Nanopartículas compuestas a base de polidopamina con capas de polímero lábiles redox para una liberación controlada de fármacos y una terapia quimio-fototérmica mejorada

Imágenes TEM de nanopartículas PDA @ PMAA (barra de escala, 200 nm). un PDA. b [email protected]. c PDA @ PMAA-1. d PDA @ PMAA-2. e PDA @ PMAA-4. f PDA @ PMAA-6

Dado que MAA responde al pH, se puede inferir que las nanoesferas PDA @ PMAA también tienen sensibilidad al pH. Como se muestra en la Fig. 3, las nanopartículas PDA @ PMAA-1 se tomaron como ejemplo para investigar la dependencia del pH del tamaño hidrodinámico de las nanopartículas revestidas con PMAA. Puede verse que en tampón fosfato de pH 8.5, las nanopartículas de PDA @ PMAA-1 tienen un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 240 nm; mientras que en un ambiente ácido de pH 3.0, su tamaño hidrodinámico se redujo enormemente a ca. 150 nm. Debido a que las cadenas de polímero de PMAA están altamente ionizadas a pH alto, y la fuerte repulsión electrostática entre las cadenas de polímero resultó en un aumento del tamaño hidrodinámico, mientras que a pH bajo, el bajo grado de ionización de las cadenas de PMAA conduce a un encogimiento de tamaño [30]. Las nanopartículas de PDA @ PMAA sensibles al pH exhiben un gran potencial en la liberación controlada del fármaco en las células tumorales (pH inferior a 6,5) ya que el colapso de la capa de polímero similar a una esponja podría facilitar la liberación del fármaco. Las estructuras químicas de las nanopartículas PDA @ PMAA se caracterizaron mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Fig. 4). En los espectros de nanopartículas BAC y PDA @ PMAA, las bandas que aparecen a 1650 y 1550 cm ⁻¹ , que se atribuyen a las bandas típicas de amida I y II de BAC, demostraron que el reticulante BAC se había introducido con éxito en la nanopartícula compuesta [25]. El pico a 1706 cm ⁻¹ , que pertenece a la vibración de estiramiento de los grupos C =O en PMAA, se puede ver claramente en la nanopartícula PDA @ PMAA distinta de la nanopartícula PDA, lo que sugiere el recubrimiento exitoso de la capa PMAA.

Diámetro hidrodinámico de nanopartículas de PDA @ PMAA-1 en tampón de fosfato a varios pH

Espectros FTIR de reticuladores BAC, nanopartículas PDA y nanopartículas PDA @ PMAA (de arriba a abajo)

Efecto fototérmico de las nanopartículas PDA @ PMAA

La intensidad de absorbancia en la región NIR es el factor principal que determina la capacidad PTC de un agente PTC. Para explorar la capacidad de absorción de luz de las nanopartículas PDA @ PMAA, sus espectros UV-vis se resumen en la Fig. 5a. Se puede ver que cada muestra tiene una absorción obvia en la región NIR de 600 a 1000 nm. Comparado con PDA @ PMAA, PDA presenta la mayor absorción a 808 nm a una concentración de masa equivalente. La absorbancia de las nanopartículas de PDA @ PMAA aumentó con la disminución del grosor de la capa de PMAA (de PDA @ PMAA-6 a [email protected]). La fuerte absorción óptica en la región NIR nos animó a investigar más a fondo el efecto fototérmico de PDA @ PMAA. Como se muestra en la Fig. 5b, el efecto fototérmico de la dispersión acuosa de PDA y PDA @ PMAA se midió a la concentración de 100 μg mL ⁻¹ irradiado con un láser de 808 nm a 5 W cm ⁻² durante 300 s. Se utilizó agua pura como control negativo. La temperatura de dispersión de PDA se incrementó en 41 ^° C y superior a todas las muestras de PDA @ PMAA, lo que fue consistente con su máxima absorción a 808 nm. La temperatura aumentada por las dispersiones de PDA @ PMAA podría alcanzar de 17 a 33 ^° C con la disminución del grosor del caparazón de PMAA (de PDA @ PMAA-6 a [email protected]), mucho más alta que la causada por el control de agua pura (solo llega a 3.5 ^° C). Estudios anteriores sugirieron que la terapia térmica con una temperatura superior a 55 ^° C mostró grandes ventajas en la ablación térmica de tumores sólidos [31]. Comparando el aumento máximo de temperatura de una serie de nanopartículas PDA @ PMAA, solo [email protected] (58 ^° C) y PDA @ PMAA-1 (56 ^° C) puede alcanzar hasta 55 ^° C. Considerando que el caparazón de PMAA debe tener un cierto grosor para garantizar su capacidad de carga de fármaco, se eligió PDA @ PMAA-1 como representativo en los siguientes experimentos.

un Espectros UV-vis de PDA y PDA @ PMAA en dispersión acuosa a una concentración de 100 μg mL ⁻¹ . b Efecto fototérmico de la dispersión acuosa de PDA y PDA @ PMAA a una concentración de 100 μg mL ⁻¹ se midieron mediante irradiación láser ( λ =808 nm, 5 W cm ⁻² )

Liberación de fármacos in vitro

Se eligió la doxorrubicina (DOX) como fármaco modelo para confirmar la capacidad potencial de las nanopartículas compuestas PDA @ PMAA-1 para liberar el fármaco encapsulado en condiciones reductoras. La carga de DOX en nanopartículas compuestas se realizó con un contenido teórico de carga de fármaco de 9,1% en peso y una concentración de polímero de 10 mg mL ⁻¹ , y el contenido final de carga de fármaco y la eficiencia de encapsulación fue de 5,1% y 53,7%, respectivamente. Indicó que DOX se puede cargar de manera eficiente en la red de polímeros. También se prepararon nanopartículas de PDA cargadas con DOX para comparación, cuyo contenido de carga de DOX fue del 3,7%. La mayor capacidad de carga de fármaco de las nanopartículas PDA @ PMAA-1 puede atribuirse a la fuerte interacción electrostática entre el grupo amino de las moléculas DOX y los grupos carboxilo de las cadenas PMAA [25]. En vista de eso, el caparazón de PMAA tiene enlaces disulfuro escindibles redox, los medicamentos precargados se activarán para liberar de manera eficiente los medicamentos precargados en condiciones reductoras. Teniendo en cuenta el microambiente tumoral ligeramente ácido y la gran diferencia en la concentración de GSH entre intracelular (1–10 mM) y plasma (20–40 μM), los experimentos de liberación de fármacos in vitro se diseñaron y realizaron utilizando tampones de fosfato de pH 7,4 y 5,5. con o sin GSH 10 mM para imitar las células tumorales y el entorno del torrente sanguíneo [23, 32, 33]. Como se muestra en la Fig. 6, la cantidad liberada de fármaco es solo del 10,8% durante un período de 24 h, lo que sugiere que DOX se mantuvo estable en las nanopartículas PDA @ PMAA-1 cuando se dispersaron en condiciones fisiológicas. En presencia de GSH 10 mM, se detectó una liberación notablemente rápida del fármaco, donde la liberación acumulada de DOX fue de aproximadamente 72,8% en 24 h, debido a la degradación de las capas de PMAA unidas por disulfuro en un entorno reductor. Sin embargo, la estructura del núcleo de PDA mantiene la integridad después de la degradación de respuesta redox (archivo adicional 1:Figura S2). Además, se observó una liberación explosiva (aproximadamente 87% en 24 h) de DOX en tampones de fosfato de pH 5,5 con GSH 10 mM, debido a que los grupos carboxilo en PMAA estaban protonados en condiciones ácidas, lo que provocó además el colapso del polímero. redes. Estos perfiles de liberación implicaron la característica prometedora de las nanopartículas PDA @ PMAA para la liberación controlada de fármacos, ya que las nanopartículas exhiben una baja fuga de fármacos en el plasma, sin embargo, liberan fármacos rápidamente cuando ingresan a las células tumorales. Además, se detectó una liberación lenta del fármaco (aproximadamente 13% en 24 h) para nanopartículas de PDA @ PMAA cargadas con DOX con irradiación NIR en tampones de fosfato de pH 7,4, lo que indica que las nanopartículas de PDA @ PMAA mantienen la integridad estructural tras la irradiación. El comportamiento de liberación de las nanopartículas de PDA en presencia de GSH 10 mM mostró una liberación notablemente baja de fármacos (ca. 30% en 24 h) en comparación con las nanopartículas de PDA @ PMAA-1 (archivo adicional 1:Figura S1). La enorme diferencia en los comportamientos de liberación de las nanopartículas de PDA y PDA @ PMAA sugirió que la introducción de una capa de polímero degradable reticulada por un enlace disulfuro dio lugar a la liberación efectiva de fármacos activada por Redox.

Perfiles de liberación DOX de nanopartículas PDA @ PMAA-1 a 37 ^° C en tampón fosfato 7,4 (○), en tampón fosfato 7,4 con irradiación láser NIR (□, en tampón fosfato 7,4 con GSH 10 mM (círculo rojo) o en tampón fosfato 5,5 con GSH 10 mM (círculo verde)

Ensayos celulares

La investigación de la captación celular y la liberación intracelular del fármaco de nanopartículas de PDA @ PMAA cargadas con DOX se realizó además contra la línea celular A549. Como se muestra en la Fig. 7, se puede observar fluorescencia roja para DOX en el citoplasma celular después de 1 h de incubación, lo que indica una internalización rápida de nanopartículas contra células tumorales. Después de 4 h de incubación, se observó una fuerte fluorescencia roja en todo el citoplasma y el núcleo de la célula. Sugirió que las células endocitaron más nanopartículas y liberaron DOX de manera eficiente a través de la degradación de las capas de polímero en el entorno reductor de las células tumorales.

Imágenes CLSM de células A549 cultivadas con nanopartículas PDA @ PMAA cargadas con DOX para ( a ) 1 hy ( b ) 4 h. En cada fila, las imágenes de microscopía de contraste de interferencia diferencial, las imágenes de fluorescencia y las imágenes de superposición se mostraron de izquierda a derecha, respectivamente. (barra de escala, 50 μm)

Para evaluar la biocompatibilidad de PDA @ PMAA, se eligió una célula normal típica (células HEK-293T) para la prueba de viabilidad celular mediante ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 8, no se detectó citotoxicidad obvia de nanopartículas de PDA @ PMAA-1 en blanco en un amplio rango de concentración de 0,1 a 100 μg mL ⁻¹ , lo que indica la buena biocompatibilidad de las nanopartículas PDA @ PMAA-1 lo que asegura su aplicación en el área biomédica. A continuación, se midió la viabilidad celular contra las células A549 (células tumorales) en función de la concentración de incubación de nanopartículas de PDA @ PMAA-1 en blanco o cargadas con DOX, y cada grupo se subdividió en grupos con o sin exposición al láser NIR (Fig.9 ). Casi no se observó ningún efecto sobre la viabilidad celular para el grupo PDA @ PMAA-1 en blanco sin láser, lo que indica que las nanopartículas compuestas en blanco no tienen citotoxicidad. Después de 5 W cm ⁻² Irradiación con láser NIR durante 300 s, la viabilidad celular para el grupo PDA @ PMAA-1 en blanco disminuyó obviamente, y ~ 54,3% de las células murieron a una concentración de 100 μg mL ⁻¹ . Los resultados implicaron que estas nanopartículas de PDA @ PMAA-1 eran citotóxicas contra las células A549 mediante irradiación NIR que inducía hipertermia. En cuanto a los grupos cargados con DOX, las nanopartículas de PDA @ PMAA-1 cargadas con DOX muestran una disminución de la viabilidad celular de una manera sensible a la dosis, que tienen una eficacia similar a la DOX libre, lo que indica una liberación completa de los fármacos del PMAA reticulado con enlaces disulfuro. conchas. Para las células tratadas con nanopartículas de PDA @ PMAA-1 cargadas con DOX con exposición al láser NIR, la viabilidad celular muestra una disminución más profunda en comparación con el grupo sin irradiación, especialmente a una dosis alta de fármaco. Por ejemplo, cuando las células se trataron con 100 μg mL ⁻¹ PDA cargado con DOX @ PMAA-1 (que contiene 5 μg mL ⁻¹ DOX), la viabilidad celular se redujo a aproximadamente el 15,7%, que fue mucho menor que el tratamiento fototérmico (~ 54,3%) o quimioterapia (~ 38,1%) solo con la misma dosis de nanopartículas. En particular, el 50% de inhibición celular (IC ₅₀ ) El valor de PDA cargado con DOX @ PMAA-1 con una exposición a láser NIR a corto plazo se determinó en 2 μg mL ⁻¹ , que fue mucho más bajo que el de DOX libre (6,3 μg mL ⁻¹ ). Sugiere que la terapia quimio-fototérmica de nanopartículas de PDA @ PMAA cargadas con DOX demostró un efecto sinérgico, que puede atribuirse a la mayor citotoxicidad de DOX a temperaturas más altas [34, 35]. Por el contrario, el grupo de láser DOX libre con NIR no muestra un efecto sinérgico similar ya que no hay hipertermia local causada por la irradiación con láser NIR. Las imágenes de fluorescencia de células teñidas con calceína-AM (células verdes, vivas) después del tratamiento muestran que el número de células vivas tratadas con nanopartículas de PDA @ PMAA cargadas con DOX tras la irradiación con láser NIR fue significativamente menor que en otros grupos, lo que confirmó aún más el antitumoral sinérgico. efecto de nanopartículas de PDA @ PMAA cargadas con DOX con irradiación de luz NIR (Fig. 10). Beneficiándose del efecto sinérgico positivo del tratamiento combinado quimio-fototérmico, permite una dosis más baja del fármaco citotóxico para lograr el mismo efecto de destrucción del tumor, evitando así los efectos secundarios graves en los tejidos normales a dosis altas del fármaco. En conjunto, los datos anteriores sugieren que estas nanopartículas PDA @ PMAA pueden liberar fármacos de forma eficaz en condiciones de reducción intracelular y mostrar un efecto sinérgico de destrucción de células tumorales para la terapia quimio-fototérmica combinada, que demostró su gran potencial para el tratamiento del cáncer.

Viabilidad celular de las células HEK-293 expuestas a nanopartículas de PDA @ PMAA-1 en blanco durante 24 h

Viabilidad celular de las células A549 tratadas con nanopartículas libres de DOX, PDA @ PMAA-1 y nanopartículas de PDA @ PMAA-1 cargadas con DOX en diversas concentraciones sin o con irradiación láser NIR ( λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) durante 300 s

Imágenes de fluorescencia confocal de células A549 vivas tratadas con PBS, nanopartículas PDA @ PMAA-1, nanopartículas PDA @ PMAA-1 cargadas con DOX y DOX libre con o sin irradiación láser NIR ( λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) durante 300 s. Las células vivas se tiñeron con Calceína-AM (verde). La barra de escala es de 50 μm

Conclusión

Las nanopartículas compuestas multifuncionales de núcleo-carcasa PDA @ PMAA se sintetizaron revistiendo una capa de PMAA reticulada con disulfuro sobre nanopartículas de PDA mediante polimerización por destilación-precipitación. Las nanopartículas compuestas exhibieron un excelente efecto de conversión fototérmica y una degradación lábil redox de la capa de PMAA. Para una muestra típica de PDA @ PDA @ PMAA-1, la temperatura de las dispersiones de PDA @ PMAA se incrementó en 31 ^° C a la concentración de 100 μg mL ⁻¹ irradiado con un láser de 808 nm a 5 W cm ⁻² durante 300 s. The DOX-loaded PDA@PMAA-1 nanoparticles were stable under the physiological environment with low leakage of DOX (10.8% in 24 h), while a rapid and full release of DOX was triggered in the reducing and weakening acidic condition (pH5.5 + 10 mM GSH). The cell viability of A549 cells treated with PDA@PMAA-1 nanoparticles under NIR irradiation was reduced significantly to about 15.7% at relatively low equivalent drug concentration (5 μg mL ⁻¹ ), which was much lower than photothermal (~ 54.3%) or chemotherapy (~ 38.1%) treatment alone under the same dose of nanoparticles and drugs. So the DOX-loaded composite nanoparticles realized a synergistic inhibition effect against cancer cells by the combination of photothermal therapy and traditional chemotherapy. This work demonstrated the feasibility of such composite nanoparticles to be a powerful platform for controlled drug delivery and could be exploited as combined chemo-photothermal therapy with improved therapeutic efficacy.

Disponibilidad de datos y materiales

The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on request.

Abreviaturas

AIBN:

2,2-Azobisisobutyronitrile

BAC:

N,N' -bis(acryloyl)cystamine

DA-HCl:

Dopamine hydrochloride

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DOX:

Doxorubicin

FBS:

Suero fetal bovino

FT-IR:

Infrarrojos por transformada de Fourier

GSH:

Glutathione

MAA:

Methacrylic acid

NIR:

Infrarrojo cercano

PDA:

Polidopamina

PMAA:

Poly(methacrylic acid)

PTC:

Photothermal conversion agents

PTT:

Terapia fototérmica

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

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