Efecto del nano-SiO2 en la expresión y metilación aberrante de genes impresos en pulmones y testículos

Antecedentes

El dióxido de silicio es un óxido de silicio con la fórmula química SiO ₂ , que se encuentra más comúnmente en la naturaleza como cuarzo y en varios ambientes orgánicos [1]. Las nanopartículas diseñadas se han generalizado en el rápido crecimiento y la aplicación de la nanotecnología en las industrias de alta tecnología. Esta nanopartícula en particular se usa ampliamente en una variedad de productos de consumo que incluyen productos electrónicos, productos plásticos, médicos, cosméticos y material de recubrimiento debido a sus propiedades científicas físicas, como una gran superficie específica, abundantes sitios reactivos, alta energía superficial, enlaces químicos insaturados, fuerte capacidad de adsorción y fuerte tendencia a interactuar con metales y materia orgánica, alterando así los contaminantes y su transporte en el medio ambiente [2]. La presencia de SiO ₂ Las nanopartículas (NP) en una amplia gama de consumibles aumentan la probabilidad de que se liberen en el medio ambiente y entren en contacto con la población humana.

Estudios experimentales previos han demostrado que una instilación intratraqueal de dosis única o múltiples inyecciones intraperitoneales de una especie de nanopartículas de metal y óxido de metal causan efectos tóxicos desde niveles celulares a niveles sistémicos y orgánicos [3]. Tratamiento de SiO ₂ NPs reprime el crecimiento de líneas celulares de cáncer de mama aumentando la apoptosis y reduciendo la motilidad celular. Además, la exposición a SiO ₂ Las NP alteran significativamente el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [4]. Cuando los modelos de rata se trataron con tres tamaños diferentes de TiO ₂ NP y en comparación con los controles, el tratamiento con líquido de lavado broncoalveolar (BALF) con aerosoles de gran aglomerado (> 100 nm) indujo una respuesta inflamatoria aguda, mientras que los aerosoles de pequeño aglomerado (<100 nm) produjeron un daño significativo por estrés oxidativo y citotoxicidad [5].

El estudio de la toxicidad de las nanopartículas en la reproducción es un campo en crecimiento. Un estudio ha demostrado que con la misma dosis de tratamiento, las NP de Ni indujeron una mayor toxicidad reproductiva en C. elegans que Ni MP (micropartículas). Estas toxicidades reproductivas observadas en C. elegans incluyó la reducción del tamaño de la cría, el huevo fertilizado y la activación de la espermátida [6]. Existe una creciente evidencia de que ciertos efectos ambientales pueden transmitirse a la descendencia a través de vías paternas sin cambios en el genoma del esperma [7, 8]. La información paterna existe no solo en el genoma, sino también en marcadores epigenéticos específicos relacionados, contenido de ARNm y ARN no codificante.

El estrés oxidativo es un mecanismo importante en la toxicidad de las nanopartículas, que puede desencadenar daño en el ADN, inflamación, desnaturalización de proteínas y peroxidación de lípidos [9]. Estos efectos biológicos están influenciados por las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas, incluido su tamaño, área de superficie, forma, química de superficie, funcionalización y solubilidad [10, 11]. Existe una creciente evidencia de que demuestra claramente que la exposición a nanopartículas puede desencadenar alteraciones epigenéticas en tejidos y células incluso a dosis bajas no citotóxicas [12, 13]. La epigenética es el estudio de los cambios hereditarios en la función genética que no implican cambios en la secuencia del ADN, incluida la metilación del ADN, la impronta genética, las modificaciones de histonas y la regulación por ARN no codificantes [14]. Tales alteraciones epigenéticas están asociadas con el desarrollo y progresión de numerosos estados patológicos y enfermedades [15]. Por lo tanto, los efectos epigenéticos son una parte crucial del cribado de evaluación de riesgos del paciente a nivel celular.

El dominio impreso Dlk1 / Dio3 contiene tres regiones metiladas diferencialmente (DMR) conocidas que están metiladas paternamente:DMR intergénico (IG-DMR), 3-DMR expresado en la madre (Gtl2-DMR) y Dlk1-DMR [16]. Estudios anteriores sugieren que IG-DMR dicta el estado de metilación alélica de Gtl2 promotor DMR, que luego controla la expresión génica en todo el grupo [17]. El genoma del ratón tiene una gran cantidad de genes impresos en el dominio Dlk1 / Dio3 en la región distal del cromosoma 12. El IG-DMR ubicado entre el gen impreso Dlk1 y Gtl2 está metilado específicamente en la línea germinal masculina y regula la expresión específica del alelo parental de la región génica impresa [18]. El estado de metilación de IG-DMR se establece antes del nacimiento y, por lo tanto, se mantiene durante toda la vida del macho en la línea germinal masculina durante la diferenciación de las células germinales masculinas, lo que significa que la metilación de IG-DMR se mantiene en las espermatogonias y los espermatocitos de los testículos maduros.

Nuestro objetivo fue encontrar los cambios en la expresión génica de la línea germinal masculina durante la espermatogénesis antes del silenciamiento transcripcional y traduccional para explicar la influencia paterna en la descendencia a través de los cambios ambientales. Los factores ambientales pueden modificar las modificaciones de la transcripción de los espermatozoides, lo que puede conducir a alteraciones en el desarrollo de la progenie. Para llevar a cabo esta investigación en nuestro trabajo, utilizamos líneas celulares y ratones como modelos para el cribado de los efectos tóxicos del SiO ₂ NP. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra los mecanismos epigenéticos de las regiones impresas Dlk1 / Dio3 en las que las nanopartículas causan daño tanto en el tejido pulmonar como en el testicular.

Métodos

Animal experimental

El manejo de los animales se realizó de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio bajo el correspondiente protocolo de uso de animales en la Universidad Médica de Nanjing. Los ratones se obtuvieron de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Todos los animales se alojaron a 23ºC con un ciclo de luz de 12 h. Los ratones consumieron agua esterilizada y comida para roedores a voluntad. La actividad y el comportamiento de los ratones se controlaron diariamente. Después de 2 semanas, a los ratones se les inyectó SiO ₂ de tamaño nanométrico 12,5 mg / kg.

Productos químicos

SiO ₂ de tamaño nanométrico (99,5% de trazas metálicas, tamaño de partícula de 10 a 20 nm) se obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). Las nanopartículas se suspendieron en medio RPMI 1640 para crear una solución madre, se dispersaron mediante vibración ultrasónica durante 20 min, se diluyeron a concentraciones apropiadas y se dispersaron durante otros 20 min.

Características de SiO ₂ NP

El tamaño y el potencial zeta se registraron utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZSP.

Extracción de ARN y qRT-PCR

Las muestras de pulmón y testículo se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a 80 ° C después de aproximadamente 4 h. Descongelamos las muestras antes de extraerlas.

El ARN total se aisló de las muestras utilizando 1 ml de reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies Co, EE. UU.). La mezcla se sometió a ultrasonidos a 80% de potencia durante 5 min, se le añadieron 0,2 ml de cloroformo y luego se centrifugó a 12.000 g / min a 4 ° C durante 15 min. Luego, se agregaron tres pasos de purificación de fenol / cloroformo para eliminar las proteínas. Luego, usamos la absorbancia UV para medir el contenido de ARN y la calidad de cada muestra a 260 y 280 nm. Las secuencias de cebadores de ARNm se muestran en el archivo adicional 1:Tabla S1 y S2. La qRT-PCR se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante, como se describió anteriormente [19]. La PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando SYBR Green (Vazyme). El ciclo de PCR fue el siguiente:desnaturalización inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación a 60 ° C durante 15 sy extensión a 72 ° C durante 30 s. La cantidad de genes diana se analizó mediante el método 2 ^ -ΔCt después de la normalización con β-actina.

PCR de extracción de ADN, tratamiento con bisulfito y secuenciación de bisulfito

Se aisló ADN de tejidos testiculares y pulmonares utilizando un kit de ADN (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; EE. UU.) Siguiendo las recomendaciones del fabricante. La conversión de bisulfito de 500 ng de todo el ADN genómico se logró utilizando un kit (kit EpiTect® Bisulfite; Qiagen. No. 59104; EE. UU.) Siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se diseñaron diferentes oligonucleótidos de metilación de CpG usando el software Methyl Primer Express v1.0 y las secuencias son P1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3 ', P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'; P2-F 5'-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3 ', P2-R 5'-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3'; P3-F 5'- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3 ', P3-R 5'-ACCCATAACAAACCACAACA-3'; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3 ′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3 ′.

Cada muestra de ADN se amplificó mediante PCR de la siguiente manera:2,5 μl de tampón de PCR 10 × mezcla de reacción de PCR con 500 ng de ADN tratado con bisulfito, 0,5 μl de cebadores directo e inverso, 0,5 μl de mezcla de dNTP, 0,5 μl de rTaq (500 U, dNTP , Mg ²⁺ ) (Takara Bio, Tokio, Japón), adición de ddH ₂ O hasta un volumen de 25 μl. Después de la activación de la polimerasa a 94 ° C durante 10 min, le siguieron 40 ciclos de la siguiente secuencia:30 sa 94 ° C, 30 sa 58 ° C, 1 min a 72 ° C y extensión final a 72 ° C durante 10 min.

Tratamiento y cultivo celular

Las células A549 se compraron en ATCC (Manassas, VA, EE. UU.) Y se cultivaron en 1640 complementadas con suero bovino fetal (FBS) al 10% a 37 ° C y CO ₂ al 5% en una incubadora humidificada. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos, se incubaron con diferentes concentraciones de SiO ₂ NP:62,5, 125, 250, 500, 1000 y 2000 μg / ml durante 24 h.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de proliferación CCK8. Las células se sembraron en placas a una densidad de 1,5 x 10 ⁴ por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó durante la noche. Después de la exposición a SiO ₂ Se agregaron NP a diferentes concentraciones, 100 μl de CCK8 a cada pocillo y las células se incubaron durante 30 min a 37 ° C para permitir el metabolismo de CCK8. Por último, se determinó la absorbancia a 450 nm. Las tasas de inhibición celular se calcularon y se transformaron en el IC ₅₀ utilizando SPSS 15.0.

Análisis estadístico

Todos los cálculos se realizaron con el software SPSS 15.0. Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando t no relacionados pruebas y una prueba de chi-cuadrado de Pearson para BSP. Los datos se presentan como la media ± DE. En todos los casos, un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización de SiO ₂ NP

Caracterizamos SiO ₂ NP en condiciones experimentales. El radio hidrodinámico promedio y el potencial zeta de SiO ₂ Los NP en el medio de cultivo fueron 371,77 ± 18,46 nm y 18,83 ± 2,12 mV, respectivamente (Fig. 1).

Caracterización de SiO ₂ NP en suspensión. Las partículas se suspendieron en medio de cultivo celular con FBS al 10%. a, b Tamaño y potencial zeta de SiO ₂ Los NP fueron evaluados por Zetasizer Nano ZSP. c La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo CCK8 después de la exposición a diversas concentraciones de SiO ₂ NP durante 24 h. Promedios ± DE de experimentos duplicados, cada uno de los cuales consta de tres réplicas técnicas. *** p <0,001

Efecto del SiO ₂ NP en la línea celular A549

Para determinar la toxicidad del SiO ₂ NPs, realizamos una prueba de proliferación con células A549, para determinar el IC ₅₀ de SiO ₂ NP en células A549. Como se ilustra en la Fig. 1c, SiO ₂ Los NP disminuyen la viabilidad de las células A549 de una manera dependiente de la concentración. La reducción de la viabilidad celular es significativa en SiO ₂ Concentración de NP superior a 62,5 μg / ml ( p <0,001). El IC ₅₀ 24 h de una sustancia química se define como una concentración que afecta al 50% de la célula después de 24 h de exposición. El IC ₅₀ 24 h determinadas para SiO ₂ NP fue 4942 μg / ml.

Efectos del SiO ₂ NP en testículos y pulmones murinos

Determinamos si la exposición a SiO ₂ Las NP a una dosis de 12,5 mg / kg de peso corporal provocarían daño en la membrana pulmonar e incluso daño en los testículos en nuestro modelo de ratón. Como se muestra en las figuras, SiO ₂ La exposición a NP condujo a un cuerpo laminar roto en secciones histológicas del pulmón (Fig. 2a, b) y un daño en las crestas mitocondriales en comparación con el grupo de control en los testículos (Fig. 2c, d). Luego investigamos los efectos en los pulmones y los testículos del SiO ₂ NP sobre la activación de la impresión en la región impresa Dlk1 / Dio3.

Imágenes TEM de tejidos pulmonares y testiculares de ratas expuestas a SiO ₂ NP. un La morfología se evaluó en los tejidos pulmonares mediante SEM en los controles. b La morfología se evaluó en los tejidos pulmonares mediante SEM en el grupo tratado. c La morfología se evaluó en los tejidos de los testículos mediante SEM en los controles. d La morfología se evaluó en los tejidos de los testículos mediante SEM en el grupo tratado. Las barras de escala representan 2,0 μm

Expresión de los genes impresos en el pulmón y el testículo murinos

Para ilustrar los cambios en los pulmones y los testículos, detectamos los genes impresos en estos tejidos. Elegimos los 24 genes impresos; eran Dio3 , Ddc , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , H19 , Igf2, Igf2as , Igf2r , Inpp5f , Magel2 , Magi2 , Mest , Mir296 , Mir298 , Ndn , Nnat , Peg10 , Plagl1 , Pwcr1 , Rasgrf1 , Rtl1 , Snrpn y Snurf. Trece de estos genes se expresan tanto en los pulmones como en los testículos: Dio3 , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , Igf2r , Igf2 , Inpp5f , Peg10, Ndn , Nnat , Rasgrf1 , Rtl1 y Snrpn (Figura 3a, b). Los genes de enfoque primario expresados ​​diferencialmente estaban en la región impresa Dlk1 / Dio3, que contiene Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 y Dio3 .

Expresión de genes impresos en pulmones y testículos. un La expresión de genes impresos en el pulmón. b La expresión de genes impresos en testículos. * P <0,05. ** P <0,01. t del estudiante prueba

Expresión de la región impresa Dlk1 / Dio3

La región Dlk1 / Dio3 impresa contiene tres genes que codifican proteínas ( Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 y Dio3 ) sobre el alelo heredado [20] (Fig. 4c). Para dilucidar el papel de la región Dlk1 / Dio3 en la respuesta del tejido pulmonar y testicular al SiO ₂ Tratamiento NP, analizamos el patrón de metilación de DMR en comparación con los controles. La metilación en los pulmones y los testículos ataca a diferentes genes. La expresión del Dlk1 y Dio3 se regularon positivamente tanto en los pulmones como en los testículos, mientras que Rtl1 fue regulada al alza solo en los testículos (Fig. 4a, b).

La expresión de la región impresa Dlk1 / Dio3. un Los genes de la región Dlk1 / Dio3 expresados ​​en el pulmón. b Los genes de la región Dlk1 / Dio3 expresados ​​en el testículo. c Esquema de la región Dlk1 / Dio3. * P <0,05. ** P <0,01. t del estudiante prueba

La metilación de las regiones DMR Dlk1 / Dio3

Para investigar más a fondo si la expresión de los genes cambia en respuesta a la metilación del ADN, abordamos el estado de metilación de esta región en el pulmón y los testículos del ratón. En el análisis de metilación del ADN, determinamos las secuencias de las tres secciones de islas CpG. En los testículos, están hipometilados; sin embargo, en la isla CpG 1, están significativamente hipermetilados (Fig. 5). En el pulmón, toda la metilación es la misma que en los testículos, mientras que la isla CpG 2 mostró hipermetilación (Fig. 6).

La metilación de las regiones DMR Dlk1 / Dio3 en testículos. un La metilación de la isla 1 de CpG en los tejidos de control y tratados. b La metilación de la isla 2 de CpG en los tejidos de control y tratados. c La metilación de la isla 3 de CpG en los tejidos de control y tratados

La metilación de las regiones DMR Dlk1 / Dio3 en el pulmón. un La metilación de la isla 1 de CpG en los tejidos de control y tratados. b La metilación de la isla 2 de CpG en los tejidos de control y tratados. c La metilación de la isla 3 de CpG en los tejidos de control y tratados

Discusión

El uso cada vez mayor de nanomateriales ha suscitado preocupaciones sobre los posibles impactos en la salud humana y los impactos ambientales. Estudios anteriores han demostrado que SiO ₂ Los NP pueden causar daño pulmonar y cardiovascular, como inflamación pulmonar y daño isquémico del miocardio en ratas viejas [21]. Además, las nanopartículas pueden tener un efecto sobre las líneas germinales, ya que tales células parecían ser más sensibles a los efectos tóxicos de los NP de Ag y demostraron efectos adversos después de la exposición a dosis más bajas. La exposición a Ag NP aumentó el número de anomalías observadas en las células espermáticas de rata y redujo la integridad tanto del acrosoma como de la membrana plasmática, además de reducir la actividad mitocondrial [22]. Nuestra investigación es parte de una serie de estudios que utilizan una plataforma experimental para evaluar el potencial de las nanopartículas para atacar organismos masculinos e incluso su descendencia no expuesta.

En nuestro estudio in vitro anterior, informamos que la exposición a corto plazo a algunas nanopartículas da como resultado la apoptosis celular y la expresión aberrante de genes impresos en células TM-4 Sertoli. Estos hallazgos demuestran que la expresión anormal de genes impresos puede ser un mecanismo subyacente de las nanopartículas para inducir toxicidad en la reproducción [23]. Además, en nuestro estudio in vivo anterior, algunos factores ambientales, como los disruptores endocrinos, también promueven un fenotipo o estado de enfermedad no solo en el individuo expuesto sino también en generaciones sucesivas de progenie. Las epimutaciones en la línea germinal que se programan permanentemente pueden permitir la transmisión de fenotipos transgeneracionales epigenéticos [19]. El objetivo de este estudio fue investigar los cambios realizados en el estado epigenético por SiO ₂ Tratamiento NP en un modelo murino para sentar las bases mecanicistas de los efectos transgeneracionales masculinos.

El estado epigenético es un término utilizado para definir las modificaciones químicas que ocurren dentro de un genoma sin cambiar la secuencia del ADN [24]. Los mecanismos epigenéticos, incluida la metilación del ADN, genes impresos, modificaciones de histonas y expresión de ARN no codificante, pueden afectar la función genómica en un entorno exógeno [25]. Hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primero en investigar SiO ₂ NP que inducen toxicidad pulmonar y testicular a nivel epigenético.

Primero examinamos la toxicidad aguda del SiO ₂ NP en células A549, una línea de células epiteliales de pulmón humano. Sin embargo, nuestros hallazgos en ratones experimentales revelaron una lesión en las células epiteliales de pulmón laminar tipo II y una lesión de la cresta mitocondrial testicular después del contacto con SiO ₂ NP en concentraciones ambientales [26]. Para comprender mejor el mecanismo de la patología de los pulmones y los testículos, expresamos genes impresos. La impronta genómica se refiere al silenciamiento de un alelo parental en cigotos de gametos dependiendo del padre de origen; este silenciamiento se produce a través de procesos epigenéticos como la metilación del ADN y / o la modificación de histonas [27]. Estudios anteriores han demostrado que la expresión génica impresa en el dominio Dlk1 / Dio3 es importante para el crecimiento fetal [28], el momento de la pubertad humana [29] y la susceptibilidad a enfermedades metabólicas [30]. Los estudios han sugerido que el IG-DMR dicta el estado de metilación alélica del promotor DMR de Gtl2, que luego controla la expresión génica en toda la región Dlk1 / Dio3 [17]. La función principal de esta región de control impresa es heredar la metilación del ADN impulsada por las células germinales como una señal gamética y, más tarde, mantener los patrones de metilación del ADN específicos del alelo en las células somáticas [31]. Nuestro estudio demostró que SiO ₂ Las NP inducen cambios en la expresión de la región Dlk1 / Dio3 tanto en los tejidos del pulmón como en los testículos. En la región Dlk1 / Dio3, los genes expresados ​​paternos ( Dlk1 , Rtl1 y Dio3 ) son particularmente anormales en comparación con los controles después del tratamiento con NP. Los resultados de la secuenciación de bisulfito muestran diferentes niveles de hipometilación en el pulmón y los testículos. El estado de metilación de IG-DMR es generalmente más bajo en los tejidos tratados, y esta hipometilación puede representar el mecanismo de expresión diferencial de genes impresos.

Conclusiones

En conclusión, nuestros resultados indican que SiO ₂ La exposición a NP puede inducir cambios importantes en la metilación del ADN que desencadenan daño celular y que estos cambios son muy importantes para la expresión del grupo de genes impresos Dlk1 / Dio3. Es importante destacar que los cambios en la metilación del ADN afectan tanto a los tejidos de los pulmones como de los testículos. Estos resultados juegan un papel importante en nuestra investigación futura que examina los efectos epigenómicos de las nanopartículas heredadas por la descendencia de modelos expuestos y la clarificación de los mecanismos moleculares que median tales alteraciones epigenéticas.

Abreviaturas

BALF:

Líquidos de lavado broncoalveolar

CCK-8:

Kit de conteo de células 8

DMR:

Regiones diferencialmente metiladas

EGFR:

Receptor del factor de crecimiento epidérmico

IG-DMR:

DMR intergénico

MP:

Micropartículas

NP:

Nanopartículas

InAs / GaAs Láser de retroalimentación distribuida de modo dual de punto cuántico hacia un amplio rango de sintonización Aplicación de terahercios de onda continua Propiedades de transporte de portadora del sensor de gas asimétrico MoS2 bajo carga Modulación de barrera basada en transferencia