaron tres imágenes para cada muestra mediante un programa de procesamiento de imágenes casero desarrollado con el software Matlab®.

Grado de adhesión y formación compleja

Nanocomposite-pDNA

pSV-β-Gal (6,82 kb) y pIRES2-EGFP (5,3 kb) (pDNA) se aislaron de DH5α Escherichia coli transformada . La purificación del plásmido se realizó mediante lisis alcalina, utilizando el kit de aislamiento de ADN microbiano Mo Bio® UltraClean. Se utilizó electroforesis en gel de agarosa para verificar la integridad estructural de los plásmidos, utilizando un transiluminador ultravioleta de alto rendimiento, adquiriendo imágenes con un sistema de imágenes digitales Kodak Gel Logic 100. La concentración y pureza del ADN plasmídico se validó con el lector de microplacas de detección múltiple Synergy ™ 2 utilizando el programa Gen5. Los complejos se obtuvieron mezclando ADN plasmídico (ADNp) con cada tipo de nanocompuestos de nanopartículas de oro-quitosano en medio de Eagle modificado por Dulbecco sin suero (DMEM, Sigma-Aldrich) en cantidades de plásmido entre 200 y 400 ng. La adhesión del pDNA al nanocompuesto se evaluó mediante electroforesis utilizando gel de agarosa al 0,8% y voltaje de 90 V durante 60 min.

Transfección del complejo quitosano-oro nanopartícula-pDNA en células HEK-293

Cultivo celular

HEK-293 Homo sapiens Se cultivaron células fetales de riñón embrionario con morfología epitelial (humana) en medio de Eagle modificado de Dulbecco con suero bovino fetal (SFB, Sigma-Aldrich) a 37 ° C bajo 5% de CO ₂ -Ambiente que contiene. Para la transfección de pDNA, las células HEK-293 se sembraron a 12.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 ha 37 ° C en CO ₂ al 5%. -que contiene atmósfera, obteniendo un 90% de confluencia.

Eficiencia de transfección con pIRES2-EGFP

La funcionalización de nanocompuestos de ADNp in vitro se realizó vertiendo medio de cultivo de los pocillos hasta cubrir apenas las células y agregando la solución del complejo en cada pocillo (15 μl de nanocompuestos y 200 ng de ADN), incubando durante 2 h en las mismas condiciones de cultivo. Después de eso, se agregaron 500 μl de DMEM completo para la incubación durante 48 h. La transfección de pIRES2-EGFP se evaluó directamente mediante microscopía de fluorescencia (Axio Vert.A1, Carl Zeiss).

Eficiencia de transfección con pSV-β-Gal

Se usó histoquímica de X-gal para evaluar la actividad de β-galactosidasa, modificando la expresión del plásmido pSV-β-Gal en la línea celular HEK-293; en esta metodología, las células transfectadas se volvieron azules. La funcionalización de nanocompuestos de pDNA in vitro se realizó como se explicó anteriormente, incubando durante 2 h en las mismas condiciones de cultivo. Después de eso, se agregaron 500 μl de DMEM completo para incubar durante 24 h, cambiar de medio e incubar durante 24 h más. Los pocillos se lavaron dos veces con 50 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril 1 vez después de eliminar el medio de cultivo, luego las células se fijaron con una mezcla de formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% durante 5 min; después de eso, se lavaron dos veces con 50 µl de PBS 1 x. El fijador se retiró antes de lavar dos veces con 50 μl de PBS 1 × y luego con una mezcla de 0,4 mg / ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, Sigma-Aldrich) diluido en ferrocianuro de potasio 5 mM (Meyer) y cloruro de magnesio 2 mM (Meyer) en PBS 1x. Luego, las células se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente. La expresión de β-galactosidasa se observó mediante microscopía de campo claro (AE2000, Motic), tomando 5 campos por pocillo con objetivo × 40, esperando que las células transfectadas se volvieran azules. La eficacia de la transfección se evaluó comparando las células con expresión de β-galactosidasa (que se volvió azul) con el total de células por campo. LipofectAMINE ^TM 2000 (30 μl) se utilizó como control positivo para cada prueba.

Viabilidad celular por método de exclusión de tinte

Los microcultivos se utilizaron 24 h después del pase celular. Se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron con PBS 1 x antes de añadir 40 µl de solución compleja. Después de eso, las células se incubaron durante 2 ha 37 ° C al 5% de CO ₂ -Ambiente que contiene. Para la exclusión del tinte, la solución del complejo se lavó de las células con 50 µl de PBS 1 x y se incorporaron 20 µl de azul tripán (0,2% en PBS 1 x). Con esta última mezcla, las células se incubaron durante 10 min a 37 ° C y 5% CO ₂ -Ambiente que contiene. Después de esta última incubación, se retiró el colorante de los pocillos y se lavó dos veces con 50 µl de PBS 1 x. Las células se observaron mediante microscopía de campo claro, contando las células teñidas de azul (muertas o dañadas) frente al total de células por campo. Se obtuvieron pruebas de viabilidad celular para diferentes concentraciones de complejos en agua, de 0,1 mM a 3 mM, CO-AuNPs y Acil-CO, a 3 mM; COS @ 3-AuNP y COS @ 4-AuNP, a 0,5 mM; y la concentración más baja (0,1 mM) para COS @ 1-AuNP y COS @ 2-AuNP.

Software Imagen J ( Software de código abierto ( OSS ) licencia ) junto con el complemento Herramienta basada en imágenes para contar núcleos-ICTN se utilizaron para contar células para pruebas de transfección y viabilidad.

Resultados y discusiones

Caracterización y síntesis de nanocompuestos

Entre los tres tipos de complejos sintetizados en este trabajo, COS @ n-AuNP merece una atención especial ya que fueron sintetizados sin el uso de reactivos tóxicos, como borohidruro de sodio o bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). Se ha informado que el quitosano es adecuado como agente reductor y estabilizador y una concentración óptima para sintetizar complejos de AuNP en tamaños y formas deseados dependiendo de múltiples factores:tiempo de reacción, temperatura y grado de desacetilación del quitosano y su peso molecular, entre otros [38 , 40]. Bajo esta consideración, el peso molecular del quitosano se mantuvo constante en 5 kDa para las cuatro síntesis de COS @ n-AuNP, tomando HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ Soluciones de O y quitosano a diferentes concentraciones.

La Figura 3 muestra los espectros de absorción de UV-Vis de nanocompuestos de AuNPs-quitosano sintetizados en este trabajo. Bandas de plasmón centradas a 534 nm para quitosano (CO-AuNPs), 507 nm para quitosano acilado (Acyl-CO-AuNPs) y para los diversos oligosacáridos de quitosano a 533 nm (COS @ 1-AuNPs), 530 nm (COS @ 2 -AuNPs), 535 nm (COS @ 3-AuNPs) y 536 nm (COS @ 4-AuNPs) confirman la presencia de nanopartículas de oro. Los insertos de esta figura muestran imágenes de los nanocompuestos obtenidos cuya coloración depende de la concentración, el tamaño, la forma y la funcionalización de la superficie de las nanopartículas.

Espectros UV-Vis para nanocomposites. Los valores en los recuadros corresponden a la longitud de onda máxima de la resonancia del plasmón de superficie localizada. Estos máximos fueron los siguientes:para CO-AuNP a 534 nm (0,1 M NaBH ₄ ) ( a ), para Acyl-CO-AuNP a 507 nm ( b ) y para el oligosacárido de quitosano COS- @ n-AuNP a 533, 530, 535, 536 nm para cada uno de 1 a 4 preparaciones de nanocompuestos de diferentes espesores ( c )

Estabilidad de nanocompuestos

La Figura 4 muestra la comparación entre los espectros de absorción UV-Vis de nanocomposites recién sintetizados y 150 días después de la síntesis; como se puede observar, los dos espectros para cada caso permanecen esencialmente iguales, sin cambios significativos del máximo de bandas de resonancia y sin evidencia de picos adicionales. Estos resultados sugieren cualitativamente una alta estabilidad de los nanocompuestos obtenidos.

Estabilidad de nanocompuestos de nanopartículas de oro mediante espectros de absorción UV-Vis obtenidos 150 días después de la síntesis:CO-AuNP sintetizados químicamente ( a ) y Acyl-CO-AuNPs ( b ) y síntesis verde / en un solo recipiente para COS @ 2-AuNP ( c )

Las espectroscopias infrarrojas para las tres muestras diferentes de quitosano se muestran en la Fig. 5. Esta técnica se utilizó para la identificación del quitosano acilado comparando sus bandas de absorción dentro de la región infrarroja (IR) (que son características de la estructura química) con el IR. base de datos. Vale la pena señalar algunas bandas IR características:bandas de quitosano (50-190 kDa, 75% de grado de desacetilación) a 1656 cm ⁻¹ , 1593 cm ⁻¹ y 1373 cm ⁻¹ corresponden a grupos amida (amidas I, II y III, respectivamente); la banda a 2895 cm ⁻¹ corresponde a los enlaces C-H, y los que están entre 3200 y 3500 cm ⁻¹ a enlaces N-H y O-H. Para el quitosano acilado, se obtuvieron bandas IR a 1651 cm ^-1 , 1591 cm ⁻¹ y 1369 cm ⁻¹ corresponden a los grupos amida (amidas I, II y III, respectivamente), y los que están dentro de 3200–3500 cm ⁻¹ corresponden a enlaces N-H y O-H. La acilación del quitosano se confirmó según los datos de la espectroscopia de infrarrojos [7]:la banda a 1591 cm ⁻¹ fue menor para el quitosano acilado en comparación con el quitosano nativo debido a un mayor número de amidas secundarias en el quitosano acilado. Bandas dentro de 3200–3500 cm ⁻¹ , característica de las vibraciones N-H y O-H en el quitosano nativo, desaparece para el quitosano acilado y el oligosacárido del quitosano debido a la reducción de amida primaria.

Espectros FT-IR de quitosano, acil-quitosano y oligosacárido de quitosano. Banda a 1591 cm ⁻¹ corresponde a amidas secundarias; 3200–3500 cm ⁻¹¹ regiones corresponden a vibraciones N-H y O-H

Se estimó el grado de sustitución del quitosano acilado, según Bahadur et. Alabama. [6], por la siguiente expresión:

$$ \% DS =\ left (\ left (\ frac {A_ {1651}} {A_ {3350}} \ right) -0.25 \ right) \ times 100 =75.16781 \% $$

donde A ₁₆₅₁ =1.973965 y A ₃₃₅₀ =1.977278 corresponden a la absorbancia (para la vibración de amida I y OH, respectivamente) del quitosano acilado a 1631 cm ⁻¹ y 3350 cm ⁻¹ , respectivamente, y el 0,25 corresponde a los grupos de aminas libres. Se obtuvo un grado de N-acilación del 75%.

ξ Potencial

Los valores de ξ-potencial se obtuvieron para cada compuesto de la siguiente manera (Tabla 2, columna “ξ-Potencial”):43.3 mV (CO-AuNPs), 40.2 mV (Acyl-CO-AuNPs), 52.2 mV (COS @ 1-AuNPs) , 55,3 mV (COS @ 2-AuNPs), 51,6 mV (COS @ 3-AuNPs) y 46,3 mV (COS @ 4-AuNPs). El potencial para todos los nanocompuestos fue positivo debido a los grupos amina del quitosano, ya que se planeó para lograr la formación del complejo de ADN por fuerzas electrostáticas. Después de la formación del complejo, la reducción de los valores de potencial ξ confirmó la adhesión exitosa del ADN (Tabla 2, columna “Potencial ξ / ADN”).

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

La Figura 6 muestra las micrografías TEM representativas para cada nanocompuesto, junto con histogramas de tamaño de nanopartículas para el cálculo de la distribución del tamaño. Las distribuciones de tamaño para cada nanocompuesto se obtuvieron de la siguiente manera:se obtuvieron tres imágenes TEM para cada muestra y se analizaron con un software de procesamiento de imágenes hecho en casa desarrollado con Matlab® y el recuento de nanopartículas fue 500 para Acyl-CO-AuNPs, 1000 para CO-AuNPs y 100 para la serie COS @ n-AuNP. El tamaño promedio de cada muestra se resume en la Tabla 2, columna "Diámetro TEM promedio (nm)". Cabe señalar que las AuNP sintetizadas con oligosacárido de quitosano resultaron esféricas, con una mejor distribución de tamaño en comparación con otras similares obtenidas con otras metodologías de síntesis verde reportadas en la literatura [36, 38, 41,42,43].

Micrografías TEM de a AuNP de quitosano acilado de 4,7 nm, b AuNP de quitosano de 3,5 nm (NaBH ₄ 0,1 M ), c AuNP de quitosano de oligosacárido de 7,4 nm (COS @ 1), d AuNP de quitosano de oligosacárido de 15,6 nm (COS @ 2), e AuNP de quitosano de oligosacárido de 10 nm (COS @ 3) y f AuNP de quitosano de oligosacárido de 14 nm (COS @ 4)

Grado de adhesión y formación compleja:Nanocomposite-pDNA

Se realizaron electroferogramas de todos los complejos de ADNp y ADN puro, tomando diferentes concentraciones del plásmido; los resultados se muestran en la Fig. 7. La Figura 7a muestra los electroferogramas correspondientes para el plásmido puro y todos los complejos transportados con 200 y 300 ng del plásmido. La distribución de muestras de nanocompuestos para estos electroferogramas es la siguiente:Acyl-CO-AuNPs (300 y 200 ng) en los carriles 1 y 2, CO-AuNPs (300 ng) en el carril 3, COS @ 1-AuNPs (300 y 200 ng) en 4 y 5, COS @ 2-AuNPs (300 y 200 ng) en 6 y 7, COS @ 3-AuNPs (300 y 200 ng) en 8 y 9, COS @ 4-AuNPs (300 y 200 ng) en 10 y 11, y 300 ng de pDNA puro en el carril 12. Para todas las pruebas, se utilizaron 10 µl de solución compleja. Esta figura muestra que solo el pDNA viaja en el gel (como se evidencia en el carril 12) y los otros complejos de pDNA permanecen en sus pocillos correspondientes, confirmando de esta manera la adhesión de pDNA en todos los complejos. Esto se debe a la interacción de las cargas positivas de los grupos amino del quitosano, que permanece en la superficie de la nanopartícula de oro, y las cargas negativas de los grupos fosfato de las hélices de ADN.

un Electroferogramas para nanocomplejos con concentraciones de pDNA de 200 y 300 ng. El carril 12 corresponde a pDNA puro. b CO-AuNP y Acil-CO-AuNP con 300 ng de pDNA, pDNA puro en el carril 3. c Nanocomplejo COS @ 2-AuNPs con 300 y 350 ng de ADN, 400 ng de ADNp puro en el carril 3. d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. Alabama. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). un HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

Disponibilidad de datos y materiales

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

Abreviaturas

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNPs:

Nanopartículas de oro

CO:

Chitosan

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

FTIR:

Infrarrojos por transformada de Fourier

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

Síntesis en un solo paso de carbonos mesoporosos hidrofílicos dopados con nitrógeno a partir del sistema triconstituyente a base de quitosano para la liberación de fármacos Fácil preparación in situ y actividad antibacteriana in vitro de micelas de copolímero que contienen plata a base de PDMAEMA