Síntesis y estudio in vitro de una sonda de modo dual que apunta a la integridad αvβ3

Resumen

Los tumores malignos constituyen una enfermedad grave que amenaza la vida humana, y el diagnóstico temprano y la predicción de metástasis son fundamentales para la elección del plan de tratamiento y el momento del tratamiento. Integrina α _v β ₃ , que ha recibido una amplia atención como marcador molecular de la neovasculatura del tumor, es un objetivo importante para el seguimiento de la tumorigénesis y la progresión en la investigación de imágenes moleculares. Este estudio informa sobre una sonda molecular de modo dual de resonancia magnética (MR) / fluorescencia, cRGD-Gd-Cy5.5, que se dirige a la integrina α _v β ₃ receptor y utiliza liposomas como portador. La nanosensda obtenida tenía un tamaño de 60,08 ± 0,45 nm, con buena dispersión en agua, una distribución uniforme de tamaños, estabilidad deseable y alta relajación. Su tasa de relajación r1 fue 10,515 mM ⁻¹ s ⁻¹ , mucho más alto que el de otros quelatos de Gd en uso clínico. La sonda no mostró citotoxicidad a las concentraciones probadas in vitro, y su capacidad para apuntar a células A549 y células SUNE-1-5-8F se evaluó preliminarmente mediante imágenes de fluorescencia in vitro y resonancia magnética. Los resultados demostraron que la nanosonda cRGD-Gd-Cy5.5 tenía buenas características, mostrando una estabilidad y bioseguridad deseables, una alta tasa de relajación de T1 y una fuerte focalización y unión a tumores con alta expresión de integrina α _v β ₃ . Por lo tanto, cRGD-Gd-Cy5.5 es un agente prometedor para el control visual de la metástasis tumoral.

Antecedentes

La infiltración de tumores malignos y las metástasis a distancia constituyen la principal causa de fracaso del tratamiento. El proceso de metástasis de tumores malignos requiere la destrucción de la matriz extracelular (MEC) y la neovasculatura del tumor [1]. Por tanto, la monitorización no invasiva in vitro de marcadores moleculares relacionados con la neovascularización tumoral es especialmente crucial en la predicción de metástasis tumorales y el diagnóstico precoz. Integrina α _v β ₃ , un marcador molecular de la neovasculatura tumoral ampliamente estudiado, ha recibido una gran atención. Esta integrina está estrechamente asociada con la adhesión, proliferación y diferenciación de las células endoteliales vasculares durante la neovascularización del tumor [2].

El progreso en la obtención de imágenes moleculares ha permitido la monitorización no invasiva del crecimiento tumoral a nivel molecular. Los estudios de formación de imágenes moleculares de las moléculas diana de interés deben tener dos elementos básicos:(1) componentes de dirección adecuados y (2) componentes de señal que pueden detectarse mediante técnicas de formación de imágenes. Integrina α _v β ₃ , que reconoce específicamente y se une a la secuencia de arginina-glicina-aspartato (Arg-Gly-Asp, RGD) en las proteínas ECM, se activa a través de cambios conformacionales. Por tanto, la secuencia RGD se ha utilizado ampliamente en la síntesis de trazadores dirigidos a tumores como un componente importante de dirección [3]. La resonancia magnética (RM) se ha convertido en una de las herramientas de diagnóstico por imágenes moleculares más poderosas para la monitorización de tumores debido a su radiación no ionizante, alta resolución de tejidos blandos y profundidad de penetración no limitante [4, 5]. El análisis estadístico indicó que aproximadamente el 50% de los exámenes por RM requieren el uso de agentes de contraste para mejorar la calidad de las imágenes [6, 7]. Las imágenes de fluorescencia del infrarrojo cercano son un tipo de imagen óptica, y la longitud de onda de la luz del infrarrojo cercano, que es la luz no visible más temprana descubierta, varía entre 700 y 900 nm. Las técnicas de obtención de imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano permiten a los cirujanos visualizar, delinear y resecar tumores durante las cirugías [8, 9]. Sin embargo, con los cambios en el espectro de enfermedades humanas, las imágenes moleculares monomodo no cumplen con los requisitos del diagnóstico de precisión debido a sus altas tasas de falsos positivos y falsos negativos. Por tanto, las técnicas de imagenología molecular basadas en la integración de múltiples modos serán una nueva tendencia en el desarrollo de la imagenología molecular [10].

En este estudio, preparamos una sonda molecular de modo dual cRGD-Gd-Cy5.5 que se puede utilizar en la obtención de imágenes histológicas y funcionales de tumores (esquema 1). Comparado con las sondas moleculares con Fe ₃ O ₄ como la unidad de señal [11, 12], cRGD-Gd-Cy5.5 fue sobresaliente con (a) un alto paramagnetismo (siete electrones no apareados alrededor de Gd ^{3 +} ); (b) capacidad para unirse con el portador para formar un agente quelante estable, tal como Magnevist ampliamente utilizado en la clínica; (c) alta resolución espacial y mayor definición de imagen que los agentes de contraste negativos [13, 14]. Seleccionamos liposomas como la molécula portadora que une el agente de contraste de RM con el agente de contraste de fluorescencia. Los fosfolípidos comunes tienen dos largas cadenas de hidrocarburos hidrófobos y un grupo hidrófilo en sus estructuras moleculares. Cuando se agregan al agua o solución tampón, cantidades apropiadas de moléculas de fosfolípidos adoptan disposiciones en direcciones específicas, con sus grupos hidrófilos enfrentados a la fase acuosa en ambos lados y las cadenas de hidrocarburos hidrófobos enfrentados entre sí para formar la bicapa en los liposomas. Los péptidos cíclicos dirigidos a RGD y las moléculas fluorescentes Cy5.5 se conjugaron a la superficie del liposoma a través de un fosfolípido de polietilenglicol (PEG) introducido con grupos amino y, finalmente, los iones Gd se encapsularon en los liposomas para lograr la construcción de la sonda molecular multimodal dirigida. con características deseables en términos de estructura, composición, tamaño, forma, estabilidad y relajación MR. Su citocompatibilidad se evaluó mediante un ensayo de citotoxicidad y observación de la morfología celular. Finalmente, se evaluó el potencial de cRGD-Gd-Cy5.5 para imágenes de resonancia magnética ponderada en T1 y de imágenes de fluorescencia de células cancerosas in vitro.

La ruta sintética de los liposomas dopados con Gd, seguida de la conjugación de RGD y Cy5.5 para bioaplicaciones, para la detección altamente sensible de la integrina α _v β ₃

Resultados

Caracterización de la nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5

La solución de cRGD-Gd-Cy5.5 era un líquido transparente de color rosa pálido, sin precipitación obvia después de un tiempo de reposo, lo que indica una buena dispersión. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló la apariencia del complejo liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 como una forma esférica de tamaño uniforme, sin agregación de gránulos ni daño después de la tinción negativa con fosfotungstato de sodio al 2%, como se muestra en la Fig. 1a. La distribución del tamaño de partícula fue consistente, variando de 50 a 80 nm, con un tamaño de partícula promedio de 60,08 ± 0,45 nm. El tamaño de partícula hidratada del complejo liposómico cRGD-Gd-Cy5.5 medido mediante dispersión dinámica de luz (DLS) fue 124,2 ± 0,215 nm (Fig. 1b). Como se muestra en la figura, las nanopartículas exhibieron una distribución de tamaño estrecha en agua y una buena dispersión. El potencial zeta de la superficie fue 39,5 ± 1,65 mV, mostrando una carga superficial positiva, lo cual es consistente con la presencia de grupos amino en la superficie (Fig. 1c).

Datos de caracterización de la nanoonda CRGD-GD-CY5.5. un Imágenes TEM de bajo aumento de cRGD-Gd-Cy5.5. b El tamaño de partícula se detectó mediante análisis de tamaño y el tamaño medio de la sonda fue de 124,2 nm. c El potencial zeta es de aproximadamente 39,5 mV, la superficie aparente es electropositiva

El ensayo de microplaca multifuncional mostró que los liposomas en blanco no tienen región de absorción de UV y los liposomas acoplados con Cy5.5 fluorescente en luz de excitación de 600 nm tienen un pico de absorción obvio a 685 nm (Fig. 1a), consistente con la longitud de onda de emisión de Cy5.5 fluorescente . Las moléculas fluorescentes mostraron que Cy5.5 se acopló con éxito. Los resultados del sistema de imágenes de fluorescencia de animales pequeños mostraron que bajo la luz de excitación de 600 nm, el Cy5.5 fluorescente conjugado con liposomas tenía una fluorescencia roja obvia, mientras que el liposoma en blanco no tenía señal de fluorescencia (Fig. 2b).

Propiedades de fluorescencia de la nanoonda cRGD-Gd-Cy5.5. un El liposoma marcado con fluorescencia Cy5.5 se detectó mediante un analizador de enzimas multifuncional y hubo un pico de emisión visible a 670 nm a una luz de excitación de 600 nm. b Bajo luz de excitación de 600 nm, el Cy5.5 fluorescente acoplado a liposomas (izquierda) tiene una luminiscencia obvia, mientras que el liposoma en blanco (derecha) no tiene imágenes de fluorescencia

Relaxometría de RM de la nanoonda cRGD-Gd-Cy5.5

La tasa de relajación r1 es un parámetro importante para evaluar el rendimiento de imagen de los agentes de contraste T1 MR. Por lo tanto, medimos el tiempo de relajación T1 de la sonda cRGD-Gd-Cy5.5 con diferentes concentraciones de Gd. Como se muestra en la Fig. 3b, la tasa de relajación r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 fue 10.515 mM ⁻¹ s ⁻¹ después del ajuste lineal, mucho más alto que el del producto clínico Magnevist (4,56 mM ⁻¹ s ⁻¹ ). La alta tasa de relajación de r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 puede ser el resultado de la estructura espacial especial de los liposomas portadores y el efecto de amplificación de la señal biológica de los liposomas. A medida que aumentaba la concentración de Gd, cRGD-Gd-Cy5.5 mejoraba la intensidad de la señal de RM (Fig. 3a). Estos resultados demostraron que el cRGD-Gd-Cy5.5 sintético satisface las necesidades de alto contraste de imagen en la resonancia magnética.

Las propiedades de relajación de las nanoprobes cRGD-Gd-Cy5.5. un T1 - imágenes ponderadas (Siemens, Verio, 3.0T, MOLLI, secuencia:TR =5.8 ms, TE =3.66 ms, TI =16–3200 ms) de estas partículas a diferentes concentraciones (Gd). b Las curvas de ajuste de concentración de Gd y tiempo de relajación; el valor r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 fue 10.515 mM ⁻¹ s ⁻¹

Estudio de citotoxicidad de la nanoonda cRGD-Gd-Cy5.5

La citotoxicidad in vitro de cRGD-Gd-Cy5.5 se evaluó mediante el ensayo CCK-8, en comparación con la viabilidad de las células en el grupo no tratado (100%). Todas las células mostraron una viabilidad celular superior al 70% dentro del rango de concentraciones de Gd probadas (50-400 μM) (Fig. 4), lo que indica que esta sonda molecular tiene una buena compatibilidad celular. En particular, la viabilidad celular fue aún superior al 70% incluso después de 24 h de incubación con Gd 400 μM, una concentración sustancialmente más alta que las dosis utilizadas in vitro e in vivo.

Ensayo de citotoxicidad. Viabilidad celular de adenocarcinoma de pulmón humano (A549), línea celular de carcinoma nasofaríngeo (SUNE-1-5-8F), célula endotelial de vena umbilical humana (HUVEC) y línea celular normal de mama (MCF10A) incubadas con diferentes concentraciones de cRGD-Gd- Cy5.5 durante 24 h

Ensayo de citometría de flujo y tinción por inmunofluorescencia de integrina αvβ3

Los resultados de la inmunofluorescencia mostraron que la expresión de la integrina αvβ3 en las células A549 y 5-8F se localizó en la membrana celular y el citoplasma. La integrina de las células A549 se localizó principalmente en la membrana celular y la intensidad de fluorescencia en la superficie de las células A549 fue mayor que la de las células SUNE-1-5-8F. La intensidad de fluorescencia de las células MCF-10A fue extremadamente débil, lo que demuestra que casi no se expresaba integrina αvβ3 en la superficie de las células epiteliales mamarias (Fig. 5a). Los resultados de la citometría de flujo se muestran en la Fig. 5c. Los niveles de expresión de la integrina αvβ3 se clasifican de la siguiente manera:A549 (89,07%)> SUNE-1-5-8F (63,84%)> MCF-10A (1,56%), lo que indica que los niveles de αvβ3 en las células cancerosas eran significativamente más altos que los de las células mamarias normales. células de la glándula.

Imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) de células A549, SUNE-1-5-8F y MCF-10A. un Imágenes de inmunofluorescencia celular de la integrina αvβ3. Línea celular A549 y SUNE-1-5-8F expresada en la membrana celular, células MCF-10A casi sin expresión de integrina α _v β ₃ . b Células A549, SUNE-1-5-8F y MCF10A incubadas con cRGD-Gd-Cy5.5 a 200 μg mL ⁻¹ concentración a 37 ° C durante 1 h. La cantidad de sondas unidas a las células concuerda con los resultados de la inmunofluorescencia celular. c Ensayo de citometría de flujo para detectar las expresiones de la integrina αvβ3 en las células A549, SUNE-1-5-8F y MCF-10A

Captación celular de cRGD-Gd-Cy5.5

Con base en los resultados de la tinción por inmunofluorescencia, se utilizaron células A549 y 5-8F incubadas con cRGD-Gd-Cy5.5 como grupos experimentales, mientras que las células MCF-10A incubadas con cRGD-Gd-Cy5.5 se utilizaron como grupos experimentales. grupo de control. Después de la incubación con cRGD-Gd-Cy5.5, se observaron señales de fluorescencia roja en la membrana de las células A549 y 5-8F, con una intensidad de señal en las células A549 más alta que en las células SUNE-1-5-8F (Fig. 5b). Este resultado es consistente con la expresión de la integrina αvβ3 detectada por tinción por inmunofluorescencia. Casi no se encontró señal de fluorescencia roja en la membrana de las células MCF-10A en el grupo de control.

Imágenes de resonancia magnética e imágenes de fluorescencia in vitro

Basado en su alta tasa de relajación de r1 y buena compatibilidad celular, se utilizó cRGD-Gd-Cy5.5 como agente de contraste positivo para la obtención de imágenes por resonancia magnética de células cancerosas in vitro. Como se muestra en la Fig. 6a, b, el color de las imágenes de RM ponderadas en T1 se volvió gradualmente más brillante, lo que indica que la intensidad de la señal de RM de las células A549 tratadas con cRGD-Gd-Cy5.5 aumentó con concentraciones más altas de Gd. La diferencia en el tiempo de relajación T1 entre los dos grupos fue estadísticamente significativa, como lo indica la t prueba para dos muestras independientes ( p <0,05). Estos datos sugieren que el cRGD-Gd-Cy5.5 sintético tiene el potencial de usarse como un agente de contraste positivo en la resonancia magnética in vitro de células cancerosas. De manera similar, un sistema de fluorescencia de animales pequeños mostró un aumento correspondiente en la intensidad de la fluorescencia a medida que aumentaba la concentración de la sonda (Fig. 6c). A partir de la señal de imagen y los datos específicos, el efecto de imagen del grupo objetivo (cRGD-Gd-Cy5.5) fue mejor que el del grupo sin objetivo (Gd-Cy5.5).

Imágenes de fluorescencia y resonancia magnética celular. un Las células se incubaron con células A549 durante 2 h según las concentraciones de Gd:0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04 y 0,08 (mM). El Gd-Cy5.5 se utilizó como grupo de control. b Tiempo de relajación T1 de la imagen de resonancia magnética correspondiente. c Imágenes del sistema de imágenes en vivo de pequeños animales

In Vivo MR e imágenes de fluorescencia

Las imágenes de resonancia magnética adquiridas antes de la inyección de los agentes de contraste no mostraron diferencias de señal significativas entre los tumores y otros órganos / tejidos periféricos. A los 5 minutos después de la inyección con CRGD-Gd-Cy5.5, la intensidad de la señal en los sitios del tumor comenzó a fortalecerse, pero se mantuvo una hiperintensidad estable desde 6 horas después de la inyección. En el grupo de prueba, se observó un parénquima tumoral intensificado desde los 30 min y el refuerzo se intensificó a las 2 h (Fig. 7a). En el grupo de receptor bloqueado, sin embargo, solo se encontró un refuerzo suave en los márgenes de los tumores, y el grado de refuerzo se debilitó a las 2 hy ya desapareció (Fig. 7a). En las imágenes de fluorescencia, la intensidad de la fluorescencia en el grupo objetivo aumentó gradualmente desde el minuto 30, pero aún era alta en la sexta hora (Fig.7b), lo que indica que la circulación sanguínea se extendió y CRGD-Gd-Cy5.5 se concentró eficientemente en Tumores. En el grupo de receptor bloqueado, no se observó concentración de sonda específica en ninguno de los puntos de tiempo probados. Se observó fluorescencia de alta intensidad en el riñón bilateral a la sexta hora (Fig. 7b). Deducimos que la vía metabólica de CRGD-Gd-Cy5.5 puede ser el aclaramiento a través del sistema renal.

Imágenes de resonancia magnética y fluorescencia de modelos tumorales de xenoinjerto subcutáneo de carcinoma nasofaríngeo de ratones desnudos. un Se anestesiaron ratones desnudos y se obtuvieron imágenes con un escáner de resonancia magnética de 3.0 T en la preinyección y a las 0.5, 2 y 6 h después de la inyección. b Se anestesiaron ratones desnudos y se tomaron imágenes con un sistema de imágenes de fluorescencia a las 0,5, 2 y 6 h después de la inyección

Discusión

La integrina αvβ3 está altamente expresada no solo en las células endoteliales de la neovasculatura del tumor sino también en la superficie de una variedad de células tumorales, como melanoma maligno, glioma maligno, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y células de cáncer de mama [15], mientras que αvβ3 no se expresa ni se expresa a niveles bajos en células epiteliales regulares y células endoteliales vasculares maduras. Sobre la base de las propiedades anteriores, la integrina αvβ3 se ha convertido en un objetivo ideal para el seguimiento in vivo de la metástasis tumoral [16]. Sin embargo, los métodos actuales para medir los niveles de expresión de la integrina αvβ3 todavía tienen problemas de no invasividad, repetibilidad y oportunidad de obtención de imágenes, que quedan por resolver. En vista de los problemas objetivos anteriores, en este estudio se sintetizó una sonda molecular de modo dual para el monitoreo dinámico en tiempo real de la expresión de la integrina αvβ3, que indirectamente logró el objetivo de predecir y monitorear la metástasis tumoral.

Los agentes de contraste se pueden dividir en dos tipos según el mecanismo de la resonancia magnética:compuestos de Gd (agente de contraste T1 positivo) y nanopartículas de óxido de hierro paramagnéticas (agente de contraste T2 negativo). En comparación con otros agentes de contraste, los compuestos de Gd tienen ventajas incomparables en la práctica clínica [17]. El ion Gd, que es un material superparamagnético, proporciona una señal de alta intensidad en imágenes ponderadas en T1. Gd también puede unirse a una variedad de sustancias para formar complejos estables con una alta resolución espacial y una alta relación señal / ruido. Sin embargo, cada tipo de agente de contraste tiene sus propias limitaciones (a saber, el corto tiempo de circulación sanguínea de los agentes de contraste T1 y los artefactos de susceptibilidad magnética de los agentes de contraste T2) [18,19,20,21]. Los compuestos tradicionales de Gd tienen las siguientes limitaciones. (1) Los quelatos tradicionales de Gd no tienen efecto de focalización. (2) La intensidad de la señal de los agentes de contraste de quelato de Gd es menor que la de las partículas de óxido de hierro superparamagnéticas ultrapequeñas (USPIO) a la misma concentración. Para resolver los problemas anteriores, los iones de Gd se vinculan a estructuras macromoleculares (como liposomas, moléculas dendríticas y dextrano) para mejorar el efecto de relajación de T1 [22], y luego el complejo se vincula al ligando de los objetivos tumorales para preparar sondas moleculares. y lograr imágenes dirigidas al tumor [23]. En este estudio, se seleccionaron liposomas como la molécula portadora que une los agentes de contraste de RM con los agentes de contraste fluorescentes. La estructura espacial especial de los liposomas tiene un efecto de amplificación de la señal biológica y mejora eficazmente la concentración de iones Gd en los tejidos locales, aumentando así la intensidad de la señal de RM. Zhou y col. [24] empleó nanopartículas de silsesquioxano oligomérico poliédrico unidas a β-ciclodextrina (POSS) como portador para acoplar RGD a compuestos Gd para obtener con éxito una sonda molecular, cRGD-POSS-βCD- (DOTA-Gd), con una tasa de relajación T1 de 9,50 mM ⁻¹ S ⁻¹ . Se encontró que el complejo liposoma-cRGD-Gd-Cy5 obtenido en este estudio tenía una tasa de relajación T1 de 10.515 mM ⁻¹ S ⁻¹ , que es más del doble de la tasa de relajación T1 del agente Gd actualmente en uso clínico (Magnevist), y este complejo también exhibió excelentes propiedades de imagen por resonancia magnética.

La nano sonda preparada por nuestro grupo tiene un tamaño uniforme, una apariencia regular y una buena dispersabilidad. El potencial zeta refleja la estabilidad de la sonda molecular, y un valor positivo o negativo más alto del potencial zeta se asocia con un sistema más estable y menos posibilidad de agregación. En general, se considera que las moléculas con potenciales zeta superiores a + 30 mV o inferiores a -30 mV tienen una buena estabilidad. El potencial zeta en la superficie de la partícula sonda obtenida en este estudio fue + 39,5 ± 1,65 mV, que es ligeramente inferior a + 30 mV. Sin embargo, no se observó agregación bajo TEM.

Los agentes Gd son el medio de contraste de RM más utilizado en la práctica clínica actual y no se puede ignorar su bioseguridad. Guo y col. [25] encontró que un complejo de Gd acoplado a ácido hialurónico dendrítico era una micropartícula muy segura y eficaz como agente de contraste de RM, con una alta sensibilidad y una baja presencia residual en el cuerpo humano. Mediante el estudio de la citotoxicidad in vitro de la sonda molecular construida, se demostró que esta sonda molecular tiene baja citotoxicidad y alta bioseguridad tanto para células tumorales como para células no tumorales (células epiteliales y células endoteliales vasculares). Creemos que los liposomas tienen una buena biocompatibilidad y la baja biotoxicidad puede ser un beneficio del liposoma que encapsula los iones Gd.

Basado en estudios previos [26,27,28], nuestro grupo seleccionó la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 con alta expresión de integrina αvβ3 para su uso en el grupo experimental, con la innovadora adición de la célula de carcinoma nasofaríngeo SUNE-1-5-8F línea en los experimentos de direccionamiento celular in vitro; Las células epiteliales mamarias con casi ninguna expresión de integrina αvβ3 se incluyeron como grupo de control negativo. La sonda molecular se unió bien a la membrana celular de las células de adenocarcinoma de pulmón A549 y las células de carcinoma nasofaríngeo SUNE-1-5-8F, pero no se unió a las células MCF-10A, lo que indica que la sonda tiene una excelente capacidad de direccionamiento molecular, que fue confirmado por los resultados del ensayo de inmunofluorescencia. Los resultados de la resonancia magnética confirmaron además la propiedad de dirección de la sonda molecular liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 en la RM, con señales de mayor intensidad que las del agente de contraste no dirigido (Gd-Cy5.5) en las células tumorales. Los experimentos in vivo confirman que las sondas pueden mantenerse estables en el suero y apuntar persistentemente a los sitios del tumor durante al menos 6 h. Los resultados de los estudios in vitro garantizan estudios in vivo posteriores de la sonda molecular en un modelo metastásico de carcinoma nasofaríngeo en ratones desnudos.

Conclusiones

En resumen, el método de preparación para la sonda de modo dual cRGD-Gd-Cy5.5 que se dirige a la integrina αvβ3 es factible, y esta sonda tiene una estabilidad y bioseguridad deseables y una alta tasa de relajación de T1. La sonda mostró un fuerte efecto de orientación hacia las células con alta expresión de integrina αvβ3, lo que sentó una base sólida para el monitoreo dinámico no invasivo, eficiente y en tiempo real de la metástasis tumoral a nivel anatómico y metabólico molecular a través de imágenes moleculares de resonancia magnética / fluorescencia. in vivo.

Métodos

Síntesis de cRGD-Gd-Cy5.5

A 20 mL de cloroformo, se le agregaron 70 mg de lecitina, 20 mg de colesterol y 210 mg de DSPE-PEG2000-NH, y la mezcla se colocó en un limpiador ultrasónico para disolver completamente las sustancias (como lo indica una solución transparente sin sustancias granulares). Después, la solución se colocó en un matraz con forma de pera para evaporación rotatoria en un baño de agua a 60ºC hasta que se formó una película en forma de panal (sin residuo líquido). Se pesó con precisión tricloruro hexahidrato de Gd (10 mg) y se disolvió en tampón de carbonato a pH 8,5 para obtener una solución transparente, que luego se mezcló con la película en forma de panal anterior para hidratación a 50ºC durante 1 h; este paso fue seguido por la dispersión y el refinamiento a través de una sonda ultrasónica en un procesador de líquidos ultrasónico (VCX 750, Sonics, EE. UU.). Finalmente, la mezcla se recogió y se pasó por un filtro de 0,22 μm y se sometió a ultrafiltración con un tubo de ultrafiltración de 10 kD para eliminar el tricloruro de Gd libre y obtener liposomas que llevaban tricloruro de Gd, que luego se almacenaron a 4 ° C.

A continuación, el péptido cíclico RGD se acopló a la molécula Cy5.5 fluorescente. Se disolvió péptido cíclico RGD (5 mg) en 1 ml de tampón de ácido clorhídrico diluido a pH 5,0 y 1 mg de hidrocloruro de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 0,5 mg de N -hidroxisuccinimida (NHS) y luego se activaron a temperatura ambiente durante 30 min en un oscilador a temperatura constante. La molécula de péptido cíclico de RGD activada se mezcló luego con 100 µg de la molécula fluorescente Cy5.5 y el liposoma, y el pH se midió como 8,4 usando papel de prueba de pH de precisión. Después, la mezcla se incubó a temperatura ambiente en un agitador durante 4 h; este paso fue seguido por la eliminación del péptido cíclico RGD sin reaccionar y la molécula Cy5.5 fluorescente mediante el uso de un tubo de ultrafiltración de 10 kD.

Caracterización de nanopartículas

El tamaño de partícula de las nanopartículas fue determinado por TEM (GEOL Tokio, Japón). Se añadió una pequeña cantidad de complejo liposoma-cRGD-Gd-Cy5.5 a agua ultrapura (pH =6,0) para diluir en una solución de 1 mg / ml. Se colocó una gota de la muestra sobre una rejilla de cobre revestida usando una pipeta de transferencia estéril y se añadió gota a gota fosfotungstato de sodio al 2% después de unos minutos para volver a teñir. Se aspiró una solución de tinción negativa excesiva después de 1-2 min. A continuación, se secó la rejilla de cobre y se colocó bajo un microscopio electrónico de transmisión de 80 kV para su observación. Se seleccionaron al azar aproximadamente de 40 a 50 nanopartículas para observar su morfología y tamaño de partícula, y se guardaron imágenes de escala de 50 nm y 100 nm. El tamaño de las partículas se midió con el software NanoMeasure y el promedio se calculó a partir de tres mediciones repetidas.

Se utilizó un analizador de tamaño de partículas (Malvern, Reino Unido) para medir el tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las nanopartículas. Se diluyó una gota de solución del complejo liposoma-cRGD-Gd-Cy5.5 con agua ultrapura y luego se transfirió a un tubo Eppendorf, que se colocó en un limpiador ultrasónico durante 5 min para dispersar las partículas uniformemente. Las partículas dispersas fueron evaluadas por DLS en el analizador de tamaño de nanopartículas para determinar el tamaño de partícula y el potencial zeta.

Las propiedades ópticas del complejo liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 se caracterizaron utilizando un lector de microplacas multifuncional (BioTek, EE. UU.). Se añadieron dos microlitros de solución de liposoma y liposoma-cRGD-Gd-Cy5.5 a 998 µl de tampón salino tamponado con fosfato (PBS) y se mezclaron bien antes de añadirlo a una cubeta de cuarzo; La absorción ultravioleta a 400-800 nm se obtuvo luego mediante un lector de microplacas multifunción. La solución del complejo liposoma-cRGD-Gd-Cy5.5 (1,5 ml) se transfirió a un tubo Eppendorf y se utilizó la misma cantidad de solución de liposoma vacía como control en blanco. Las imágenes de fluorescencia se llevaron a cabo utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia de animales pequeños.

La modificación de los grupos amino superficiales en los liposomas se confirmó usando espectroscopía FT-IR (Nicolet-5700, EE. UU.). Se obtuvo el espectro de absorción UV-vis (UV 2550, Shimadzu, Japón); Para la medición se utilizó una concentración de 0,1 mg / ml de cRGD-Gd-Cy5.5 liposomal.

Medición de la tasa de relajación

La muestra de sonda de fluorescencia liposómica cargada con Gd modificado con cRGD se diluyó con agua desionizada para obtener las siguientes concentraciones de Gd:0,18, 0,1275, 0,085, 0,0425 y 0,017 mM. Se colocaron cinco mililitros de cada muestra diluida en un vial con tapón de rosca, y luego se fijaron los viales en una gradilla de tubos multifuncional según el orden de concentración. La muestra de sonda fluorescente liposomal cargada con Gd modificado con cRGD se sometió a una exploración por RM a través de las bobinas de la cabeza y el cuello para obtener imágenes ponderadas en T1 para las diferentes concentraciones de la sonda. La secuencia de exploración utilizada para las imágenes ponderadas en T1 fue una secuencia de recuperación de inversión de look-locker modificada (MOLLI), donde los parámetros se establecieron de la siguiente manera:tiempo de repetición (TR) =5,8 ms, tiempo de eco (TE) =3,66 ms, inversión tiempo de recuperación (TI) =16–3200 ms y grosor de escaneo =5 mm. Una vez completado el escaneo, se obtuvo un mapa de pseudo-color. ² de 0,3 cm El área de interés se delineó en la imagen de cada muestra en el mapa y se leyó el valor T1 correspondiente.

Ensayo de citotoxicidad y cultivo celular

Se obtuvieron células de adenocarcinoma de pulmón humano A549, células de carcinoma nasofaríngeo humano SUNE-1-5-8F, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y células epiteliales de mama humana MCF-10A de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) . The cells were cultured in complete 1640 medium (Euroclone-Lonza) containing 10% fetal bovine serum (Euroclone-Lonza), 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, and 2 mM glutamine under 5% CO₂ at 37 °C.

The CCK-8 method was used to examine the cytotoxicity of the molecular probe to different cells, including normal epithelial cells and tumor cells. A549 cells, 5-8F cells, HUVECs, and MCF-10A cells were seeded in a 96-well plate at a density of 5 × 10³ cells/well and cultured overnight. The adherent cells were then incubated with 100 μL of fresh 1640 medium containing cRGD-Gd-Cy5.5 of various Gd concentrations (0, 50, 100, 200, and 400 μM) for 24 h. Subsequently, the cells were washed three times with PBS and then incubated with 100 μL of Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing no fetal bovine serum (FBS). After 10% Cell Counting Kit-8 reagent (Dojindo, Japan) was added to each well, the sample was incubated for 10 h. The absorbance at 450 nm of each well was then measured using an ELISA microplate reader (Multiskan MK3, Thermo Scientific, Logan, UT). Cells treated with PBS only were employed as the control group. For each sample, five parallel wells were analyzed to obtain the mean and standard deviation.

Immunofluorescence Staining and Flow Cytometry Assay of Integrin αvβ3

A total of 20,000 A549, 5-8F, and MCF-10A cells each were seeded in confocal plates (Thermo Scientific) and cultured for approximately 24 h when the cells successfully grew on the slides. The cells were washed three times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (Boster) at room temperature for 30 min, and then washed three times (10 min each) in PBS. The cells were then incubated in 3% bovine serum albumin (PBST) for 30 min to block non-specific antibody binding and washed three times with PBS. The fixed cells were incubated with anti-integrin αvβ3 monoclonal antibody (1:500; Abcam, Cambridge, UK) at 4 °C overnight and then incubated with anti-mouse fluorescent secondary antibody (1:500) (Abcam) for 1 h. 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000; Sigma) was used to stain the nucleus. A laser confocal scanning microscope (Nikon A1, Tokyo, Japan) was used to detect the green fluorescence signal from integrin αvβ3 and the DAPI signal from nuclei.

The integrin αvβ3 expression levels in different cell lines were quantified using flow cytometry. In brief, three types of cells were collected:A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A, which were washed in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA). After being sealed with the PBS containing 5% BSA, the cells were cultivated in VNR-1 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) at density 2 μg/1 × 10⁶ and 4 °C for 30 min. The secondary antibody was DyLight 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (ab96879), diluted 1/500, and at 22 °C for 30 min. Quantitative assays were conducted on a flow cytometer (Gallios, Beckman Coulter, USA) at excitation wavelength 488 nm and emission wavelength 530 nm. Each time, at least 1 × 10⁵ cells (n = 3) were collected.

Binding Assay of the Molecular Probe to Integrin αvβ3

A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A cells were inoculated into confocal plates. The cells were incubated at 37 °C for 1 h with the molecular probe of the same Gd concentration after the cells reached the logarithmic growth phase. The cells were then washed three times in PBS and placed under a laser confocal scanning microscope for observation.

In Vitro MR Imaging and Fluorescence Imaging of Tumor Cells

To verify the tumor cell-targeting ability of the cRGD-modified Gd-loaded liposomal fluorescent probe, the probe was incubated with A549 cells and then examined using MR imaging and a small animal fluorescence imaging system. A549 cells were seeded in six-well plates with 2 mL of 1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin–streptomycin in each well and then incubated at 37 °C and 5% CO₂ . In the experimental groups, cRGD-Gd-Cy5.5 was incubated with A549 cells for 2 h with Gd concentrations of 0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.08 mM. The cells of the control groups were incubated with the non-targeted gadolinium contrast agent (Gd-Cy5.5) for 2 h at the same Gd concentrations as the experimental groups. The cells were then washed with PBS, trypsinized, centrifuged, and finally placed in glass tubes containing 1 mL of PBS (with 0.5% agarose) for MR imaging. Specific imaging parameters were described above. A small animal live imaging system (IVIS Lumina XRMS Series III, MA, USA) was used for fluorescence imaging of the A549 cells.

In Vivo MR and Fluorescence Imaging

To validate whether CRGD-Gd-Cy5.5 had tumor targetability in vivo in animals, we conducted animal experiments following the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, released by the Animals Ethics Committee of Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. We successfully established a Balb/c nude mice nasopharyngeal carcinoma subcutaneous xenografting tumor model for magnetic resonance/fluorescent scanning. A 3.0-T MRI scanner containing 40-mm-diameter mouse volume coils (Discovery 750, GE, Germany) was used for T1-weighted imaging, operated at field of view = 80 × 80 mm, repetition time = 742 ms, echo time = 69 ms, and layer thickness = 2.0 mm. The nude mice were divided into two groups (n = 3), including a test group and a receptor-blocked group. All mice were injected via tail vein with CRGD-Gd-Cy5.5 (0.05 mmol Gd/kg). Each mouse was scanned at four time points:before injection, 30 min, 2 h, and 6 h after injection. In the receptor-blocked group, 1 h before injection with CRGD-Gd-Cy5.5, each mouse was injected via the tail vein with free CRGD polypeptide (10 mg) and was MRI-scanned at the same four time points. The fluorescent images were photographed by a fluorescence imaging system (Bruker, USA). The grouping, drug injection, and scanning time points were all the same as described above. During the imaging, the mice (n = 3) were anesthetized using a gas mixture of oxygen and isoflurane. The nude mice were kept at heart rate 60–120/min and respiratory rate at 20–40/min. Finally, direct visual comparison of tumor images was conducted by two experienced radiologists.

Abreviaturas

DLS:: Dynamic light scattering
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle medium
ECM:: Extracellular matrix
EDC:: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
FBS:: Containing no fetal bovine serum
HUVECs:: Human umbilical vein endothelial cells
MOLLI:: Modified look-locker inversion
MR:: Magnetic resonance
NHS:: N -Hydroxysuccinimide
PEG:: Polyethylene glycol
RGD:: Arginine–glycine–aspartate
TE:: Echo time
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión
TI:: Inversion recovery time
TR:: Repetition time
USPIOs:: Iron oxide particles

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